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ट्रैकिंग सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड लेबल मेसेनचिमल स्टेम सेल एक दर्दनाक मस्तिष्क चोट Murine मॉडल में Intranasal वितरण के बाद एमआरआई का उपयोग कर

Published: November 21, 2019 doi: 10.3791/60450
Automatic Translation
1,2,3, 2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3
1Ph.D. Program for Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University and National Health Research Institutes, 2Center for Neurotrauma and Neuroregeneration, Taipei Medical University, 3TMU Neuroscience Research Center, Taipei Medical University, 4Department of Neurosurgery, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

Summary

यहां प्रस्तुत दर्दनाक मस्तिष्क चोट के माउस मॉडल में गैर-आक्रामक मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) डिलीवरी और ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों को वास्तविक समय एमआरआई का उपयोग करके इंट्रानासाल डिलीवरी के बाद वीवो ट्रैकिंग में एमएससी लेबलिंग और गैर-इनवेसिव के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जांच के रूप में नियोजित किया जाता है।

Abstract

मस्तिष्क की चोटों के लिए स्टेम सेल आधारित उपचार, जैसे दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई), नैदानिक परीक्षणों के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण हैं। हालांकि, इनवेसिव सेल डिलीवरी और कम प्रत्यारोपण दक्षता के साथ ट्रैकिंग जैसी तकनीकी बाधाएं ट्रांसलेशनल स्टेम-आधारित चिकित्सा में चुनौतियां बनी हुई हैं। यह लेख सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड (एसपीआईओ) नैनोकणों के साथ मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) की लेबलिंग के आधार पर स्टेम सेल लेबलिंग और ट्रैकिंग के लिए एक उभरती तकनीक के साथ-साथ लेबल वाले एमएससी की इंट्रानासल डिलिवरी का वर्णन करता है । ये नैनोकण फ्लोरोसेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफवाईटीसी) एम्बेडेड और एमएससी को लेबल करने के लिए सुरक्षित हैं, जिन्हें बाद में इंट्रानासाल मार्ग द्वारा टीबीआई-प्रेरित चूहों के दिमाग में वितरित किया जाता है। वे तो वास्तविक समय चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा वीवो में गैर आक्रामक ट्रैक कर रहे हैं । सेल लेबलिंग और इंट्रानासाल डिलीवरी के लिए एसपीआईओ को जोड़ती इस तकनीक के महत्वपूर्ण फायदे लंबी ट्रैकिंग अवधि के लिए डिलीवरी के बाद वीवो एमएससी ट्रैकिंग में (1) गैर-इनवेसिव शामिल हैं, (2) गैर-आक्रामक के कारण कई खुराक रेजीडेंस की संभावना एमएससी डिलीवरी का मार्ग, और (3) एसपीआईओ की सुरक्षा, एमआरआई द्वारा सेल-ट्रैकिंग विधि की गैर-आक्रामक प्रकृति, और प्रशासन के मार्ग के कारण मनुष्यों के लिए संभावित अनुप्रयोग।

Introduction

मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) विकारों और मनुष्यों में चोटों के उपचार में स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के लिए आकर्षक उम्मीदवार हैं। इसके अलावा, एमएससी चोट साइटों1,2पर चिकित्सीय प्रोटीन के वितरण के लिए एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, सीएनएस विकारों के स्टेम सेल-आधारित उपचारों के लिए सेल ट्रैकिंग सेल-सेल-आधारित 1) सेल डिलीवरी के उपन्यास मार्गों को स्थापित करने के लिए आशाजनक नवाचार विकसित किए गए हैं। मस्तिष्क में स्टेम कोशिकाओं का अरण्य वितरण कोशिकाओं की क्रिब्रिफॉर्म प्लेट को बाईपास करने और पैरानचिमल मार्ग3के माध्यम से आंशिक रूप से घ्राण बल्ब में प्रवेश करने की क्षमता पर निर्भर करता है । इंट्रानासाल डिलीवरी का संयोजन और सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड (एसपीआईओ) नैनोकणों के साथ एमएससी की लेबलिंग सीएनएस विकारों के इलाज में एमएससी के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है, क्योंकि एसपीआईओ नैनोकण चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए सुरक्षित जांच करते हैं और एमआरआई3,4,5द्वारा एमएससी पोस्ट-डिलीवरी के गैर-आक्रामक संवेदनशील देशीयमुख ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, इंट्रानासाल डिलीवरी एक सुरक्षित और गैर-आक्रामक मार्ग है जो थोड़े समय के भीतर प्रशासन को दोहराने की अनुमति देता है।

