Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie man säugen-zu-enaning Übergang in vitro mit Maus spät fetalen Intestinalorganoiden kultiviert für 30 Tage imitieren.
Abstract
Am Ende der Säugezeit erleiden viele Säugetierarten große Veränderungen im Darmepithel, die mit der Fähigkeit verbunden sind, feste Nahrung zu verdauen. Dieser Prozess wird als Säusen-zu-En-Übergang bezeichnet und führt zum Ersatz von neonatalem Epithel durch adultes Epithel, das mit metabolischen und morphologischen Anpassungen eingeht. Diese komplexen Entwicklungsveränderungen sind das Ergebnis eines genetischen Programms, das den Darmepithelzellen innewohnt, aber bis zu einem gewissen Grad durch extrinsische Faktoren moduliert werden kann. Verlängerte Kultur der Maus primären Darmepithelzellen aus der späten fetalen Periode, rekapituliert Säugen-zu-Entwöhnung Übergang in vitro. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die fetale Darmorganoidkultur der Maus, die am besten geeignet ist, diesen Prozess in vitro zu modellieren. Wir beschreiben mehrere nützliche Assays, die entwickelt wurden, um die Veränderung der Darmfunktionen im Zusammenhang mit dem Übergang zum Entwöhnen im Laufe der Zeit zu überwachen. Zusätzlich fügen wir ein Beispiel für einen extrinsischen Faktor hinzu, der in der Lage ist, den Säugen-zu-Entwöhnungs-Übergang in vivo zu beeinflussen, als eine Darstellung der Modulation des Timings des Saugen-zu-Entwöhnungs-Übergangs in vitro. Dieser In-vitro-Ansatz kann verwendet werden, um molekulare Mechanismen des Säugen-zu-Entwöhnungs-Übergangs sowie Modulatoren dieses Prozesses zu untersuchen. Im Hinblick auf die Tierethik in der Forschung trägt die Ersetzung von in vivo-Modellen durch dieses In-vitro-Modell zur Verfeinerung von Tierversuchen und möglicherweise zu einer Verringerung des Einsatzes von Tieren zur Untersuchung von Darmreifungsprozessen bei.
Introduction
Bei vielen Säugetierarten, einschließlich Mäusen und Männern, weist der Neonataldarm mehrere Merkmale auf, die sich vom vollreifen Darmepithel unterscheiden. Diese Eigenschaften erleichtern neonatalen Enterozyten, Milch zu verdauen und aufzunehmen, die hohe Fett- und Kohlenhydrate enthält, wobei Laktose das Hauptkohlenhydrat ist. Die Bürstengrenze der neonatalen Darmepithelzellen drückt die Disaccharidase-Lactase-Phlorizin-Hydrolase (Lct)1 aus, um das Milchdisaccharid Lactose zu verdauen. Nach der Säugezeit passen sich enterozyten an feste Nahrung an, die reich an komplexen Kohlenhydraten und fettarm ist. Dies manifestiert sich durch einen Schalter in Bürstenrrand-Disaccharidase-Expression von Laktase zu Sucrase-Isomaltase (Sis) und Trehalase (Treh), die komplexere Kohlenhydrate in fester Nahrung verdauen können2. Ein weiterer metabolischer Schalter hängt mit der niedrigen Konzentration von Arginin in der Milch zusammen. Um für die Notwendigkeit von Arginin, neonatale Enterozyten drücken die Rate begrenzende Enzym in Arginin Biosynthese, Argininosuccinat Synthase-1 (Ass1), Arginin zu synthetisieren3. Im Gegensatz dazu drücken erwachsene Enterozyten Arginase 2 (Arg2) aus, ein Enzym, das in der Lage ist, Arginin zu katabolisieren, das in festen Lebensmitteln reichlich vorhanden ist. Darüber hinaus drückt das neonatale Darmepithel den neonatalen Fc-Rezeptor für Immunglobuline (FcRn) aus, der die Absorption des mütterlichen IgG aus der Milch in den Kreislauf/Blutkreislauf4vermittelt. Die Expression von FcRn nimmt während des Säugens-zu-Entwöhnungs-Übergangssignifikant ab 5. Bei Mäusen erfolgt die Reifung von Paneth-Zellen postnatal, zufällig mit der Bildung und Reifung von Krypten, und ist durch die Expression von antimikrobiellen Peptiden Lysosom (Lyz) und Defensins6gekennzeichnet.
