Summary
Presenteras här är ett protokoll för icke-invasiv mesenkymala stamcells (MSC) leverans och spårning i en musmodell av traumatisk hjärnskada. Superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar är anställda som en magnetisk resonanstomografi (MRI) sond för MSC märkning och icke-invasiv in vivo spårning efter intranasal leverans med realtid MRI.
Abstract
Stamcells-baserade terapier för hjärnskador, såsom traumatisk hjärnskada (TBI), är en lovande metod för kliniska prövningar. Men tekniska hinder som invasiv cell leverans och spårning med låg transplantations effektivitet är fortfarande utmaningar i translationell Stem-baserad terapi. Denna artikel beskriver en ny teknik för stamcells märkning och spårning baserat på märkning av mesenkymala stamceller (MSCs) med superparamagnetiska järnoxid (SPIO) nanopartiklar, samt intranasal leverans av den märkta MSCs. Dessa nanopartiklar är fluorescein isotiocyanat (FITC)-inbäddade och säkra att märka MSCs, som därefter levereras till hjärnor TBI-inducerad möss av intranasal rutten. De spåras sedan icke-invasivt in vivo av realtid magnetisk resonanstomografi (MRI). Viktiga fördelar med denna teknik som kombinerar SPIO för cell märkning och intranasal leverans inkluderar (1) icke-invasiv, in vivo MSC-spårning efter leverans för långa uppföljnings perioder, (2) möjligheten av flera doseringsregimer på grund av den icke-invasiva väg av MSC leverans, och (3) möjliga ansökningar till människor, på grund av säkerheten för SPIO, icke-invasiv karaktär av cell-tracking metod av MRI, och administreringsväg.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) är attraktiva kandidater för stamcells-baserade terapier i behandlingar av centralanervsystemet (CNS) sjukdomar och skador hos människor. Dessutom har MSCS använts som ett medel för tillförsel av terapeutiska proteiner vid skade ställen1,2. Under de senaste åren har lovande innovationer utvecklats för att etablera 1) nya vägar för cell leverans och 2) cell spårning för stamcells-baserade terapier av CNS-störningar. Den intranasala leveransen av stamceller till hjärnan beror på förmågan hos celler att kringgå cribriform plattan och ange luktbulben delvis via en parenkymal Route3. Kombinationen av intranasal leverans och märkning av MSCS med superparamagnetisk järnoxid (spio) nanopartiklar utgör en lovande metod för kliniska tillämpningar av MSCS vid behandling av CNS-störningar, eftersom spio nanopartiklar är säkra sonder för magnetisk resonanstomografi (MRI) och tillåta icke-invasiv känslig longitudinell spårning av MSCS efter leverans av MRI3,4,5 Dessutom är intranasal leverans en säker och icke-invasiv väg som möjliggör upprepad administrering inom en kort tidsperiod.
Denna artikel beskriver en mycket känslig och icke-invasiv teknik för att spåra MSCs in vivo post-intranasal leverans i en musmodell av traumatisk hjärnskada (TBI), som sysselsätter SPIO-märkta celler och MRI. En viktig fördel med SPIO-märkningen är den känsliga detekteringen av SPIO i vävnad av MRI, vilket gör det möjligt att spåra celler effektivt och icke-invasivt. Den SPIO nanopartiklar som används här är kommersiellt tillgängliga och märkta med en fluorescein isotiocyanat (FITC) fluorophore, som gör det möjligt för detektion av SPIO i vävnad utan immunofärgning eller ytterligare bearbetning. Dessutom är det möjligt att utföra longitudinell realtidsspårning och undersöka bio distributionen av de levererade MSCs.
Protocol
Alla förfaranden som inbegriper djur i detta protokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén, med godkännande av etikkommittén för djuranvändning i Taipei Medical University (godkännande nr. LAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. märkning av MSCs med SPIO nanopartiklar
- För att märka MSCs med SPIO, tillsätt 6 mL etiketteringsmedia (25 μg/mL SPIO i Dulbecco ' s modifierade Eagle medium [DMEM] utan foster bovint serum [FBS]) till en T75 kolv som innehåller MSCs (80% confluency).
-
Inkubera cellerna med etiketteringsmaterialet i en CO2 -inkubator (37 ° c, 5% Co2) utan att skaka. Efter 24 h, ta försiktigt bort etiketteringsmaterialet med en steril Pastavpipett med en plastspets fäst vid ett vakuum. Tvätta cellerna enskiktslager 2x med 6 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna eventuella spår av ointernaliserad spio.
- För att avgöra om cellerna har märkts korrekt, kontrollera de märkta cellerna under ett fluorescerande Mikroskop eller konfokala Mikroskop om SPIO är märkta med en fluorophore (dvs., som de som används här; Figur 1B, C). Alternativt, utför preussisk Blåfärgning för cellerna (se steg 6.2 – 6.4 för infärgnings protokollet).
- Skörda adherenta celler genom behandling med 3 mL trypsin och inkubera vid 37 ° c. Efter 5 min av inkubering, tillsätt 7 mL förvärmda DMEM media med 10% FBS (v/v) för att inaktivera trypsin. Samla upp cellsuspensionen med hjälp av en pipett i ett 15 mL koniskt rör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i PBS. Räkna de livskraftiga cellerna med trypan blått färgämne och en hemocytometer.
Anmärkning: Cellpelleten av de märkta cellerna kommer att visas som en mörk färg på grund av järn lastning (figur 1d). Detta protokoll är relevant för MSC-märkning och MRI-avbildning. Förfarandet för MSC märkning6 har tidigare optimerats, och endast de steg för att förbereda märkt MSCS att spåra in vivo ingår här, eftersom in vivo spårning är fokus. Protokollet för odling och märkning av andra celltyper bör optimeras av forskaren. - Justera cellkoncentrationen med hjälp av PBS till 150 000 celler (eller ett tal som resulterar i en tillräcklig MRI-signal) i 18 μL PBS (eller den totala volymen som kommer att användas i den intranasala leverans proceduren).
Anmärkning: Det märktes att en cell koncentration högre än 150 000 celler/18 μL PBS leder till cell aggregering, vilket kan påverka effektiviteten av intranasal leverans. Om ett större antal celler behövs för intranasal leverans, öka den totala volymen av cellsuspensionen och öka antalet intranasal administrationer, eftersom intranasal administrering är en icke-invasiv procedur, och flera dosering är möjlig.
2. kontrollerad kortikal påverkan (CCI-skada)
Anmärkning: I detta protokoll hölls manliga C57 BL/6 möss (7 – 8 veckor gamla) i en 12/12 h ljus/mörker-cykel med AD libitum tillgång till mat och vatten.
- För att förbereda varje mus för CCI skada, administrera Zolazepam (50 mg/kg) och xylazin (20 mg/kg) anesthetizing cocktail via intraperitoneal (i.p.) injektion (1 mL/kg). Se till att anestesidjupet är tillräckligt av en brist på tå-nypa svar. Alternativt, Placera musen i en kammare levereras med 2% – 4% isofluran för 60 s.
- Raka pälsen i den dorsala ytan av skallen mellan öronen med hjälp av en elektronisk hårklippare. Rengör den rakade området flera gånger med hjälp av en steril bomullspinne indränkt i jod. Använd en bomullspinne indränkt i 70% etanol för att rengöra av jod.
- Placera den sövda musen i den stereoaktiska ramen och säkra musen med hjälp av öron stänger och näs stänger. Gör en planet snitt (ca 2,5 cm) i den rakade huden med hjälp av steril sax för att komma åt ytan av skallen.
- Ta bort vävnaden på benet med hjälp av en bomullspad för att exponera skallen. Rengör skallytan med en bomullspinne indränkt i en 3% H2O2 för 10 s, rengör sedan den med en torr bomullstuss.
Anmärkning: Skalle suturer och både bregma och lambda kan nu lätt identifieras. - Identifiera koordinaterna för valet på skallytan för CCI-skadan och rita en cirkel (4 mm diameter) runt koordinaterna med hjälp av en penna eller en ordentlig markör.
Anmärkning: I detta protokoll användes koordinaterna vid anteeroposterior (AP)-2,0 mm och snett (ml) + 1,5 mm för CCI-induktion. - Använd en microdrill och rund Burr (0,5 mm diameter) för att tunna skallen vid den markerade cirkeln. Undvik att använda tryck under borrning, som borrning genom benet kan orsaka skador på hjärnparenkymet. Rengör bendamm bort med en ren och torr bomullspinne.