यह लेख दर्दनाक मस्तिष्क चोट (टीबीआई) के माउस मॉडल में वीवो पोस्ट-इंट्रानासाल डिलीवरी में एमएससी पर नज़र रखने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और गैर-आक्रामक तकनीक का वर्णन करता है, जो SPIO-लेबल कोशिकाओं और एमआरआई को रोजगार देता है। SPIO लेबलिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ एमआरआई द्वारा ऊतक में एसपीआईओ का संवेदनशील पता लगाना है, जो कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक और गैर-आक्रामक रूप से ट्रैक करना संभव बनाता है। यहां उपयोग किए जाने वाले एसपीआईओ नैनोकण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफवाईटीसी) फ्लोरोफोर के साथ टैग किए गए हैं, जो इम्यूनोस्टेनिंग या अतिरिक्त प्रसंस्करण के बिना ऊतक में एसपीआईओ का पता लगाने की अनुमति देता है। इसके अलावा, देशीयतर वास्तविक समय ट्रैकिंग करना और वितरित एमएससी के जैव वितरण की जांच करना संभव है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, ताइपे मेडिकल विश्वविद्यालय में पशु उपयोग के लिए नैतिकता समिति के अनुमोदन के साथ (अनुमोदन नहीं । लाख-2018-0574; 15.03.2019).

1. एसपीआईओ नैनोकणों के साथ एमएससी की लेबलिंग

  1. एसपीआईओ के साथ एमएससी को लेबल करने के लिए, एमएससी (80% कन्फ्लोरी) युक्त T75 फ्लास्क में कोई भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]) के साथ डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम [डीएमईएम] में लेबलिंग मीडिया (25 μg/ML] के 6 mL जोड़ें।
  2. बिना झटकों के सीओ2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में लेबलिंग मीडिया के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 24 घंटे के बाद, एक वैक्यूम से जुड़ी प्लास्टिक टिप के साथ बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करलेबलिंग मीडिया को धीरे से हटा दें। अआंतरिक एसपीआईओ के किसी भी निशान को हटाने के लिए फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) के 6 मिलील के साथ कोशिकाओं मोनोलेयर 2x को धोलें।
    1. यह निर्धारित करने के लिए कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक लेबल किया गया है या नहीं, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत लेबल वाली कोशिकाओं की जांच करें यदि एसपीआईओ को फ्लोरोफोर के साथ टैग किया जाता है (यानी, यहां उपयोग किए जाने वाले लोगों की तरह; चित्रा 1बी, सी)। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं के लिए प्रशिया नीले धुंधला प्रदर्शन (धुंधला प्रोटोकॉल के लिए 6.2-6.4 कदम देखें)।
  3. 3 7 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइप्सिन और इनक्यूबेट के 3 एमएल के साथ उपचार द्वारा फसल अनुयायी कोशिकाएं। इन्क्यूबेशन के 5 मिन के बाद, ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए 10% एफबीएस (v/v) के साथ पूर्व-गरम डीएमईएम मीडिया के 7 मिलील जोड़ें। एक 15 mL शंकुट्यूब में एक पिपेट का उपयोग कर सेल निलंबन ले लीजिए।
  4. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को त्यागें और पीबीएस में सेल पेलेट को फिर से सस्पेंड करें। ट्राइपैन ब्लू डाई और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: लेबल कोशिकाओं की सेल गोली लोहे की लोडिंग(चित्रा 1 डी)के कारण एक गहरे रंग के रूप में दिखाई देगा। यह प्रोटोकॉल एमएससी लेबलिंग और एमआरआई इमेजिंग के लिए प्रासंगिक है। एमएससी लेबलिंग6 के लिए प्रक्रिया पहले अनुकूलित किया गया है, और केवल वीवो में ट्रैक करने के लिए लेबल एमएससी तैयार करने के लिए कदम यहां शामिल हैं, क्योंकि वीवो ट्रैकिंग में ध्यान केंद्रित है । अन्य सेल प्रकारों की खेती और लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  5. पीबीएस के 18 माइक्रोन (या इंटरनासल डिलीवरी प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली कुल मात्रा) में पीबीएस का उपयोग करके सेल एकाग्रता को 150,000 कोशिकाओं (या पर्याप्त एमआरआई सिग्नल में परिणाम देने वाली संख्या) में समायोजित करें।
    नोट: यह देखा गया कि पीबीएस की 150,000 कोशिकाओं/18 माइक्रोन से अधिक कोशिका एकाग्रता कोशिका एकत्रीकरण की ओर ले जाती है, जो इंट्रानासाल डिलीवरी की दक्षता को प्रभावित कर सकती है। यदि इंट्रानासाल डिलीवरी के लिए कोशिकाओं की अधिक संख्या की आवश्यकता है, तो सेल निलंबन की कुल मात्रा में वृद्धि करें और इंट्रानासाल प्रशासन की संख्या बढ़ाएं, क्योंकि इंट्रानासाल प्रशासन एक गैर-आक्रामक प्रक्रिया है, और कई खुराक संभव है।

2. नियंत्रित कॉर्टिकल इम्पैक्ट (सीसीआई) चोट

नोट: इस प्रोटोकॉल में, पुरुष C57 BL/6 चूहों (7-8 सप्ताह पुराने) भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum उपयोग के साथ एक 12/12 h प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखा गया था ।

  1. सीसीआई चोट के लिए प्रत्येक माउस को तैयार करने के लिए, ज़ोलाज़ेपम (50 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (20 मिलीग्राम/किलो) एनेस्थेटाइज़िंग कॉकटेल को इंट्रापेरिटोनियल (यानी) इंजेक्शन (1 mL/kg) के माध्यम से प्रशासित करें। सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण की गहराई अंगूठे की कमी से पर्याप्त है चुटकी प्रतिक्रिया। वैकल्पिक रूप से, माउस को 60 एस के लिए 2%-4% आइसोफ्लोरीन के साथ आपूर्ति किए गए कक्ष मेंरखें।
  2. एक इलेक्ट्रॉनिक बाल क्लिपर का उपयोग कर कान के बीच खोपड़ी की पृष्ठीय सतह के फर दाढ़ी। आयोडीन में भिगोए गए बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके कई बार मुंडा क्षेत्र को साफ करें। आयोडीन को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने वाले सूती झाड़ू का उपयोग करें।
  3. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें और कान की सलाखों और नाक सलाखों का उपयोग करमाउस को सुरक्षित करें। खोपड़ी की सतह तक पहुंचने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करके मुंडा त्वचा में एक मिडसैसिग्टल चीरा (लगभग 2.5 सेमी) बनाएं।
  4. खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए एक कपास पैड का उपयोग कर हड्डी पर ऊतक निकालें। 10 एस के लिए 3% एच2ओ2 में भिगोए गए कपास झाड़ू का उपयोग करके खोपड़ी की सतह को साफ करें, फिर इसे सूखे सूती पैड से साफ करें।
    नोट: खोपड़ी टांके और दोनों ब्रेग्मा और लैम्ब्डा अब आसानी से पहचाना जा सकता है।
  5. सीसीआई चोट के लिए खोपड़ी की सतह पर पसंद के निर्देशांक की पहचान करें और पेंसिल या उचित मार्कर का उपयोग करके निर्देशांक के चारों ओर एक सर्कल (4 मिमी व्यास) खींचें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एंटेरोपोस्टर (एपी) -2.0 मिमी और औसत दर्जे (एमएल) + 1.5 मिमी पर समन्वय का उपयोग सीसीआई इंडक्शन के लिए किया गया था।
  6. चिह्नित सर्कल पर खोपड़ी को पतला करने के लिए माइक्रोड्रिल और गोल बर्र (0.5 मिमी व्यास) का उपयोग करें। ड्रिलिंग करते समय दबाव लागू करने से बचें, क्योंकि हड्डी के माध्यम से ड्रिलिंग से मस्तिष्क परेंचिमा को नुकसान हो सकता है। एक साफ और सूखी कपास झाड़ू का उपयोग कर दूर हड्डी धूल साफ करें।
  7. इसे बरकरार रखते हुए ड्यूरा मेटर को बेनकाब करने के लिए बाँझ ठीक संदंश का उपयोग करके धीरे-धीरे बोन फ्लैप को हटा दें। पूर्व चोट की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस को हटा दें और इसे सीसीआई डिवाइस के स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में रखें।
  8. कान की सलाखों और नाक सलाखों का उपयोग कर माउस के सिर को स्थिर करें। सुनिश्चित करें कि माउस का सिर रोस्ट्रल-कौडल दिशा में स्तर है और यदि आवश्यक हो तो नाक की सलाखों को समायोजित करें।
  9. उजागर कॉर्टिकल सतह पर प्रभावक टिप को शून्य करने के लिए नियंत्रण बॉक्स पर निर्देशों का पालन करें। सुनिश्चित करें कि प्रभावक टिप सीधे वांछित कॉर्टेक्स निर्देशांक के ऊपर गठबंधन किया जाता है प्रभावक के आधार पर एक्स और वाई नियंत्रण पहियों का उपयोग करप्रभावित होने के लिए।
  10. 5 मीटर/एस के वेग के साथ नियंत्रण बॉक्स का उपयोग कर प्रयोग मापदंडों को सेट करें, माउस में हल्की चोट को प्रेरित करने के लिए 250 एमएस के समय और 1 मिमी की चोट गहराई पर ध्यान केंद्रित करें।
  11. नियंत्रण बॉक्स पर 'प्रभाव' बटन दबाकर चोट को प्रेरित करें। एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर के होने वाला कोई भी रक्तस्राव झाड़ू।
  12. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस निकालें और रेशम सर्जिकल टांके का उपयोग कर चीरा बंद करें। सर्जिकल साइट को बंद करने के लिए धातु क्लिप का उपयोग न करें, क्योंकि माउस एमआरआई के लिए चुंबकीय क्षेत्र के अधीन होगा।
  13. संक्रमण को रोकने के लिए सर्जिकल साइट पर सामयिक एंटीबायोटिक्स (बैसिट्रिसिन नियोमाइसिन) लागू करें। माउस को हीटिंग पैड पर रखें और रिकवरी चरण के दौरान इसकी बारीकी से निगरानी करें।
  14. सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए दैनिक Ketoprofen (२.५ मिलीग्राम/किलो, आईपी) प्रशासन, जब तक कीटोप्रोफेन प्रशासन अध्ययन लक्ष्यों के साथ विरोधाभास ।

3. इंट्रानासल डिलीवरी

  1. 1 दिन के बाद सीसीआई प्रेरण में, zolazepam (५० मिलीग्राम/kg) और xylazine (20 मिलीग्राम/किलो) i.p. इंजेक्शन के माध्यम से एनेस्थेटाइजिंग कॉकटेल प्रशासन । सुनिश्चित करें कि माउस गहरे अंगूठे की कमी से एनेस्थेटाइज्ड है-चुटकी प्रतिक्रिया।
  2. हायलुरोनिडेस उपचार द्वारा एमएससी के इंट्रानासल डिलीवरी के लिए माउस तैयार करें।
    1. माउस के स्क्रफ को पकड़ो और खोपड़ी को स्थिर करते हुए मजबूती से अपनी पीठ पर चालू करें। एक पिपेट की नोक रखें जिसमें बाँझ पीबीएस (4 यू/माइक्रोन) में 45 डिग्री कोण पर माउस के नथुने के पास हायलुरोनिडेस शामिल हो।
    2. प्रत्येक नथुरोनिदास निलंबन के 3 μL प्रशासन। माउस को स्थिर रखें और 5 मिन के लिए एक साफ पैड पर ऊपर की ओर सामना करें। दोहराएं हायलुरोनिडेस उपचार 4x (कुल 100 यू हायलुरोनिडेस निलंबन)।
  3. हायलूरोनिदास उपचार के बाद, 30 मिन के लिए सामना करना पड़ एक साफ पैड पर इलाज माउस रखें।
  4. मस्तिष्क में एमएससी देने के लिए, माउस को मजबूती से पकड़ें, जैसा कि चरण 3.2.1 में वर्णित है। 3 एस अंतराल के साथ एमएससी निलंबन के 3 μL/नथुने प्रशासन । 30 एस के लिए एक ही स्थिति में माउस पकड़े रखें जब तक कि नमूना बूंदें पूरी तरह से गायब न हो जाएं।
    नोट: प्रशासन के दौरान हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
  5. 3x तक 2 मिन अंतराल के साथ प्रशासन दोहराएं।
    नोट: वितरित की जाने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या 150,000 है, जैसे कि सेल निलंबन के 18 माइक्रोन प्रत्येक नथुने, 3x प्रत्येक के लिए 3 μL खुराक पर वितरित किया जा सकता है।
  6. माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और जब तक यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाए तब तक इसकी बारीकी से निगरानी करें।

4. वीवो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में

नोट: मस्तिष्क के ऊतकों के हिस्टोलॉजिकल धुंधला पहले intranasal प्रशासन के बाद स्टेम सेल के सफल वितरण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इस विधि का उपयोग केवल एक अध्ययन के अंत बिंदु के रूप में किया जा सकता है, न कि देशीयतरण। एमआरआई जांच का उपयोग करने के लिए चिकित्सीय स्टेम सेल लेबल करने के लिए अनुदैर्ध्य, गैर आक्रामक, एमआरआई का उपयोग कर कोशिकाओं के वीवो ट्रैकिंग में अनुमति देगा । महत्वपूर्ण बात, यह प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है। इस प्रोटोकॉल में एमआरआई स्कैनिंग 1, 7 दिन और एमएससी के 14 पोस्ट डिलीवरी पर की गई थी ।

  1. एमआरआई स्कैनिंग के लिए माउस तैयार करने के लिए, आइसोफ्लोरीन के साथ माउस को एनेस्थेटइज़ करें (इंडक्शन के लिए ओ2 के 1 एल/मिन में 5% आइसोफ्लोरीन, रखरखाव के लिए 1.5%-2% आइसोफ्लोरीन)। यह सुनिश्चित करने के लिए एक अंगूठे-चुटकी करें कि माउस आवश्यक संज्ञाहरण स्तर तक पहुंचता है।
  2. माउस को इमेजिंग धारक पर रखें और नल या किसी अन्य उचित विधि का उपयोग करके अपनी स्थिति सुरक्षित करें। धारक को एमआरआई कुंडली (7 T/40 सेमी चुंबक) के केंद्र में ले जाएं और निगरानी कनेक्शन से जोड़ें।
  3. स्पिन-इको अनुक्रम का उपयोग करके टी-2 * भारित स्कैन प्राप्त करने के लिए, पुनरावृत्ति समय (टीआर) को 1500 एमएस और इको टाइम (टीई) को 2.8 एमएस तक सेट करें।
  4. 16 मिमी x 16 मिमी क्षेत्र दृश्य (एफओवी), 128 x 128 अधिग्रहण मैट्रिक्स (एमटीएक्स) का उपयोग करें, और चार सिग्नल औसत और 90 डिग्री फ्लिप कोण (एफए) के साथ 0.75 x 0.8 मिमी2 की स्लाइस मोटाई का उपयोग करें।
  5. स्कैन पूरा करने के बाद एमआरआई कुंडली केंद्र से माउस धारक वापस लेना। माउस को अपने पिंजरे में वापस करें और जब तक यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाए तब तक इसकी बारीकी से निगरानी करें।
  6. टी 2 * भारित छवियों पर लेबल एमएससी को ट्रैक और मात्रा निर्धारित करने के लिए, आईटीके-स्नैप सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.8.0)7का उपयोग करें।
    1. एमआरआई मशीन के कंप्यूटर से एमआरआई स्कैन का कच्चा डाटा डायकॉम (मेडिसिन में डिजिटल इमेजिंग एंड कम्युनिकेशंस इन मेडिसिन) फॉर्मेट में एनालिसिस के लिए इस्तेमाल होने वाले कंप्यूटर में ट्रांसफर करें।
    2. आईटीके-स्नैप सॉफ्टवेयर चलाएं और फाइल बटन पर क्लिक करएमआरआई इमेज लोड करें। इसके बाद मेन्यू में ओपन मेन इमेज पर क्लिक करें। डिस्प्ले विंडो में ओपन इमेज बटन पर दबाएं, फिर ब्राउज़ बटन का उपयोग करके एमआरआई छवियों का पता लगाएं और खोलें।
      नोट: एमआरआई छवियों में लेबल कोशिकाओं का दृश्य हाइपोतीव्र क्षेत्रों के रूप में दिखाई देगा। यदि छवि के विपरीत समायोजित करने की जरूरत है, उपकरण का चयन करें । इमेज कंट्रास्ट।
    3. विभाजन लेबल अनुभाग में सक्रिय लेबल का चयन करके हाइपोतीव्र क्षेत्रों और घाव या अन्य मस्तिष्क भागों के विभाजन बनाएं। विभिन्न खंडों के लिए विभिन्न लेबल रंगों का उपयोग करें (यदि एक से अधिक भागों का विभाजन आवश्यक है)।
    4. मुख्य टूलबार में बहुभुज उपकरण का उपयोग एसपीआईओ-लेबल वाले एमएससी का प्रतिनिधित्व करने वाले हाइपोतीव्र क्षेत्रों को आकर्षित करने के लिए करें। एमआरआई छवि के नीचे स्थित स्वीकारकरें। खंडित क्षेत्र उस विशेष खंड को सौंपे गए सक्रिय लेबल के समान रंग के रूप में दिखाई देंगे। सभी एमआरआई स्लाइस के लिए इस विभाजन कदम दोहराएं।
    5. TheITK-SNAP टूलबॉक्स के नीचे सेगमेंटेशन लेबल सेक्शन में स्थित 3डी टूलबारके नीचे स्केलपेल टूल का चयन करके पूरे मस्तिष्क में एमएससी वितरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए खंडित क्षेत्रों का 3डी नक्शा विकसित करें। फिर, बनाया 3 डी नक्शे के तल पर स्वीकार प्रेस।
    6. लेबल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले खंडित हाइपोतीव्र क्षेत्रों का मात्रात्मक विश्लेषण (मात्रा और तीव्रता मतलब) करने के लिए, शीर्ष पैनल में सेगमेंटेशन बटन दबाएं और वॉल्यूम और स्टैटिस्टिक्सका चयन करें।

5. माउस मस्तिष्क और क्रायोसेक्शनिंग का निर्धारण

  1. माउस मस्तिष्क को ठीक करने के लिए, पिछले एमआरआई स्कैन के बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ ट्रांसकार्डिएक परफ्यूजन करें, जैसा कि पहले8वर्णित था।
    1. सिर को काटना और मस्तिष्क8निकालें । 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 48 घंटे के लिए 4% पीएफए के साथ मस्तिष्क को ठीक करें।
    2. मस्तिष्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज समाधान में विसर्जित करके मस्तिष्क को निर्जलित करें जब तक कि मस्तिष्क समाधान के नीचे तक डूब न जाए।
  2. मस्तिष्क को इष्टतम काटने के तापमान (OCT) समाधान में एम्बेड करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। मस्तिष्क को क्रायोस्टेट माइक्रोटोम के साथ 14 माइक्रोमीटर मोटाई के साथ स्लाइस में अनुभाग करें और उन्हें स्लाइड पर ले जाएं। आगे उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर अनुभाग स्लाइड स्टोर करें।

6. प्रशिया ब्लू धुंधला

नोट: प्रशिया नीले धुंधला आमतौर पर SPIO लेबल कोशिकाओं में लोहे की सामग्री का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। यहां, प्रशिया नीले धुंधला की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एमआरआई छवियों में हाइपोतीव्र संकेत एसपीआईओ लेबल एमएससी के अनुरूप हैं न कि कलाकृतियों के अनुरूप। प्रशिया ब्लू धुंधला ऊतकों में लोहे का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे संवेदनशील हिस्टोकेमिकल तरीकों में से एक है और इसका उपयोग कोशिकाओं में लोहे के एक भी कणिका की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

  1. 5 मिन के लिए आसुत पानी के साथ मस्तिष्क वर्गों की स्लाइड धोें।
  2. धुंधला समाधान है, जो बराबर भागों हाइड्रोक्लोरिक एसिड (10%) और पोटेशियम फेरोकाइड (10%) उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया गया।
  3. आसुत पानी के साथ 3x धोएं, प्रत्येक 5 मिन के लिए। 5 मिन के लिए न्यूक्लियर फास्ट रेड के साथ सेक्शन्स को काउंटरदाग करें। 2x स्लाइड्स को आसुत पानी से कुल्ला एंकलेस करें।
  4. स्लाइड्स में 95% और 2 मिन के लिए 100% अल्कोहल को डुबोकर धीरे-धीरे सेक्शन को डिहाइड्रेट करें। एक रेसिनस बढ़ते माध्यम के साथ कवरस्लिप जोड़ें।
  5. मस्तिष्क वर्गों में दाग कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: लेबल कोशिकाओं में लोहा नीले रंग के जमा के रूप में दिखाई देगा।

Representative Results

इंट्रानासाल डिलीवरी के चौबीस घंटे बाद, SPIO लेबल MSCs टी 2 * भारित छवियों(चित्रा 2B)पर कॉर्टिकल चोट के लिए मजबूत हाइपोतीव्र क्षेत्रों के रूप में पाया गया, चोट साइट के लिए SPIO के लक्षित प्रवास का संकेत है । यह माइग्रेशन डिलीवरी के बाद 14 दिनों तक दिखाई देता रहा, क्योंकि इस समय अवधि(चित्रा 2B)के लिए महत्वपूर्ण कमी के बिना हाइपोतीव्र संकेत दिखाई दे रहे थे। पीबीएस के साथ इलाज किए गए घायल जानवरों ने कोई हाइपोतीव्र क्षेत्र नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि मनाया गया हाइपोतीव्र क्षेत्र एसपीआईओ लेबल एमएससी के अनुरूप है और कलाकृतियों का संकेत नहीं है(चित्रा 2A)एमआरआई के साथ वीवो में देखे गए लेबल वाले एमएससी के जैव वितरण को 3डी पुनर्निर्माण(चित्रा 2सी, डी)का उपयोग करके कल्पना की गई थी। घायल कॉर्टेक्स में एमएससी के माइग्रेशन की पुष्टि प्रशिया ब्लू धुंधला और एफएफसी चैनल द्वारा लेबल वाले एमएससी(चित्रा 3ए, बी)में एफएफसी-टैग एसपीआईओ का पता लगाकर की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट और एमएससी द्वारा एसपीआईओ तेज की इन विट्रो पुष्टि। (ए)एमएससी को लेबलिंग के लिए एसपीआईओ के साथ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था। फिर, लेबल एमएससी एक इंट्रानासाल (आई) मार्ग के माध्यम से एक टीबीआई माउस मॉडल में दिया गया था। लेबल वाले एमएससी को ट्रैक करने के लिए विभिन्न टाइमपॉइंट पर एमआरआई किया गया था एसपीआईओ द्वारा एमएससी की पर्याप्त लेबलिंग की पुष्टि(बी)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और(सी)कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एफईसी चैनल का उपयोग करके हासिल की गई थी, क्योंकि एसपीआईओ नैनोकणों को एफएफसी के साथ टैग किया गया था । (ग) लोहे की लोडिंग के कारण लेबल वाले एमएससी की सेल पैलेट रंग में अंधेरा दिखाई दिया। FITC = फ्लोरोसेसिन आइसोथिओसाइनेट; SPIO = लोहे के ऑक्साइड के सुपरपैरामैग्नेटिक कण; एमएससीएस = मेसेंचिमल स्टेम सेल; एमआरआई = चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग; IN = इंट्रसल; टीबीआई = दर्दनाक मस्तिष्क चोट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वास्तविक समय एमआरआई टीबीआई प्रेरित चूहों के दिमाग में चोट साइटों की ओर SPIO लेबल एमएससी माइग्रेशन का पता लगाने और ट्रैकिंग सक्षम बनाता है । (A)चूहों को टीबीआई के अधीन किया गया था, जिसके बाद चोट के बाद 24 घंटे के एक इंट्रानासाल मार्ग के माध्यम से प्रशासित पीबीएस या एसपीआईओ-लेबल वाले एमएससी के साथ उपचार किया गया था । T2 * भारित छवियों के कोरोनल वर्गों ने 1, 7 और 14 दिनों के बाद डिलीवरी में चोट साइट (उल्लिखित क्षेत्र) के किनारे पर एक हाइपोइंट एरिया (एरोहेड) के रूप में लेबल किए गए एमएससी को दिखाया। पीबीएस का इलाज चूहों कोई हाइपोतीव्र क्षेत्र दिखा । (ख)चोट साइट क्षेत्र (हरे) की विभाजन प्रक्रिया और कोरोनल टी 2 *-एमआरआई छवियों के आधार पर एमएससी (लाल) लेबल । (C)टी2 * भारित छवियों के आधार पर माउस मस्तिष्क उपचार का 3डी पुनर्निर्माण मस्तिष्क में एसपीआईओ-लेबल एमएससी के जैव वितरण को दर्शाने वाली छवियां 14 दिन बाद प्रसव के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण इलाज जानवरों के दिमाग में SPIO लेबल MSCs की उपस्थिति की पुष्टि करता है । पीबीएस (नियंत्रण) और (सी)माउस के मस्तिष्क वर्गों के प्रशिया नीले धुंधला पीबीएस (नियंत्रण) और(सी)माउस के साथ इलाज किया SPIO लेबल MSCs के साथ इलाज किया गया । SPIO-सकारात्मक कोशिकाओं का पता चला एमएससी में इलाज माउस (बॉक्स्ड कोशिकाओं, नीले), जबकि नियंत्रण माउस 14 दिनों के बाद प्रसव में प्रांतस्था में चोट साइट पर कोई सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाया, एमआरआई टिप्पणियों की पुष्टि । पीबीएस के साथ इलाज किए गए ए(बी)नियंत्रण माउस के कॉर्टेक्स का फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और एसपीआईओ लेबल वाले एमएससी के साथ इलाज किया गया(डी)माउस डिलीवरी के 14 दिनों बाद आयोजित किया गया था। विश्लेषण में एमएससी-इलाज माउस में घायल प्रांतस्था में फिटईसी-टैग एसपीआईओ-पॉजिटिव कोशिकाओं (बॉक्स्ड कोशिकाओं, हरे रंग) की उपस्थिति का पता चला, लेकिन पीबीएस-इलाज माउस के कॉर्टेक्स में कोई एफआईईसी संकेत नहीं देखा गया । स्केल बार = 50 माइक्रोन, जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एमएससी के एसपीआईओ लेबलिंग और एसपीआईओ लेबल वाले एमएससी पोस्ट-इंट्रानासाल डिलीवरी की एमआरआई ट्रैकिंग के लिए सामान्य प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करता है । प्रोटोकॉल एक गैर-आक्रामक विधि का उपयोग करके मस्तिष्क में वीवो में एमएससी पोस्ट-डिलीवरी के माइग्रेशन और बायोडिस्ट्रीब्यूशन का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है।

एमएससी सीएनएस विकारों और चोटों के लिए स्टेम सेल आधारित उपचारों के लिए आकर्षक उम्मीदवार हैं, जो ट्रोफिक कारकों को स्रावित करने की उनकी क्षमता के कारण हैं जो 1) न्यूरोरेस्टोरेटिव प्रक्रियाओं और 2 को ट्रिगर करते हैं) चोट क्षेत्र9,10,11,12के भीतर उनके विरोधी भड़काऊ प्रभावों के कारण न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करते हैं। हालांकि लंबी अवधि के एमआरआई ट्रैकिंग और SPIO लेबल MSCs का पता लगाने सेल डिवीजन के साथ इंटरसेलुलर SPIO के कमजोर पड़ने के कारण सीमित किया जा सकता है, लेबल कोशिकाओं को कई हफ्तों तक के लिए पशु मॉडल13के दिमाग में प्रत्यारोपण के बाद पता लगाया जा सकता है ।

इसके अलावा यहां वर्णित SPIO नैनोकणों के साथ MSCs के लेबलिंग प्रोटोकॉल ट्रांसफेक्शन एजेंटों के बिना dextran के साथ लेपित है । साहित्य में14,15,16अन्य प्रोटोकॉल का प्रयोग किया गया है . हालांकि, सभी मामलों में, इन प्रोटोकॉलों को सेल प्रकार, एसपीआईओ आकार, ऊष्मायन समय और एसपीआईओ एकाग्रता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। एमएससी में कोनड्रोजेनिक विभेदन क्षमता को बिगड़ा हुआ दिखाया गया है , लेकिन एसपीआईओ लेबलिंग17पर आदिजेनिक भेदभाव नहीं है । इसलिए, यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि स्टेम सेल की विभेदन शक्ति पर एसपीआईओ के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए स्टेम सेल डिलीवरी से पहले भेदभाव परख किया जाए। पिछले अध्ययन में, यह दर्शाया गया था कि यहां उपयोग किए जाने वाले एक ही एसपीआईओ प्रकार और एकाग्रता के साथ एमएससी लेबलिंग ने एमएससी6की ऑस्टियोजेनिक या आदिजेनिक भेदभाव शक्ति को प्रभावित नहीं किया।

मस्तिष्क विकारों और चोटों के लिए चिकित्सीय स्टेम सेल वितरण का इंट्रानासाल मार्ग स्टेम कोशिकाओं के नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। हालांकि, नाक गुहा में स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार हुक्म है कि आंतरिक और आणविक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं । यद्यपि छोटे अणुओं के वितरण के लिए अंतरनासाल मार्ग का व्यापक रूप से पता लगाया जाता है, लेकिन चिकित्सीय स्टेम का आकार और जैव वितरण व्यवहार छोटे अणुओं से भिन्न होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एमएससी इंट्रानासाल डिलीवरी के बाद चोट साइट की ओर माइग्रेट करते हैं।

यहां, टी2 * भारित छवियों का उपयोग एसपीआईओ लेबल वाले एमएससी को ट्रैक करने के लिए किया गया था । अन्य रिपोर्टों में ढाल इको इमेजिंग का इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, संवेदनशीलता कलाकृतियों को अक्सर इंटरसेलुलर एसपीआईओ के कारण ढाल इको इमेजिंग में देखा जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, टी 2 * भारित छवियों पर SPIO लेबल MSCs का प्रतिनिधित्व करने वाले हाइपोतीव्र क्षेत्रों का स्थान मस्तिष्क वर्गों में एसपीआईओ के स्थान के समान था जैसा कि हिस्टोलॉजिकल परीक्षा(चित्र 3)द्वारा पता चला। यह मस्तिष्क में SPIO लेबल एमएससी ट्रैकिंग के लिए T2 * भारित स्पिन इको इमेजिंग की पर्याप्त संवेदनशीलता को इंगित करता है ।

संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल मस्तिष्क चोटों और विकारों के वीवो स्टेम सेल ट्रैकिंग अध्ययन में फायदेमंद है। वीवो में स्टेम सेल की देशीयतरबां वाली ट्रैकिंग पारंपरिक रूप से कई टाइमपॉइंट पर जानवरों का त्याग करके किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एमएससी डिलीवरी और ट्रैकिंग के लिए एक गैर-आक्रामक और कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो नैदानिक सेटिंग्स में मस्तिष्क चोटों और विकारों के लिए स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा के लिए एक संभावित प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुदान मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, ताइवान (सबसे 104-2923-बी-038-004-MY2, सबसे 107-2314-B-038-063, और सबसे 107-2314-B-038-042) और ताइपे मेडिकल यूनिवर्सिटी (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 और DP2-108-21121-01-N-05-01-01-01)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture supplies (Plastics) ThermoFisher Scientific Varies Replaceable with any source
Disposable Microtome Blade VWR 95057-832
D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX GIBCO 10565-018
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) Sakura Finetek 4583
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO 12662-029
Fluorescence Wild Field Microscope Olympus Olympus BX43
Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
Gentamicin (10 mg/mL) GIBCO 15710-064
Hair clipper Pet Club PC-400
Head Trauma Contusion device Precision Systems and Instrumentation Model TBI-0310
Hyaluronidase from bovine testes MilliporeSigma H3506
ITK-SNAP Software Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah ITK-SNAP 3.8.0
Ketamine (Ketavet) Pfizer 778-551
Mice National Laboratory Animal Center, Taiwan C57BL6 Wild type mice strain used in the study
Microdrill Nakanishi NE50 Combine with Burrs for generating the bone window
Microtome Leica RM2265
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells GIBCO S1502-100
MRI scanner Bruker Biospec
Phosphate Buffer Saline (PBS) Corning Cellgro/ThermoFisher 21-031-CV
Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
Prussian Blue Stain Abcam ab150674
Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles BioPAL Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 stem cells labeling for in vivo tracking using MRI
Suture monofilament Ethicon G697 Suture
Timer Wisewind Replaceable with any source
TrypLE GIBCO 12604-013
Xylazine (Rompun) Bayer QN05 cm92

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References

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चिकित्सा अंक 153 आंतरिक वितरण सेल ट्रैकिंग SPIO सेल लेबलिंग वीवो इमेजिंग दर्दनाक मस्तिष्क चोट में
ट्रैकिंग सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड लेबल मेसेनचिमल स्टेम सेल एक दर्दनाक मस्तिष्क चोट Murine मॉडल में Intranasal वितरण के बाद एमआरआई का उपयोग कर
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