All diese Veränderungen sind Teil des Säugens-zu-Enaning-Übergangs, ein Prozess, der allmählich nach der Geburt bis zum Alter von einem Monat bei Mäusen auftritt, wenn das Darmepithel seinen reifen Erwachsenenzustand erreicht. Saugen-zu-En-Übergang ist intrinsisch reguliert und entwicklungsbasiert in der Darmröhre gesetzt. Transkriptionsfaktor B Lymphozyten-induzierte Reifung Protein-1 (Blimp-1) spielt eine Schlüsselrolle in diesem intrinsischen Reifungsprozess7. Blimp-1 ist stark in neonatalen Epithel exprimiert, während seine Expression abnimmt und während des Säugens-zu-Entwöhnungs-Übergangs verloren geht und daher als zuverlässiger Marker des neonatalen Darmepithels dienen kann. Obwohl es sich um einen intrinsischen Prozess handelt, kann der Säugen-zu-Entwöhnungsübergang durch externe Faktoren moduliert werden. Zum Beispiel ist das synthetische Analogon von Cortisol, Dexamethason, bekannt, um die Darmreifung in vivo8,9zu beschleunigen.
Aktuelle In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Darmepithelreifung einschließlich des Säugens-zu-Enaning-Übergangs verwenden adulte Epithelzelllinien und/oder adulte Organoide, die Merkmale des adulten Darmepithels aufweisen. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass primäre Darmepithelzellen, die aus dem späten fetalen Darm isoliert sind, reifen und den Säugen-zu-Entwöhnungsübergang rekapitulieren, wenn sie in vitro als Organoide wachsen10. Wir haben weiter gezeigt, dass dieser Darmreifungsprozess in vitro im gleichen Tempo wie in vivo stattfindet. Schließlich verwendeten wir Dexamethason, um den Reifungsprozess auf die gleiche Weise zu beschleunigen, wie sie für In-vivo-Studien beschrieben wurde.
Hier skizzieren wir ein präzises Protokoll für die Isolation und Kultur von Maus spätfetalen Intestinalorganoiden. Wir beschreiben die bevorzugte Methode, Proben für eine verlängerte Organoidkultur zu sammeln, und Methoden zur Überwachung des Säugens-zu-Entwöhnungs-Übergangs in vitro. Dieses Protokoll kann für In-vitro-Studien der Darmepithelreifung und Modulatoren dieses Prozesses verwendet werden und führt zu einem höheren Durchsatz, einer höheren Qualität und einem höheren Translationswert der Daten und einer Verringerung des Tierischen.
Protocol
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die vom Ethikausschuss für Tierversuche der Universität Amsterdam in voller Übereinstimmung mit den nationalen Rechtsvorschriften über die Tierforschung gemäß der europäischen Richtlinie 2010/63/EU für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (ALC312) eingerichtet wurden.
1. Isolierung von fetalen kleinen Darmorganoiden
- Opfern Sie die E18-E20 Föten durch Enthauptung mit chirurgischer Schere, gemäß den anerkannten ethischen Vorschriften.
- Unmittelbar nach der Euthanasie den Unterbauch des Fötus vorsichtig mit einer Darmschere aufschneiden und den gesamten Darm entfernen.
ANMERKUNG: Die Isolierung muss mit dem Darm zwischen E18 und E20 der Trächtigkeit durchgeführt werden, um den richtigen Säugen-zu-Entwöhnungsübergang und die Reifung in vitro zu erreichen. - Mit zwei kleinen Zangen, dehnen Sie den Darm. Mit dem Magen und dem Blinddarm als Leitfäden, schneiden Sie den proximalen und distalen Teil des Dünndarms auseinander.
HINWEIS: Wenn die Zerlegung sorgfältig durchgeführt wird, ist es möglich, auch den Doppelpunkt zu isolieren. Schneiden Sie es mit Anhang als Leitfaden auseinander (Abbildung 1). - Den Darm längs öffnen: Fixieren Sie den Darm mit einer Rasierklinge, die in der Längsrichtung platziert wird, und ziehen Sie den Darm durch Schieben von Zangen (ein Arm der Zange auf jeder Seite der Rasierklinge) entlang der Rasierklinge. Anschließend den geöffneten Darm in 1 cm Stücke schneiden.
- Bereiten Sie zwei 50 ml-Rohre mit 10 ml eiskaltephosphatgepufferte Saline (PBS) vor. Übertragen Sie den proximalen und distalen Teil des Dünndarms (und ggf. des Dickdarms) getrennt auf die Röhren. Halten Sie die Röhren auf Eis, während Sie den Darm zusätzlicher Mäuse sezieren. Sammeln Sie alle Darmteile eines Wurfs zusammen in der gleichen Röhre.
HINWEIS: Ein Wurf hat in der Regel 6-10 Föten. Der Darm aller Föten muss kombiniert werden. Diese Menge sollte ausreichen, um 4-8 Brunnen mit Organoiden zu ergeben, in einer 48-Well-Platte, pro Darmteil. - Fahren Sie mit der organoiden Isolierung fort, wie zuvor beschrieben11. Kurz gesagt, Darmstücke mit eiskaltem PBS waschen, mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 30 Minuten bei 4 °C brüten, die Krypten vom Gewebe trennen, indem sie die Stücke mit eiskaltem PBS + 10% fetalem Kalbsserum (FCS) harsch waschen, mit einem 70-m-Zellsieb filtern und Zentrifuge die Krypten bei 150 x g für 5 min bei 4 °C sammeln.
- Platte 4 bis 8 Brunnen mit Krypten in extrazellulärem Matrixgel, je nach Pelletgröße, in einer warmen 48-Well-Platte. Verwenden Sie 20 L Krypten, die pro Brunnen in extrazellulärem Matrixgel ausgesetzt sind. Extrazelluläres Matrixgel 10 min in einem 37 °C-Inkubator erstarren lassen.
HINWEIS: Wenn man bedenkt, dass nur 40% bis 50% der isolierten Krypten Organoide bilden, zielen Sie auf eine Dichte von 250 bis 300 Organoiden pro Brunnen. Fügen Sie zunächst weniger extrazelluläres Matrixgel als erforderlich hinzu. Schauen Sie unter das Mikroskop, nachdem Sie den ersten Brunnen plattiert haben, um zu analysieren, ob die Dichte der isolierten Krypten ideal ist. Falls erforderlich, fügen Sie mehr extrazelluläres Matrixgel hinzu. - In der Zwischenzeit ENR-Medium vorbereiten: 14 ml Advanced Dulbecco es Modified Eagle Medium/Ham es F-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (ergänzt mit 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES) 1x, L-Glutamin 0,01 M und 0,2 U/ml Penicillin/Streptomycin), 4 ml Noggin-konditionierte Medien, 2 ml Rspondin-konditionierte Medien, 400 l B27-Beilage 1x, 200 L N2-Ergänzung 1x, 50 l mit 1,25 mM n-Acetylcystein, 20 l mit 0,05 g/ml Epidermal-Wachstumsfaktor (EGF).
HINWEIS: Bei der Kultivierung von Kolonorganoiden, Ergänzung mit 50% Wnt konditionierte Medien. - Fügen Sie 250 l ENR-Medium pro Bohrgut hinzu.
2. Kultivierung von fetalen Organoiden
- Wechseln Medium der Kulturen 3 mal pro Woche. Die Reifung der Organoide wird nach 1 Monat Kultur erreicht.
- Zählen Sie an Tag 3 nach jedem Durchgang die Anzahl der Sphäroide und Organoide mit einem optischen Mikroskop. Quantifizieren Sie mindestens 3 Brunnen pro Zustand und alle Organoide in jedem Brunnen vorhanden.
HINWEIS: Die Anzahl der Sphäroide verringert sich mit der Zeit, während die Anzahl der Organoide zunimmt (Abbildung 2). - Durchdieorganoide einmal pro Woche durch mechanische Dissoziation, wie unten beschrieben.
- Entfernen Sie Medium und fügen Sie 1 ml eiskalte Advanced DMEM/F12 1:1 +++. Sammeln Sie alle extrazellulären Matrixgel mit Organoiden in einem 15 ml Rohr. Verwenden Sie eine 200-L-Spitze auf einer 1000-L-Filterspitze und Pipette 20-mal nach oben und unten, um die Organoide zu stören.
- Zentrifuge bei 150 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 20 l extrazellulärem Matrixgel pro Brunnen wieder auf. In der Regel können fetale Organoide im Verhältnis 1:2 erweitert werden.
- Lassen Sie extrazelluläre Matrix-Gel für 5-10 min erstarren. Fügen Sie 250 l ENR-Medium pro Brunnen hinzu.
3. Reifungsanalyse auf RNA- und Proteinebene
- Analysieren Sie die Kultur alle 3 Tage nach jeder Passage für einen Zeitraum von 1 Monat (d. h. die Zeit, in der die vollständige Reifung erreicht wird) (Abbildung 3).
HINWEIS: Fetale Organoidkultur ist dynamisch (Film 1) und um Variationen von der normalen Regeneration von Organoiden nach mechanischer Störung zu vermeiden, ist es notwendig, immer Proben am selben Tag nach der Passage zu sammeln. -
RNA-Isolierung
- Sammeln Sie 3 Brunnen von Organoiden mit 200 L RNA-Lyse-Puffer für jeden gut ergänzt mit 2 l von .-Mercaptoethanol. Nach Zugabe von RNA-Lysepuffer +-Mercaptoethanol in den Brunnen stellen Sie sicher, dass alle extrazellulären Matrixgel mit Organoiden in ein RNase-freies 1,5 ml-Rohr übertragen werden.
- Vortex kräftig und halten Sie bei -80 °C für nicht länger als 1 Monat. Isolieren Sie RNA mit handelsüblichen Kieselsäure-Spin-Säulen-Kits.
- Um die RNA-Qualität zu erhöhen, fügen Sie nach dem Waschen Schritte 500 l 80% EtOH hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Säule invertieren. Zentrifuge für 2 min bei 11.000 x g, um die Säule vollständig zu trocknen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Innenseite des Deckels des Rohres mit dem 80% EtOH zu waschen, indem Sie das Rohr drei- bis fünfmal auf den Kopf streichen, um alle Spuren von Guanidinthiocyanat loszuwerden. - Um die RNA-Ausbeute zu erhöhen, warten Sie 1-2 min nach dem Auftragen von RNase-freiem Wasser vor der Zentrifuge. Re-elute RNA durch Auftragen des ersten Durchflusseluats auf die Säule ein zweites Mal.
HINWEIS: Die isolierte RNA-Qualität ist ausreichend für den Einsatz in der genomweiten Expressionsanalyse. Überprüfen Sie, ob die RNA-Integritätsnummer über 8 liegt.
-
Proteinisolation
- Sammeln Sie 5 Brunnen von Organoiden mit 250 l eiskalte Zell-Recovery-Lösung in einem 15 ml Rohr. Inkubieren Sie für mindestens 30 min auf Eis, um das extrazelluläre Matrixgel aufzulösen (dies reduziert den Proteinbeitrag von extrazellulärem Matrixgel).
- Mit eiskaltem PBS waschen. Fügen Sie 250 L Zelllysepuffer hinzu und lagern Sie bei -80 °C.
HINWEIS: Nach der Beschallung können Proben verwendet werden, um Enzymaktivität zu erkennen oder für Western Blots.
-
Immunostaining
- Sammeln Sie 2 Brunnen von Organoiden mit 250 l eiskalte Zell-Recovery-Lösung in einem 15 ml Rohr. Inkubieren Sie für mindestens 30 min auf Eis, um das extrazelluläre Matrixgel aufzulösen (dies reduziert den Färbungshintergrund). Mit eiskaltem PBS waschen.
- Fixieren Sie die Organoide mit 500 l von 4% Paraformaldegyde (PFA) für 1 h bei 4 °C. Mit eiskaltem PBS waschen. Fahren Sie zur ganzorganoiden Immunfluoreszenz oder zur Paraffineinbettung nach den veröffentlichten Protokollen12fort.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff, um die Organoide zu handhaben. Dadurch wird eine Störung der Struktur vermieden.
4. Wirkung des extrinsischen Faktors (Beispiel Dexamethason) auf den organoiden Reifungsprozess
- Am ersten Tag der Kultur, fügen Sie 0.01M Dexamethason zu den Organoiden. Inkubieren Sie die Organoide mit Dexamethason während des ganzen Monats der Kultur durch Zugabe von neuen Dexamethason jedes Mal, wenn Medium geändert wird.
- Genexpressionsanalyse
- Isolieren Sie RNA wie oben beschrieben. Synthetisieren Sie gleichzeitig cDNA aller zu vergleichenden (behandelten und unbehandelten) Proben. Fahren Sie mit der bevorzugten qRTPCR-Methode fort.
- Verwenden Sie GeNorm, um die beiden stabilsten Referenzgene jedes Mal zu identifizieren, wenn eine neue Behandlung an den fetalen Organoiden verwendet wird. Verwenden Sie den geometrischen Mittelwert der beiden ausgewählten Referenzgene für relative Expressionsberechnungen.
HINWEIS: Vorschläge von Referenzgenen, die auf fetale Organoide der Maus getestet werden sollen: Cyclophilin, Gapdh, 'actin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib und Tbp. - Um zu untersuchen, wie sich ein bestimmter extrinsischer Faktor auf die postnatale fetale Reifung der Maus auswirkt, sollten alle folgenden Gene untersucht werden.
- Prüfen Sie, ob die fetalen Marker Laktase (Lct), Argininosuccinat-Synthase 1 (Ass1), B-Lymphozyten-induziertes Reifungsprotein 1 (Blimp-1) und neonataler Fc-Rezeptor (FcRn) in den ersten zwei Wochen der Kultur an Expression abnehmen und für die verbleibende Kulturzeit fehlen (Abbildung 4C). Analysieren Sie, ob dieses Muster geändert wurde.
- Prüfen Sie, ob erwachsene Marker Sucrase-Isomaltase (Sis), Arginase 2 (Arg2), Trehalase (Treh) und Lysozym (Lyz) Nach zwei Wochen Kulturanwert an Ausdruckszunahme ansetzen (Abbildung 4D). Analysieren Sie, ob dieses Muster durch den externen Faktor geändert wird.
HINWEIS: Dexamethason ist ein externer Faktor, der die Reifung der fetalen Organoide beschleunigen kann und kann als positiv in allen Experimenten verwendet werden, um andere extrinsische Faktoren zu testen.
- Enzymaktivitätsanalyse
- Isolieren Sie Dasprotein wie oben beschrieben. Nachweis der Intestinal-Disaccharidase-Aktivität nach den von Dahlqvist und Messer veröffentlichten Protokollen13,14.
- 0,625 M Maleic-Puffer pH 6.0 vorbereiten (3 Monate bei 4 °C aufbewahren). Mit diesem Puffer 0,05 M Lactose vorbereiten (p-Hydroxymercuribenzoat-Natrium als Stabilisator hinzufügen, um die lysosomale p-Galactosidase-Aktivität zu hemmen); 0,05 M Maltose; 0,05 M Saccharose und 0,05 M Trehalose.
HINWEIS: Alle diese Lösungen können für 5 Tage bei 4 °C aufbewahrt werden. Bleiben Sie auf Eis, während Sie den Assay vorbereiten. - Bereiten Sie Assay-Standards durch Verdünnung von 5,56 M Glukoselösung mit Reinstwasser vor, um Lösungen mit den folgenden Konzentrationen zu erhalten: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 M und 0,025 M.
HINWEIS: Lösung stabil für mindestens 3 Monate bei 4 °C. - Inkubieren in einer 96-Well-Platte für 60 min bei 37 °C:
- 30 l organoides Lysat mit 30 l Laktose
- 30 l organoides Lysat mit 30 l Saccharose
- 30 l des zehnfach verdünnten organoiden Lysats mit 30 l Maltose
- 30 l fünfmal verdünntes organoides Lysat mit 30 l Trehalase
- 30 l unverdünntes organoides Lysat mit 30 l Maleinsäure, als Probenhintergrund
- 30 l von jedem Glukosestandard
- 30 l Reinstwasser, als Rohling
- 30 l Positivkontrolle (Optimierung der Verdünnung; lysiertes fetales Darmgewebe kann als Kontrolle für die Laktaseaktivität verwendet werden, während lysiertes adultes Darmgewebe als Kontrolle für Sucrase, Maltase und Trehalase verwendet werden kann)
HINWEIS: Die Verdünnung von Proben sollte mit Zelllysepuffer erfolgen. Halten Sie die Proben und die Platte auf Eis, während Sie den Test vorbereiten. - Um die Glukosemenge zu bestimmen, die von den im organoiden Lysat nach der Inkubation mit ihren jeweiligen Substraten vorhandenen Enzymen produziert wird, fügen Sie schnell 200 l PGO-Farblösung hinzu und messen die Absorption bei 450 nm alle 5 min für 30 min bei 37 °C.
HINWEIS: Machen Sie PGO-Farben-Lösung frisch. Verwenden Sie 10 U/ml Glukoseoxidase, 2 U/ml Peroxidase und 7,88 mmol/L O-Dianisidin in 0,5mol/L Tris-HCl Puffer bei pH 7,0. Die Lösung sollte bei Raumtemperatur sein, wenn sie der Platte zugesetzt wird. - Berechnen Sie die Aktivität nach Glukosestandard und korrigieren Sie die Gesamtmenge des Proteins (bestimmt durch Bicinchoninsäure-Assay (BCA)). Die Enzymaktivität sollte als "M Glucose/G-Protein"-Min-1 (Abbildung 5B)exprimiert werden.
HINWEIS: Messen Sie die Arginaseaktivität mit einem handelsüblichen Arginase-Aktivitäts-Assay-Kit.
Representative Results
Verlängerte Kultur der fetalen Darmepithelzellen
Das Protokoll zur Nachahmung des Säugens-zu-Enaning-Übergangs in vitro hängt vom korrekten Umgang mit fetalen Organoiden während längerer Kultur ab. Proximale und distale Darm isoliert von E18-E20 Maus Föten werden getrennt, wie in (Abbildung 1). Bei der Isolierung werden Epithelzellen in extrazellulären Matrix-Gelkuppeln gesät (Abbildung 2). Es dauert in der Regel vier Passagen und etwa 28-30 Tage Kultur für fetale Organoide, um in den Erwachsenenzustand zu reifen. Während dieser Zeit können Zellen in verschiedenen Reifestadien gesammelt werden (Abbildung 3).
Repräsentative nachgelagerte Analyse des Säugens-zu-Entwöhnungs-Übergangs in vitro
Um zu bestätigen, dass isolierte fetale Organoide deutlich proximal oder distal sind, vergleichen Sie den Expressionsgrad von proximalen Markern Ein geschnittenes Domänenfamilienmitglied 2 (Onecut2) und GATA-Bindungsprotein 4 (Gata4) und distale Marker Fettsäurebindungsprotein 6 (Fabp6) und Guanylate Cyclase Activator 2A (Guca2a) zwischen proximalen und distalen Organoidkulturen (Abbildung 4A,B). Der Saugen-zu-En-Übergang in vitro kann von zwei Genen gruppen überwacht werden: fetal (Abbildung 4C) und Adult Marker (Abbildung 4D). Fetale Marker sollten im Laufe der Kultur allmählich abnehmen, während der Ausdruck von erwachsenen Markern allmählich zunehmen sollte (Abbildung 4C,D).
Verwendung des extrinsischen Faktors als Modifikator des Saugens-zu-Entwöhnungsübergangs in vitro
In diesem Protokoll dexamethason ein synthetisches Glukokortikoid, wurde als Beispiel für extrinsischen Faktor in der Lage, Säuerung-zu-Entwöhnung Übergang in vitro zu modifizieren verwendet. Repräsentative Daten in Abbildung 5 deuten darauf hin, dass die Auswirkungen extrinsischer Faktoren am besten durch mehrere Assays bestimmt werden können, da sie nicht unbedingt genomisch sein sollten. Beispielsweise werden bei Sucrase-Isomaltase sowohl die RNA- als auch die Proteinexpression mit Dexamethason induziert (Abbildung 5A), während die Trehalase-Expression nur auf Proteinebene verändert wird. (Abbildung 5B).
Abbildung 1: Isolierung des fetalen Dünndarms der Maus. (A) Foto von seziertem und gestrecktem fetalem Darm, einschließlich Magen, proximaler und distaler Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm. Schwarze Linie zeigt an, wo Darm geschnitten werden sollte, um den proximalen und den distalen Dünndarm zu teilen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative mikroskopische Bilder der proximalen und distalen fetalen Organoidkultur an Tag 3, Tag 17 und Tag 28 der Kultur. Alle Bilder wurden an Tag 3 nach der Passage erhalten und zeigen den Rückgang der Anzahl der Sphäroide Überstunden. Maßstabsleiste: 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: Repräsentatives Video, das die Dynamik der fetalen Organoidkultur zeigt, vom 4. bis 6. Tag der Kultur. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Abbildung 3: Schematische Darstellung der organoiden Sammlung zur Analyse der Darmreifung im Laufe der Zeit. Proximale und distale fetale Organoidkulturen sollten einen Monat lang kultiviert und jede Woche durchgesieben werden. Proben für die Reifungsanalyse sollten 3 Tage nach der Isolation und alle 3 Tage nach jeder Passage gesammeltwerden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative qRTPCRs von Darmreifungsmarkern in proximalen und distalen fetalen Organoiden. (A) Die proximalen Marker Onecut2 und Gata4 werden hauptsächlich in der proximalen Organoidkultur ausgedrückt, während (B) distale Marker Fabp6 und Guca2a meist in der distalen Organoidkultur zum Ausdruck kommen. (C) Fetalmarker Lct, Ass1, Blimp-1 und FcRn verringern und (D) Erwachsene Marker Sis, Arg2, Treh und Lyz nehmen im Laufe der Zeit sowohl in proximalen als auch in distalen organoiden Kulturen zu. Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Externe Sexamethason kann die Reifung von fetalen Organoiden modulieren. (A) Die Genexpression des fetalen Markers Blimp-1 wird an Tag 12 der Kultur in Dexamethason behandelten Organoiden im Vergleich zu Kontrollorganoiden verringert, während sowohl die Genexpression (B) als auch die Enzymaktivität (C) des erwachsenen Markers Sucrase-Isomaltase (Sis) erhöht sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von spätfetalen Darmorganoiden für längere Zeit, um den Säugen-zu-Entwöhnungsübergang in vitro nachzuahmen. Der Reifeprozess entspricht dem Tempo in vivo und wird nach einem Monat in der Kultur abgeschlossen. Die nachgelagerte Analyse dieser Kultur mit quantitativen RNA- und Proteintechniken wird detailliert durchgeführt.
In diesem Protokoll werden primäre Darmzellen aus E18-E20-Mausembryonen verwendet. Die Entwicklungsphase der primären Mauszellen, die zur Erzeugung von Organoiden für dieses Protokoll verwendet werden, ist besonders wichtig. Die Verwendung einer früheren Entwicklungsphase führt zur Erzeugung von Darmsphäroiden, die ihre spezifische fetale Genexpression über einen längeren Zeitraum mit begrenztem Übergang zu erwachsenen Organoiden15,16beibehalten. Nur späte fetale Sphäroide sind in der Lage, zu erwachsenen Organoiden in vitro10zu übertragen. Um das Zeitfenster in Bezug auf die Auswirkungen extrinsischer Faktoren auf die Darmreifung zu maximieren, werden Darm aus dem späten fetalen Stadium empfohlen und nicht Der Darm von geborenen Welpen, die Mikroben und Muttermilch ausgesetzt wurden. Es wird berichtet, dass bestimmte bakterielle Metaboliten und Milchbestandteile als Modifikatoren des Reifungsprozesses wirken können17.
Um genügend Zellmengen zu erhalten, um die Kultur einen Monat lang aufrechtzuerhalten, um die gesamte Reifung von der Geburt bis zum Erwachsenenalter zu untersuchen und gleichzeitig die Proben für nachgelagerte Analysen zu sammeln, sollten Die Därme von 6-8 Embryonen als Ausgangsmaterial verwendet werden. Es wird bevorzugt, Embryonen aus dem gleichen Entwicklungsstadium zur Erzeugung der Kultur zu verwenden. Wir empfehlen nicht, verschiedene Würfe zu bündeln, da leichte Unterschiede im Entwicklungsstadium die Expression der Reifungsgene beeinflussen können.
Das hier beschriebene Protokoll berücksichtigt die organoide Erzeugung aus dem proximalen und distalen Dünndarm, um Entwicklungsmerkmale verschiedener Darmsegmente aufrechtzuerhalten. Alternativ kann der ganze Darm verwendet werden, um die Gesamtreifung in Bezug auf die Erhöhung/Abnahme-Expression der spezifischen Marker zu untersuchen. Im letzteren Fall könnten weniger Embryonen verwendet werden, um Darmzellen für die Startkultur zu isolieren.
Dieses Protokoll wird mit dreidimensionalen organoiden Kulturen entwickelt. Da Organoide dynamisches Wachstum in der Kultur erfahren, ist es wichtig, Proben für nachgelagerte Analysen gleichzeitig nach dem Passieren zu sammeln. In diesem Protokoll haben wir Tag 3 nach der Passage ausgewählt, da es die mittlere Zeit zwischen zwei Splits darstellt, bei denen Organoide robuste Knospen und wenig bis gar keinen Zelltod enthalten. Ein alternativer Zeitpunkt nach der Passierung kann verwendet werden, sollte jedoch während des gesamten Experiments konsistent sein. Wir empfehlen nicht, Organoide für mehr als 7 Tage nach einer Passage zu wachsen, da die Zunahme der Todeszellen im organoiden Lumen die Ergebnisse beeinflussen kann.
In unseren Experimenten haben wir Dexamethason als Beispiel für einen extrinsischen Faktor verwendet, der gezeigt und am besten in der Literatur untersucht wird, um die Darmreifung in vivo9,18zu beschleunigen. Dexamethason übt seine Wirkung sowohl über genomische als auch über nicht-genomische Wege aus. Beispielsweise kann auf dem Niveau der genomischen Regulation ein frühreifer Anstieg des Sis mRNA-Spiegels beobachtet werden. Auf nicht-genomischer Ebene beobachten wir Veränderungen in der Aktivität von Verdauungsenzymen wie Trehalase. Beide entsprechen den beschriebenen spezifischen Aspekten von Dexamethason bei der Sucrase-Genaktivierung und nicht-genomischen aktivierungswirkung auf darm-bürstenförmige Niffsenzyme, die in vivo19beobachtet wurden. Die Tatsache, dass extrinsische Faktoren, wie synthetische Glukokortikoide, bestimmte Aspekte des Säugens-zu-Entwöhnungs-Übergangs in der Organoidkultur modulieren können, ähnlich wie in vivo beschrieben, stellt die Maus fetale Darmorganoide als Modell für die Untersuchung verschiedener Arten von Modulatoren der Entartung weiter her.
Obwohl die morphologische Reifung des menschlichen Darmepithels im Alter von 22 Wochen in der Gebärmutter abgeschlossen ist, reift die Darmbarrierefunktion bis zur Kindheit in enger Beziehung mit der Art der Fütterung, der Entwicklung von Mikrobiota und Immunantwort. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe in diesen Entwicklungsstadien liegt der Translationswert des in vitro murinen Modells in der Möglichkeit von Hochdurchsatz-Bildschirmen von Faktoren, die in der Lage sind, die Darmreifung zu modulieren, ein Prozess, der unter Säugetiere.
Im Hinblick auf die Tierethik in der Forschung kann dieses Modell zur Verfeinerung von Tierversuchen beitragen, da es keine Eingriffe an Tieren umfasst. Die Anzahl der Tiere kann weiter reduziert werden, indem Forschungsfragen auf ein oder zwei Kulturpunkte umgestaltet werden, die das Testen mehrerer Komponenten innerhalb einer Kultur ermöglichen.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->Die Autoren erklären nichts zu verraten.
Acknowledgments
nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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