- Ta försiktigt bort ben luckan med hjälp av sterila Fine pincett att exponera dura mater och samtidigt hålla den intakt. Ta bort musen från den stereoaktiska ramen som användes för förberedelse före skadan och placera den i den stereotaktiska ramen på CCI-enheten.
- Stabilisera huvudet på musen med hjälp av öron stänger och näsa barer. Se till att huvudet på musen är nivå i rostral-caudal riktning och justera näsan barer, om det behövs.
- Följ instruktionerna på kontrollboxen för att nollställnings spetsen till den exponerade kortikala ytan. Se till att kollisionsspetsen är riktad direkt över de önskade cortex-koordinaterna som ska påverkas med hjälp av X-och Y-Styrhjulen på kollisionsblocket.
- Ställ in experiment parametrarna med hjälp av kontrollboxen med en hastighet av 5 m/s, uppehållstid på 250 MS och skadedjup på 1 mm för att inducera mild skada i musen.
- Framkalla skada genom att trycka på ' ' Impact ' '-knappen på kontrollboxen. Blödning som uppstår med hjälp av en steril bomullspinne.
- Ta bort musen från stereotaktiska ramen och Stäng snittet med hjälp av Silk kirurgiska suturer. Använd inte metallklämmor för att stänga operationsområdet, eftersom musen kommer att utsättas för ett magnetfält för MRI.
- Tillämpa topikala antibiotika (bacitracin neomycin) till operationsområdet för att förhindra infektioner. Håll musen på värmeplattan och övervaka den noga under återhämtningsfasen.
- Administrera ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) dagligen i 3 dagar efter operationen, om inte ketoprofen administrationen motsäger med studiens mål.
3. intranasal leverans
- Vid 1 dag efter CCI induktion, administrera Zolazepam (50 mg/kg) och xylazin (20 mg/kg) anesthetizing cocktail via i.p. injektion. Se till att musen är djupt sövda av brist på tå-nypa svar.
-
Förbered musen för intranasal leverans av MSCs av hyaluronidas behandling.
- Ta tag i musens kragen och slå på ryggen stadigt samtidigt immobilisera skallen. Placera spetsen på en pipett som innehåller hyaluronidas i steril PBS (4 U/μL) nära näsborren på musen i en 45 ° vinkel.
- Administrera 3 μL hyaluronidassuspension i varje näsborre. Håll musen immobiliserade och vänd uppåt på en ren pad för 5 min. Upprepa hyaluronidas behandling 4x (totalt 100 U hyaluronidas suspension).
- Efter hyaluronidas behandling, hålla den behandlade musen på en ren pad uppåt i 30 min.
- För att leverera MSCs till hjärnan, håll musen stadigt, som beskrivs i steg 3.2.1. Administrera 3 μL/näsborre av MSC-suspension med 3 s intervall. Fortsätt hålla musen i samma position i 30 s tills prov dropparna har försvunnit helt.
Anmärkning: Undvik att bilda luftbubblor under administreringen. - Upprepa administreringen med 2 minuters intervall upp till 3x.
Anmärkning: Det totala antalet celler som ska levereras är 150 000, så att 18 μL av cellsuspensionen kan levereras vid en 3 μL dosering för varje näsborre, 3x vardera. - Tillbaka musen till sin bur och övervaka det noga tills det helt återhämtar sig från anestesi.
4. in vivo magnetisk resonanstomografi
Anmärkning: Histologisk färgning av hjärnvävnad har tidigare använts för att bekräfta en lyckad tillförsel av stamceller efter intranasal administrering. Emellertid, denna metod kan endast användas som en Endpoint av en studie, inte longitudinellt. Använda MRI-sonder för att märka terapeutiska stamceller kommer att möjliggöra longitudinell, icke-invasiv, in vivo spårning av cellerna med MRT. Viktigt, detta protokoll minskar effektivt antalet djur som krävs. I detta protokoll utfördes MRI-skanning vid dag 1, 7 och 14 efter leverans av MSCs.
- För att förbereda musen för MRI-skanning, söva musen med isofluran (5% isofluran i 1 L/min av O2 för induktion, 1.5% – 2% isofluran för underhåll). Gör en tå-nypa för att säkerställa att musen når önskad anestesi nivå.
- Placera musen på bildhållaren och säkra dess position med hjälp av kranar eller någon annan lämplig metod. Flytta hållaren till mitten av MRI-spolen (7 T/40 cm magnet) och Anslut övervaknings anslutningen.
- För att förvärva T2 *-viktade skanningar med hjälp av en spin-ECHO-sekvens, Ställ in repetitions tiden (TR) till 1500 MS och ECHO Time (TE) till 2,8 ms.
- Använd en 16 mm x 16 mm synfält (FOV), 128 x 128 Acquisition Matrix (MTX), och slice tjocklek av 0,75 x 0,8 mm2 med fyra signal medelvärden och en 90 ° flip Angle (FA).
- Dra tillbaka mus hållaren från MRI Coil Center efter att ha avslutat skanningarna. Tillbaka musen till sin bur och övervaka det noga tills det helt återhämtar sig från anestesi.
-
För att spåra och kvantifiera de märkta MSCs på T2 *-viktade bilder, Använd ITK-SNAP programvara (version 3.8.0)7.
- Överför rådata för MRI-skanningar från MRI-maskinens dator till den dator som används för analys i ett DICOM-format (Digital Imaging and Communications in Medicine).
- Kör ITK-SNAP programvara och ladda MRI-bilder genom att klicka på knappen Arkiv . Klicka sedan på Öppna huvudbild i menyn. Tryck på knappen Öppna bild i visningsfönstret och leta sedan upp och öppna MRI-bilderna med hjälp av bläddringsknappen .
Anmärkning: Visualisering av märkta celler i MRI-bilder kommer att visas som placebo områden. Om bildens kontrast behöver justeras, Välj verktyg | Bildkontrast. - Skapa segmenteringar av de hypoinspända områdena och lesionen eller andra hjärn delar genom att välja aktiv etikett i avsnittet segmenteringsetiketter. Använd olika etikettfärger för olika segment (om segmenteringen av mer än en del behövs).
- Använd polygonverktyget i huvudverktygsfältet för att rita runt de hypoinspända områden som representerar de spio-märkta MSCS. Välj Godkänn, som finns under MRI-bilden. Segmenterade områden visas som samma färg på den aktiva etikett som tilldelats det aktuella segmentet. Upprepa detta segmenteringsteg för alla MRI-skivor.
- Utveckla en 3D-karta över segmenterade områden för att representera MSC-fördelningen i hela hjärnan genom att välja verktyget Skalpell längst ned i 3D-verktygsfältet, som finns i avsnittet Segmenteringsetiketter längst ned i theitk-Snap Toolbox. Tryck sedan på Godkänn längst ned i den skapade 3D-kartan.
- För att utföra en kvantitativ analys (volym och intensitet medelvärde) av segmenterade placebo områden som representerar märkta celler, tryck på segmenteringsknappen i den övre panelen och välj volym och statistik.
5. fixering av mushjärna och Kryosnittning
-
För att fixera mus hjärnan, utför transcardiac perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) efter den senaste MRI-skanningen, som tidigare beskrivits8.
- Halshugga huvudet och extrahera hjärnan8. Fixera hjärnan med 4% PFA i minst 48 h vid 4 ° c.
- Torka av hjärnan genom att doppa den i en 30% sackaroslösning vid 4 ° c tills hjärnan sjunker till botten av lösningen.
- Bädda in hjärnan i den optimala skärtemperatur lösningen (ULT) och frys vid-20 ° c. Avsnitt hjärnan med en kryostat mikrotom i skivor med 14 μm tjocklek och montera dem på diabilder. Förvara sektionerna i-20 ° c tills den används ytterligare.
6. preussisk Blåfärgning
Anmärkning: Preussisk Blåfärgning används ofta för att detektera järnhalten i SPIO-märkta celler. Här används preussisk Blåfärgning för att bekräfta att de hypoinspända signalerna i MRI-bilderna motsvarar de SPIO-märkta MSCs och inte artefakter. Preussisk Blåfärgning är en av de mest känsliga histokemiska metoder som används för att upptäcka järn i vävnader och kan användas för att identifiera även en enda granule av järn i cellerna.
- Tvätta bilder av hjärn sektioner med destillerat vatten i 5 min.
- Utför preussisk Blåfärgning genom att doppa bilderna i 30 min i infärgnings lösningen, som innehåller lika delar saltsyra (10%) och kaliumferrocyanid (10%) bereds omedelbart före användning.
- Tvätta 3x med destillerat vatten, för 5 min vardera. Motfärga sektionerna med nukleärt fast rött i 5 min. Skölj bilderna 2x med destillerat vatten.
- Torka av sektionerna gradvis genom att doppa bilderna i 95% och 100% alkohol för 2 min vardera. Lägg till täckglas med ett hartslik monteringsmedium.
- Använd ett ljusmikroskop för att detektera de färgade cellerna i hjärn sektionerna.
Anmärkning: Järnet i de märkta cellerna kommer att visas som blå färgade insättningar.
Representative Results
Tjugofyra timmar efter intranasal leverans, den spio-märkta MSCS upptäcktes som starka placebo områden medial till kortikal skada på T2 *-viktade bilder (figur 2b), vilket indikerar den riktade migrationen av spio till skadan platsen. Denna migration förblev synlig upp till 14 dagar efter förlossningen, eftersom de placebo signalerna visade sig vara synliga utan signifikant reduktion för denna tidsperiod (figur 2b). De skadade djur som behandlats med PBS visade inga hypoinspända områden, vilket indikerar att de observerade hypoinspända områdena motsvarar de SPIO-märkta MSCs och inte att signalera artefakter (figur 2A) bio distributionen av de märkta MSCS som observerades in vivo med MRI visualiserades med hjälp av 3D-rekonstruktion (figur 2C, D). Migrationen av MSCs till den skadade cortex bekräftades histologiskt av preussiska Blåfärgning och FITC Kanaldetektering av FITC-märkta SPIO i den märkta MSCs (figur 3A, B).
Figur 1: schematiskt flödesschema för protokollet och in vitro-bekräftelse av SPIO-upptag av MSCS. (a) MSCS inkuberades med spio i 24 timmar för märkning. Sedan levererades de märkta MSCs till en TBI-musmodell via en intranasal (IN)-väg. MRT vid olika tidpunkter utfördes för att spåra den märkta MSCs. bekräftelse på tillräcklig märkning av MSCs av SPIO uppnåddes genomB) fluorescensmikroskopi och (C) konfokalmikroskopi med hjälp av FITC-kanalen, eftersom spio nanopartiklar taggats med FITC. (D) cellpelleten av den märkta MSCs verkade mörkt i färg på grund av järn lastning. FITC = fluorescei isotiocyanat; SPIO = superparamagnetiska partiklar av järnoxid; MSCs = mesenkymala stamceller; MRI = magnetisk resonanstomografi; I = intranasal; TBI = traumatisk hjärnskada. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MRI i real tid gör det möjligt att upptäcka och spåra SPIO-märkta MSC migration mot skada platser i hjärnan hos TBI-inducerad möss. (A) möss utsattes för TBI, följt av behandling med PBS eller spio-märkta MSCS, administrerat via en intranasal väg 24 h efter skada. Coronal avsnitt av T2 *-viktade bilder visade den märkta MSCS som ett placebo område (Arrowhead) på kanten av skadan plats (skisserat område) vid 1, 7, och 14 dagar efter leverans. De PBS-behandlade möss visar inget placebo område. (B) segmenteringsprocessen av området skada område (grön) och märkta MSCS (röd) baserat på koronalt T2 *-MRI-bilder. (C) 3D-rekonstruktion av mus hjärnans behandling baserad på T2 *-viktade bilder som illustrerar bio distributionen av spio-märkta MSCS i hjärnan 14 dagar efter leverans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: histologisk analys bekräftar närvaron av SPIO-märkta MSCs i de behandlade djurens hjärnor. Preussisk Blåfärgning av hjärn delar av en (a) mus som behandlats med PBS (kontroll) och (C) mus som behandlats med spio-märkta MSCS. spio-positiva celler upptäcktes i MSC-behandlade mus (boxed celler, blå), medan kontroll musen visade inga positiva celler på skadan plats i cortex vid 14 dagar efter leverans, bekräftar MRI observationer. Fluorescens mikroskopi analys av cortex av a (B) kontroll mus som behandlats med PBS och (D) mus som behandlats med spio-märkta MSCS utfördes 14 dagar efter leverans. Analysen avslöjade närvaron av FITC-märkta SPIO-positiva celler (boxed celler, grön) vid den skadade cortex i MSC-behandlade musen, men inga FITC signaler observerades i cortex av PBS-behandlade musen. Skalstreck = 50 μm, om inget annat anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här representerar allmänna procedurer för SPIO märkning av MSCs och MRI-spårning av SPIO-märkt MSCs post-intranasal leverans. Protokollet ger möjlighet att studera migration och biodistribution av MSCs efter leverans in vivo i hjärnan, med hjälp av en icke-invasiv metod.
