Summary
Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.
Abstract
Um bom equilíbrio de quiescência, auto-renovação e diferenciação é fundamental para preservar a piscina de células-tronco hematopoiéticas (HSC) e manter a produção ao longo da vida de todas as células sanguíneas maduras. Nos últimos anos, o metabolismo celular emergiu como um regulador crucial da função hsc e destino. Nós demonstramos previamente que a modulação do metabolismo mitocondrial influencia o destino de HSC. Especificamente, ao desacoplado quimicamente a cadeia de transporte de elétrons, fomos capazes de manter a função HSC em condições culturais que normalmente induzem a diferenciação rápida. No entanto, limitar os números do HSC muitas vezes impede o uso de ensaios padrão para medir o metabolismo do HSC e, portanto, prever sua função. Aqui, relatamos um ensaio de citometria de fluxo simples que permite a medição confiável do potencial da membrana mitocondrial e massa mitocondrial em células escassas, como HSCs. Discutimos o isolamento de HSCs da medula óssea do rato e a medição da massa mitocondrial e da cultura pós-vivo potencial de membrana. Como exemplo, mostramos a modulação desses parâmetros em HSCs por meio de tratamento com modulador metabólico. Além disso, ampliamos a aplicação dessa metodologia sobre células T derivadas do sangue periférico humano e linfocitos infiltrados de tumores humanos (TILs), mostrando diferenças dramáticas em seus perfis mitocondriais, possivelmente refletindo diferentes células T Funcionalidade. Acreditamos que este ensaio pode ser empregado em exames para identificar moduladores do metabolismo mitocondrial em vários tipos de células em diferentes contextos.
Introduction
As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são uma pequena população de células que residem na medula óssea, garantindo a produção sanguínea e a homeostase ao longo da vida útil de um organismo. HSCs mediar este processo, dando origem a progenitores que, por sua vez, produzem linhagens de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente através de várias rodadas de divisão celular e passos de diferenciação bem orquestrada1. É importante ressaltar que os HSCs produzem sua energia através da glicolíse anaeróbica. Em contraste, progenitores hematopoiéticos mais comprometidos e ativos mudam seu metabolismo para o metabolismo mitocondrial2,3,4. Acredita-se que este estado metabólico distinto proteja os HSCs de danos celulares infligidos por espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas por mitocôndrias ativas, mantendo assim sua função in vivo de longo prazo5,6,7,8. A medição direta do estado metabólico do HSC é desafiadora e muitas vezes baixa taxa de rendimento devido aos seus números limitados. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em citometria de fluxo para a medição robusta do potencial da membrana mitocondrial (Δ Já demonstramos anteriormente que o baixo Δém é um marcador funcional de boa-fé de HSCs altamente purificados9 e moduladores metabólicos capazes de reduzir a função de MSCs9,10. Aqui propomos o uso de nosso método no perfil mitocondrial de HSCs como estratégia para identificar novas moléculas capazes de melhorar o potencial de reconstituição do sangue a longo prazo dos HSCs.
Como exemplo, demonstramos que este ensaio mede de forma confiável a redução do HSC Δm após a exposição à vitamina B3 analógico nicotinamida ribosía (NR). Assim, em nosso estudo recentemente publicado, demonstramos que a NR melhora fortemente o pós-transplante de recuperação do sangue em ambos os sistemas de camundongos de camundongos e de camundongos humanizados, melhorando diretamente o tronco hematopoiético e as funções progenitoras10. A capacidade de tais moduladores metabólicos é de grande valor clínico, considerando que uma taxa de mortalidade de 25% está ligada ao atraso no sangue e recuperação imunológica em pacientes pós-transplantados11,12.
Além disso, fornecemos evidências de que essa metodologia pode ser aplicada para a caracterização do perfil metabólico e função das células T humanas. Nos últimos anos, o desenvolvimento da terapia celular adotiva (ACT) usando tumor autólogo infiltrando linfócitos (TILs) tornou-se a abordagem mais eficaz para certos tipos de câncer avançado com prognóstico extremamente desfavorável (por exemplo, melanoma metastático, onde >50% dos pacientes respondem ao tratamento e até 24% dos pacientes têm regressão completa)13. No entanto, TILs que abrigam atividade antitumoral suficiente são difíceis de gerar14. A proliferação extensa e estimulação que as TILs sofrem durante a expansão ex vivo causam exaustão e senescência das células T que prejudicam drasticamente a resposta antitumoral de células T15. Importante, a capacidade antitumoral dos TILs é lig firmemente a seu metabolismo16,17 e as aproximações visadas modular o metabolismo com a inibição do caminho de PI3K/Akt produziram resultados encorajadores18,19. Por esta razão, comparamos o Δ, de células T derivadas de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e TILs de operários do paciente, e mostramos que as células T derivadas de PBMC menos diferenciadas têm menor massa de δe e mitocondrial em comparação com TILs terminalmente diferenciadas.
Nós imaginamos que este ensaio pode ser usado para identificar os moduladores metabólicos novos que melhoram a função da pilha de HSC e de T através da modulação de Δ.
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Protocol
Todos os experimentos descritos no manuscrito seguem as diretrizes de nossa instituição e foram realizados de acordo com a lei suíça para experimentação animal (Autorização: VD3194) e para pesquisas envolvendo amostras humanas (Protocolo: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Extração hematopoiética de células-tronco
- Compre ratos C57BL6/J do tipo selvagem e mantenha-os na casa animal no mínimo uma semana para reduzir o esforço transporte-associado.
- No dia do experimento, eutanásia o mouse usando asfixia CO2.
- Pulverizar o rato com 70% de etanol para esterilizar a pele e abrir o rato na barriga usando ferramentas cirúrgicas padrão, como tesouras de dissecação e fórceps, para cortar os ossos do fêmur e tíbia das pernas traseiras.
- Retire os músculos ligados ao fêmur, tíbia e a pélvis usando uma toalha de papel macia e coloque os ossos limpos em um tubo de 50 mL contendo PBS com 1 mM EDTA (buffer) no gelo.
- Pulverizar um almofariz e pilão com 70% de etanol e colocá-lo em um capuz de cultura celular. Esterilizá-lo com UV por 30 minutos. Pós esterilização enxaguar a argamassa e pilão com tampão para remover vestígios de etanol.
- Coloque os ossos limpos com algum buffer (~ 10 mL) na argamassa e esmagá-los suavemente para obter a medula óssea para fora em suspensão. Agora, recolher a suspensão celular e passá-lo através de um filtro de célula de 70 μm em um tubo de 50 mL para obter uma única suspensão celular.
- Repita o passo 1.6 até que toda a medula óssea tenha sido extraída e os detritos ósseos fiquem brancos.
- Coloque o tubo de 50 mL (s) contendo a suspensão de célula única medula óssea em uma centrífuga. Executar a centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C para pelotas das células.
- Enquanto isso, prepare 10 mL de 1x RBC lysis buffer em água destilada autocllavada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm.
- Recolher o tubo de amostra da centrífuga e decantar o supernatant. Pipeta o tampão de lyse 1x RBC(Tabela de Materiais)na pelota celular. Desalojar a pelota e preparar uma solução homogênea por pipetting cima e para baixo algumas vezes. Permita que o tubo esteja à temperatura ambiente por 1-2 min para a lyse RBC ocorrer. Pare o processo de lyse enchendo o tubo com o buffer.
- Coloque o tubo em uma centrífuga e gire a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota adicionando 10 mL de buffer e filtre a solução em um novo tubo de 50 mL através de um filtro de célula de 70 μm para remover os detritos devido à lyse RBC.
- Centrífuga do tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 500 μL de buffer.
- Retire um alíquot de 100 μL e mantenha-se em um tubo separado de 1,5 mL. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos de esgotamento da linhagem de biotina do kit de enriquecimento progenitor(Mesa de Materiais)aos 450 μL restantes de suspensão celular. Incubar a 4 °C em uma coqueteleira por 15 min.
- Adicione 15 mL de buffer e centrífuga o tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 460 μL de buffer. