Summary
Koraller skaper biomangfoldige økosystemer som er viktige for både mennesker og marine organismer. Men vi forstår fortsatt ikke det fulle potensialet og funksjonen til mange korallceller. Her presenterer vi en protokoll utviklet for isolasjon, merking og separasjon av steinete korallcellepopulasjoner.
Abstract
Korallrev er truet på grunn av antropogene stressfaktorer. Den biologiske responsen av koraller på disse stressorer kan oppstå på cellenivå, men mekanismene er ikke godt forstått. For å undersøke korallrespons på stressfaktorer trenger vi verktøy for å analysere cellulære responser. Spesielt trenger vi verktøy som letter anvendelsen av funksjonelle analyser for å bedre forstå hvordan cellepopulasjoner reagerer på stress. I den nåværende studien bruker vi fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å isolere og skille forskjellige cellepopulasjoner i steinete koraller. Denne protokollen inkluderer: (1) separasjon av korallvev fra skjelettet, (2) opprettelse av en enkelt celle suspensjon, (3) merking av korallceller ved hjelp av ulike markører for strømning cytometri, og (4) gating og celle sortering strategier. Denne metoden vil gjøre det mulig for forskere å arbeide med koraller på cellenivå for analyse, funksjonelle analyser og genuttrykksstudier av forskjellige cellepopulasjoner.
Introduction
Korallrev er et av de viktigste økosystemene på jorden. De legger til rette for biologisk mangfold ved å tilby kritiske habitater for fisk og virvelløse dyr, og er avgjørende for å opprettholde menneskeskapte samfunn ved å gi mat og økonomisk levebrød gjennom turisme1. Som den viktigste byggeren av korallrev, koralldyret (Phylum: Cnidaria) også hjelpemidler kystsamfunn ved å skape store kalsiumkarbonatrammer som reduserer bølge og stormskader2.
Koraller som voksne er sessile dyr som er vert for et bredt spekter av endosymbiotiske partnere, inkludert virus, arkaea, bakterier, protists, sopp, og spesielt, medlemmer av algal dinoflagellate familien Symbiodiniaceae3. Endringer i miljøet kan forårsake ubalanser i dette samfunnet, ofte fører til sykdomsutbrudd og korallbleking der symbiotiske Symbiodiniaceae blir utvist fra korallkolonien, og dermed eliminerer den viktigste kilden til ernæring for korallene. Begge disse scenariene forårsaker ofte død av korallverten4,5,6. Effekter av antropogene-induserte stressorer, som raske klimaendringer, akselererer masse koralldød hendelser, noe som fører til en global nedgang av korallrev7.
Nylig har mange forskjellige metoder blitt utviklet for å bidra til å redusere korallrevtap. Disse metodene inkludererutplanting av koraller på eksisterende rev, genetisk kryssing ved hjelp av termisk tolerante genotyper, og cellulær manipulering av mikrobielle og symbiotiske samfunn som ligger i korallene8,9. Til tross for dette arbeidet, mye er fortsatt ukjent om korallcelle mangfold og cellefunksjon10,11,12,13. En grundig forståelse av korallcelletype mangfold og cellefunksjon er nødvendig for å forstå hvordan korallorganismen oppfører seg under normative og stressende forhold. Arbeidet med å maksimere restaurerings- og bevaringseffektiviteten vil dra nytte av en forbedret forståelse av hvordan cellemangfold og genfunksjon er koblet sammen.
Tidligere arbeid med cellemangfold og funksjon har primært fokusert på histologiske studier og helvev RNA prøvetaking14,15,16,17. For å få større detaljer om spesifikk celletypefunksjon i koraller, må det være metoder for isolering av spesifikke populasjoner av levende korallceller. Dette har blitt gjort med hell i ikke-klassiske modellorganismer ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) flow cytometriteknologi18. FACS benytter en kombinasjon av lasere innstilt til varierende bølgelengder for å måle forskjellige endogene cellulære egenskaper på enkeltcellenivå som relativ cellestørrelse, cellegranularitet og autofluorescens. I tillegg kan cellene være merket av fluorescerende merkede forbindelser for å måle spesifikke, ønskede egenskaper18,19.
Så langt har anvendelsen av strømningscytometri til korallceller hovedsakelig vært for analyse av symbiotiske Symbiodiniaceae og andre bakterielle populasjoner ved å utnytte deres sterke, naturlige autofluorescens20,21,22. FACS har også blitt brukt til å estimere korallgenomstørrelse ved hjelp av fluorescerende DNA-markørsignal sammenlignet med referansemodell organismeceller23,24. Effektiv bruk av FACS gir tre forskjellige verktøy som er nyttige for cellebiologistudier: 1) morfologisk og funksjonell beskrivelse av enkeltceller; 2) identifisering, separasjon og isolering av spesifikke cellepopulasjoner for nedstrøms studier; og 3) analysen av funksjonelle analyser på enkeltcellenivå.
Utvikling og anvendelse av ulike eksogene fluorescerende markører for studiet av korallceller forblir nesten uutforsket. Slike markører kan inkludere merkede proteiner, merkede substrater for enzymer, eller fluorescerende responser til andre forbindelser. Disse markørene kan brukes til å identifisere celletyper som har unike egenskaper, for eksempel utheving av celler som produserer varierende mengder av en bestemt mobilromsfunksjon, for eksempel lysosomer. Et annet eksempel er bruken av fluorescerende merkede perler for å funksjonelt identifisere celler som er kompetente for fagocytose, eller oppslukning av et målrettet patogen25. Populasjoner av celler som er aktive i immunitetsresponser, kan lett identifiseres av FACS etter oppslukning av disse eksogene påførede perlene. Mens tradisjonelle histologiske metoder krever bevart vev og mange timer for å tilnærme seg prosentandelen av celler som er positive for perleoppslukelse, kan en FACS-basert funksjonell analyse for patogenoppslukning utføres relativt raskt på isolerte levende celler. I tillegg til å studere cellespesifikke reaksjoner på stress, har denne teknologien potensial til å klargjøre genspesifikke uttrykk og belyse den evolusjonære og utviklingsmessige historien til celletyper som er helt unike for cnidarianere, som calicoblasts og cnidocytes.
Nylig utførte vi en intensiv screening av over 30 cellulære markører som resulterte i å identifisere 24 som er i stand til å merke korallceller, hvorav 16 er nyttige for å skille unikepopulasjoner 18, noe som gjør dem klynger av differensiering (CD). Her beskriver vi prosessen med korallcelleisolasjon i Pocillopora damicornis fra å fjerne celler fra kalsiumkarbonatskjelettet til identifisering og isolering av spesifikke cellepopulasjoner med FACS (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissosiasjon av vev fra korallskjelettet via airbrush og kompressor
MERK: Utfør trinn på is og beskytt hendene med hansker.
- Monter airbrushsettet ved å koble til luftkompressoren, slangen og luftbørsten (figur 2). Still inn trykkmåleren mellom 276−483 kPa.
MERK: Den anbefalte kompressoren og luftslangen som ble brukt til denne studien, ble forhåndsinnstilt til et maksimalt trykk på 393 kPa. Bruk utenfor denne 276-483 kPa-serien kan føre til utilstrekkelig fjerning av celler fra skjelettet eller brudd på cellemembranene. Dette området kan variere for hver art og kan kreve en levedyktighetstest. En levedyktighetstest kan utføres med en undergruppe av celleslammed et enkelt hemocytometer og en 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fargestoff ekskluderingsanalyse, visualisert på et sammensatt mikroskop. - Forbered 100 ml cellefargingsmedier i en autoklavert, steril glassbeholder ved å tilsette 33 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS; uten kalsium og magnesium) til en endelig konsentrasjon på 3,3x, 2 ml fosterkalvserum (FCS; varmeaktivert ved 56 °C i 30 min) til 2 % av det totale volumet, og 2 ml 1 M HEPES-buffer til en endelig konsentrasjon på 20 mM. Deretter topp av på 100 ml med sterilt vann.
MERK: 3,3x PBS-konsentrasjonen ble valgt for å etterligne saltinnholdet i sjøvann, som demonstrert i Rosental et al.18. Denne konsentrasjonen må justeres for arter som finnes i andre miljøer for å etterligne deres saltholdighet. - Overfør 10 ml cellefargingsmedier til en airbrushflaske (merket "F" i figur 2) og fest adapterlokket til airbrushkontakten.
MERK: Større fragmenter og arter med tykkere vevslag kan kreve mer media for tilstrekkelig fjerning av vev. - For forgrening korallarter demonstrert her, bruk en bein kutter å klippe eller kutte en korall fragment ca 3-5 cm i lengde eller 4 cm2 i området.
MERK: Fragmentet må være klart for makroalger og andre flercellede organismer fordi disse ikke kan fjernes fra prøven nedstrøms og vil forurense prøven under FACS-analyse- og sorteringsprosessene. Et 1 cm fragment av P. damicornis gir ca. 2−10 x 106 celler etter filtrering, farging og vasking. - Plasser korallfragmentet inne i en plastoppsamlingspose og bruk airbrushen til å sprøyte cellefargingsmediet på korallene (figur 2). Fortsett denne prosessen til det meste av skjelettet er utsatt. Fjern det gjenværende skjelettet fra oppsamlingsposen.
2. Dissosiasjon av celler fra korallvev
MERK: Utfør alle trinnene på isen og beskytt hendene med hansker.
- Filtrer celleslampen gjennom en 40 μm nyloncellesil i et 50 ml sentrifugerør for å oppnå en enkelt cellesuspensjon.
MERK: Ulike cellesilnettstørrelser kan være mer passende for ulike arter. Imidlertid kan større størrelser føre til utilstrekkelig vevdissosiasjon på grunn av passering av rusk og celleklumper.- For prøver med tykkere slimlag, bruk den steriliserte stempelet på en 1 ml plastsprøyte og slip den forsiktig mot filteret for å bryte opp klumper og hjelpe cellene med å passere gjennom silen. Skyll silen og stempelet med cellefargingsmedier inn i sentrifugerøret.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 4 °C ved 450 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend cellene i 1 ml cellefargingsmedier.
3. Celle farging
MERK: Utfør alle trinnene på isen og beskytt hendene med hansker. Flekker som er omtalt i denne protokollen er for representasjon formål. Alternative flekker vil kreve forskjellige konsentrasjoner og inkubasjonstider.
- Overfør 500 μL resuspended celler til en 5 ml rund bunn rør og sett til side som en kontrollprøve. Ikke tilsett flekk til denne aliquot.
- Til gjenværende celle suspensjon, tilsett 0,42 μL av 12 mM DAPI levedyktighet fargestoff (Tabell over materialer), 1 μL av 5 μM reaktive oksygenarter (ROS) flekk ( Tabell overmaterialer), og 0,1 μL av 0,2 μM lysosom flekk ( Tabellover materialer). Pipette godt å blande og inkubere på is i 30 min i mørket for å hindre fotobleking.
MERK: DAPI brukes i dette eksemplet til å fungere som dna-fargestoff og levedyktighetsfargestoff for differensialspising av døde celler på FACS-maskinen. Dette forutsetter at DAPI trenger inn i døende celler på grunn av membranintegritet. ROS-flekken avgir lys i 520 nm-området (grønn), mens lysosomal markøren avgir lys på ca. 668 nm (rød). - Pellet 500 μL av de fargede cellene ved sentrifugering ved 4 °C ved 450 x g i 5 min. Fjern den supernatant og resuspend pellet i 500 μL celle fargingsmedier. Overfør til en ny 5 ml rundbunnsrør og oppbevar på is.
4. OPPSTART AV FACS
MERK: Trinnene kan variere i henhold til cytometerets merke og modell på grunn av forskjeller i lasere og kanaler. For denne protokollen ble det brukt et cytometer med 405, 488, 535 og 640 nm bølgelengdelasere. Filtre som er omtalt i denne protokollen, er for representasjonsformål. Alternative celleflekker kan kreve et annet sett med filtre og lasere.
- Begynn å opprette en ny prosjektmal på sorteringsprogramvaren og velg laserpanelet. For den representerte kombinasjonen av flekker og naturlig fluorescens, velg alle fire lasere (405, 488, 535 og 640 nm).
- Velg de riktige filtrene for hver forventet farge som representeres i eksperimentet.
- For å oppdage DAPI-utslippet og hjelpen i separasjonen av levende og døde celler, bruk et filter med et båndpass (BP) på 450/50 (425-475 nm-område) for eksempel et DAPI-, Hoeschst- eller Pacific Blue-filter.
- For påvisning av lys som sendes ut av det grønne ROS-signalet, bruk et filter med en BP på 530/30 (bølgelengdeområde på 515-545 nm) for eksempel et fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller grønt fluorescerende protein (GFP)-filter. Dette filteret vil måle konsentrasjonen av ROS i hver celle.
- Legg til et ekstra filter med et BP på 670/30 (655–685 nm-område), for eksempel et allophycocyanin (APC)-filter for påvisning av lysosomalt flekkutslipp.
MERK: APC-kanalen tillater måling av fagocytisk aktivitet. Denne kanalen vil også oppdage autofluorescens generert av korallsympbiotiske alger fra familien Symbiodiniaceae. Dette signalet kan imidlertid skilles ved hjelp av en ekstra kanal som har lengre bølgelengde enn APC-filteret. - Inkluder et filter som har en BP på 780/60 (750-810 nm-rekkevidde), for eksempel det mest brukte fykoerytrinet, cyaninefilteret (APC-Cy7), som oppdager utslipp av langt rødt autofluorescens fra Symbiodiniaceae og hjelpemidler i isolasjon av aposymbiotiske celler.
5. FACS gating oppsett
MERK: Trinnene kan variere i henhold til merke og modell av cytometeret og oppkjøpsprogrammet kombinert med cytometeret.
- På prosjektet eksperimentell skjerm av cytometri programvare, opprette en scatter plot og velg fremover scatter (FCS) som beregning for X-aksen og side scatter (SSC) for Y-aksen.
MERK: FCS korrelerer med størrelsen på cellen og SSC korrelerer med detaljnivå. Dette vil tillate fjerning av de fleste rusk, som de fleste vil være mindre i størrelse enn intakte celler. - Sett aksene til enten logaritmiske eller biexponential skalaer, da cellestørrelser og detaljnivå kan variere etter flere størrelsesordener (figur 3A), spesielt i koraller.
6. FACS analyse og celleisolasjon
MERK: Trinnene kan variere i henhold til innsamlings- og innsamlingsprogrammets merke og modell.
- Plasser kontrollen (dvs. det ikke-oppnådde celleundersettet) i prøvekammeret på cytometeret og start leseprosessen. Når datamaskinen begynner å motta data fra hver celle, eller hendelse, begynner prikker å vises på scatter-plottet. For å fjerne rusk igjen i cytometerkamrene fra tidligere eksperimenter, la ca 30 s passere før du starter analysen.
- I scatter-plottet justerer du fotomultiplierrøret (PMT) for å sentrere punktene.
MERK: PMT-spenningen brukes til å forsterke signalstyrken til fotoner som måles; Hvis PMT-spenningen er for svak, vil færre celler bli lest, og hvis PMT-spenningen er for sterk, vil cellene bli målt nær maksimal verdi og forskjellige celletyper vil være uutslettelige fra hverandre. En tilstrekkelig PMT-spenning sikrer at uavhengig skillebare hendelser vil fylle scatter-plottet. Hendelsesseparasjon er enklere å visualisere ved å projisere logaritmiske eller biexponential skalaer på FSC og SSC scatter-tomter. - Begynn å registrere hendelsene. Hvis du vil spare eksemplet, setter du datainnhentingen på pause etter at omtrent 15 000 hendelser er lest. I de fleste tilfeller vil dette være tilstrekkelig til å visualisere de generelle cellepopulasjonsmønstrene. Registrer flere hendelser hvis du analyserer og isolerer små, spesialiserte cellepopulasjoner.
- På den første grafen av FSC og SSC oppretter du et utvalg eller en port, av cellene rundt 102-merket og høyere på FSC X-aksen. Alt under denne terskelen er sannsynligvis cellulær rusk. Tegn rektangulære porter, som er et vanlig alternativ på flow cytometri programmer og bra for klare, distinkte cellepopulasjoner. For cellepopulasjoner som tar en mer uregelmessig form på scatter-plottene, bruk et polygonal gatingalternativ.
MERK: En minimum avskjæring på 102 på den fremre scatter bør velge for de minste korallceller, men kan tillate forurensning av rusk. For å endre dette, øke den nedre grensen for gating å være mer konservativ. - Opprett en ny scatter-plott som uttrykker DAPI-filteret på X-aksen og APC-Cy7-filteret på Y-aksen. Hvis du vil gjøre dette, velger du porten for intakte celler som er opprettet i trinn 6.4, høyreklikker og velger alternativet for å opprette en ny punktplott. Juster aksene til enten logaritmiske eller biexponential skalaer.
MERK: Trinnene som trengs for å opprette et nytt plott, kan variere med ulike programmer. - Fjern nå kontrollprøven fra cytometerkammeret og erstatt med de fargede cellene. La 30 s passere før du starter analysen og registrerer dataene. Registrer omtrent 15 000 celler før du setter den på pause.
MERK: Den distinkte populasjonen(e) på den høyere enden av APC-Cy7-skalaen er de med høy rød autofluorescens fra Symbiodiniaceae. Ingen flekk er nødvendig for å visualisere disse befolkningspausene, og de kan også ses på kontrollprøveopptaket (figur 3C). Velg for koraller populasjoner, de lavere på Y-aksen, for ytterligere differensiering. - Opprett en ny scatter-plott av aposymbiotiske celler for å visualisere ROS-konsentrasjonene (FITC-filteret) og cellene som er positive til lysosomer (APC-filter), igjen ved hjelp av logaritmiske eller biexponential skalaer.
MERK: Hvis det er flere forskjellige cellepopulasjoner som er aposymbiotiske, kan hver enkelt skilles ytterligere i sin egen scatter plot (Figur 3C, D). - Sammenlign den fargede prøvegruppen mot kontrollen, ikke-oppnådd delsett ved enten å bruke det første opptaket av kontrollprøven eller sette kontrollgruppen på nytt og kjøre kontrollgruppen på nytt. Gate hendelsene som er unike for farget prøvegruppe.
7. FACS sortering og samling
MERK: Trinnene kan variere i henhold til merke og modell av cytometeret og oppkjøpsprogrammet kombinert med cytometeret.
- Med et utvalg av celler valgt å samle, plasser mikrocentrifugerør (som inneholder 250-500 μL cellekulturmedier eller lysisbuffer basert på antall celler samlet inn og lagringsmetode) i cytometersamlingskammeret.
MERK: Det representerte strømningscytometeret er i stand til å sortere fire forskjellige populasjoner om gangen, og maskinen kan konfigureres til å inneholde en rekke samlingsenheter, inkludert ulike sentrifugerør og 96 brønnplater. - Når cytometeret begynner å lese prøven og en passende mengde tid har gått for å skylle ut rusk, begynne å sortere de ønskede populasjonene og samle alt fra 20.000 celler til flere millioner.
- For mer enn 500 000 celler justerer du volumet av cellekulturmedier eller lysisbuffer og volumet på oppsamlingsenheten.
- For in vitro-studier oppbevarer du celler på is til de er plassert i et inkubator eller sterilisert miljø.
- For molekylære studier, enten start DNA/ RNA / protein isolasjonsprosessen eller blitsfrys og lagre ved -80 ° C til ekstraksjon.
- Hver gang en ny flekk, arter eller sorter brukes, utfører du en renhetskontroll på populasjonen av interesse ved å sortere minst 20.000 celler av interesse i 500 μL fargematerialer, og deretter analysere de sorterte cellene på nytt og bekrefte at cellene blir lest i porten som brukes til å sortere (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samlet sett er denne protokollen nyttig fordi den forenkler identifisering og innsamling av levende korallcellepopulasjoner som kan brukes til funksjonelle analyser. Arbeidsflyten startet med mekanisk separasjon av korallvev fra det underliggende kalsiumkarbonatskjelettet (figur 1). Dette er en av de viktigste første trinnene fordi feil teknikk resulterer i høy celledødelighet og kan skape store mengder rusk. Enzymatisk separasjon anbefales ikke fordi det kan føre til økt vevsklipping og høy celledødelighet. Mekanisk separasjon ved hjelp av en airbrush reduserer disse utfordringene (figur 2), noe som reduserer gjennomsnittlig celledødelighet til ~ 10% (data ikke vist). Etter airbrush-mediert mekanisk separasjon av vev fra skjelettet, ble den resulterende slam filtrering filtrert til en celle suspensjon ved filtrering gjennom en celle sil. Cellesuspensjonen ble deretter farget med DNA (DAPI), ROS og lysosommarkører og lest av FACS cytometer. En gating strategi ble deretter utviklet for å isolere bestemte cellepopulasjoner basert på cellemarkører som brukes. Inngjerdede cellepopulasjoner ble deretter sortert i oppsamlingsrør (figur 1).
Ved analyse av prøver på FACS cytometer, ble det tatt flere trinn for å fjerne rusk og døde celler fra prøven. Symbiodiniaceae celler kan selektivt fjernes hvis ønskelig på grunn av deres autofluorescens. For det første ble rusk og andre ikke-cellulære partikler som ikke delte samme form eller detaljnivå som korallceller fjernet fra analyser ved å skape et gatingutvalg på forover (størrelse) og side (detaljnivå) scatter (Figur 3A). Deretter ble døde celler utelukket ved å sammenligne den uholdbare kontrollcellesuspensjonen mot DAPI-farget prøve og langt rød kanal, og deretter gating ut de positive cellene for høy DAPI-farging i den fargede prøven (Figur 3B, cellepopulasjon P6). Parallelt ble celler som var vert for autofluorescerende Symbiodiniaceae fjernet ved å gating mot celler med høyt signal i den fjerne røde kanalen (Figur 3B,APC-Cy7). Etter denne iterative gating prosessen representerer de gjenværende cellene for analyser de intakte levende korallcellepopulasjonene som mangler Symbiodiniaceae.
Disse cellene kan deretter klassifiseres i forskjellige celleunderpopulasjoner ved å sammenligne kontroll- og beisede prøver ved å legge til eksogene flekker for funksjoner som ROS-aktivitet og/eller lysosominnhold (figur 3C). For eksempel, undersøke dataene på ROS- og lysosome-farging filtre avslørtfire forskjellige underpopulasjoner av korallceller. En cellepopulasjon hadde et relativt lavt signal for lysosomalt innhold (APC-filter) og de tre andre hadde høyt signal i lysosomalt innhold og en rekke ROS-aktivitet (FITC-filter) (Figur 3C). Hver av disse underpopulasjonene kan sorteres individuelt for nedstrøms analyse, eller videre analyseres og analyseres i mer diskrete underpopulasjoner ved skjæringspunktet mellom størrelse, detaljnivå, autofluorescens og/ eller DNA-innhold. I denne studien ble DNA, ROS-aktivitet og lysosomalt innhold brukt til å identifisere brede egenskaper ved korallceller. Viktigere, denne generelle protokollen kan tilpasses en rekke fluorescerende markører samt spesifikke antistoff prober som kan brukes i forbindelse for isolering av spesialiserte cellepopulasjoner av interesse som stamceller.
Figur 1: Den generelle arbeidsflyten for korallcellesorteringsprosessen. Den utvalgte protokollen gjør det mulig å fjerne korallceller fra skjelettet for farging, som deretter kjøres gjennom FACS cytometer, målt, analysert og isolert i cellepopulasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fjerning av vev og celler fra korallskjelettet. Luftkompressoren (A) tvinger luft- og cellefargingsmedier (F) ut av airbrushen (E) og arbeider for å sprenge vevet av korallskjelettet (C) og skaper en celleslam i posen (D). Det maksimale lufttrykket styres av trykkmåleren (B) på luftkompressoren (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Gating utvalg av levende korallceller. (A)Levende celler ble isolert fra rusk ved hjelp av en minimum fremover scatter verdi på 102. (B) APC-Cy7-filteret ble brukt til å identifisere rød autofluorescens, som effektivt skiller ut symbiont-vertsbaserte celler, mens DAPI ble brukt til å identifisere celler som var svært positive for DNA-farging. De svært positive for DAPI var et tegn på døde og døende celler. -CJeg harikke noe valg. Ytterligere markører for ROS-aktivitet og lysosominnhold ble brukt til å ytterligere skille ulike korallcellepopulasjoner. Alle data ble senere reanalysert på FlowJo (v10) for å generere disse grafene. Den innsatte populasjonsetiketten og prosenten tilsvarer de mikroskopiske bildene som er tatt av hver sorterte populasjon (E). Prosentandelene som vises i hver tomt, er av de totale cellene i plottet. Nederst til høyre skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Renhetskontroll av de autofluorescerende Symbiodiniaceae-tilknyttede cellene. (A) Celler som er positive for fluorescens på APC-Cy7-filteret fra den ikke-oppnådde kontrollprøven ble sortert. (B)Denne sorterte gruppen av celler ble deretter kjørt på cytometeret og reanalysert under samme forhold, som viser 94% renhet. Foroverpunkt (X-akse, FSC) ble brukt for forankringsaksen, men kan byttes ut med noen av de andre parameterne. Den samme prosessen kan utføres på beisede prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen ble tilpasset fra Rosental et al.18 og utviklet for identifisering og isolering av P. damicornis celler. Metodikken fokuserer på prosessen med filtreringsprøver for å fjerne rusk, ikke-levedyktige celler og Symbiodiniaceae-vertsbaserte celler gjennom undersøkelse av celleintrinsiske faktorer, inkludert relativ cellestørrelse, relativ cellegranularitet, celleautofluorescens og tilstedeværelsen av intakte cellulære membraner. Disse teknikkene kan brukes på andre korallarter. FACS gating strategier kan imidlertid variere på grunn av artsspesifikke forskjeller i cellepopulasjonsegenskaper.
Nytten av FACS for å forstå korallhelse ligger i sin evne til å bruke ulike celle iboende faktorer for å differensial identifisere og isolere celler. Videre beskriver denne protokollen den ekstra bruken av eksogene cellulære flekker for å skille korallceller basert på levedyktighet, reaktiv oksygenartkonsentrasjon og lysosominnhold. Av de 30 + kommersielle markører som tidligere ble testet i Rosental et al.18, 24 merket P. damicornis celler, hvorav 16 produsert differensialsignal, klynger av differensiering som ville tillate valg av celleunderpopulasjoner.
En av de kritiske trinnene i denne protokollen er riktig vev fjerning og filtrering for å sikre at vev klumper er dissosiert og ikke blokkere laminær strømmen av strømmen cytometer. Riktig justering av PMT-spenningen er avgjørende for nøyaktig deteksjon og analyse av uavhengige celledeteksjonshendelser. Sammenlignet med tidligere arbeid18, prosessen med korallcelleisolasjon fra det underliggende skjelettet via airbrush mekanisk forstyrrelse forbedrer betydelig på tradisjonelle skraping metoder ved å redusere rusk og maksimere celle levedyktighet (~ 90%, Figur 2 og figur 3A), og dermed forbedre påfølgende analyser ved å redusere falske positive på grunn av støy.
Metodikken som er beskrevet i dette papiret letter separasjonen av korallcellepopulasjoner gjennom differensialvalg på et skjæringspunkt mellom morfologiske og funksjonelle egenskaper på et nivå som ikke tidligere er mulig. Med utviklingen av FACS-metoder for korallceller er det nå mulig å velge spesifikke celleunderpopulasjoner for etablering av definerte cellekulturer, samt for å undersøke transkripsjons- og epigenetiske profiler knyttet til spesifikke celleunderpopulasjoner. Anvendelsen av denne finskala informasjonen vil gi innsikt i celletype, atferd og funksjon, og kan avsløre egenskaper forbundet med utviklingen av cnidarian-spesifikke celletyper som calicoblasts og cnidocytes. I tillegg kan anvendelsen av FACS-teknologi til utvikling av forbedrede stressanalyser og biomarkører være nyttig for beskyttelse av alvorlig truede korallrev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
NTK ønsker å anerkjenne University of Miami Research Awards i naturvitenskap og engineering for finansiering av denne forskningen. BR vil gjerne takke Alex og Ann Lauterbach for finansieringen av Komparativ og evolusjonær immunologilaboratorium. Arbeidet til BR ble støttet av Israelsk Science Foundation (ISF) tall: 1416/19 og 2841/19, og HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vil gjerne takke Zhanna Kozhekbaeva og Mike Connelly for teknisk assistanse. Vi vil også takke University of Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource ved Sylvester Comprehensive Cancer Center for tilgang til FACS cytometer og til Shannon Saigh for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