MSCS är attraktiva kandidater för stamcells-baserade terapier för CNS-störningar och skador på grund av deras förmåga att utsöndra trofiska faktorer som 1) utlösa neurorestorative processer och 2) ger neuroprotection, på grund av deras antiinflammatoriska effekter inom skadeområdet9,10,11,12. Även om långsiktig MRI-spårning och detektion av SPIO-märkta MSCs kan begränsas på grund av utspädning av intercellulära SPIO med celldelning, kan märkta celler detekteras i upp till flera veckor efter transplantation i hjärnan hos djurmodeller13.
Beskrivs också här är märkningen protokoll MSCs med SPIO nanopartiklar belagda med dextran utan transfektion agenter. Andra protokoll har använts i litteraturen14,15,16. Emellertid, i alla fall, dessa protokoll bör justeras för celltyp, SPIO storlek, inkubationstid, och SPIO koncentration. MSCS har visat sig ha nedsatt chondrogenic differentiering potential men inte adipogen differentiering på spio märkning17. Därför är det starkt rekommenderat att differentiering analyser utföras före stamcells leverans för att utvärdera påverkan av SPIO på differentieringen potensen av stamceller. I en tidigare studie visade det sig att MSC-märkning med samma SPIO-typ och koncentration som används i här påverkade inte den Osteogena eller adipogena differentierings styrkan hos MSCs6.
Den intranasala vägen för terapeutisk stamcells leverans för hjärnsjukdomar och skador är en lovande metod för den kliniska tillämpningen av stamceller. Men de inneboende och molekylära mekanismerna som dikterar beteendet hos stamceller i näshålan förblir oklara. Även om den intranasala rutten är allmänt utforskad för leverans av små molekyler, storlek och biodistribution beteende av den terapeutiska stammen skiljer sig från små molekyler. Det aktuella protokollet visar att MSCs tenderar att migrera mot skada plats efter intranasal leverans.
Här användes T2 *-viktade bilder för att spåra de SPIO-märkta MSCs. Andra rapporter har använt toning ECHO Imaging. Dock observeras mottaglighet artefakter ofta i gradient ECHO Imaging på grund av intercellulära SPIO. I det aktuella protokollet var placeringen av de hypoinspända områden som representerar SPIO-märkta MSCs på T2 *-viktade bilder densamma som placeringen av SPIO i hjärn sektioner som upptäcktes av Histologisk undersökning (figur 3). Detta indikerar tillräcklig känslighet för T2 *-vägd spin ECHO Imaging för SPIO-märkta MSC tracking i hjärnan.
Sammanfattnings, det beskrivna protokollet är fördelaktigt för in vivo stamcells spårning studier av hjärnskador och sjukdomar. Den longitudinella spårningen av stamceller in vivo har traditionellt utförts genom att offra djur vid flera tidpunkter. Det nuvarande protokollet ger en icke-invasiv och effektiv metod för MSCs leverans och spårning, som representerar en potentiell procedur för stamcells-baserad terapi för hjärnskador och störningar i kliniska inställningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik bidrag, Taiwan (de flesta 104-2923-B-038-004-MY2 nätters, de flesta 107-2314-B-038-063, och de flesta 107-2314-B-038-042) och Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 och DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
| Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
| Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
| Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
| Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
| ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
| Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
| TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |
References
- Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
- Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
- Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
- Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
- Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
- Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
- Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
- Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
- Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).
- Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
- Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).
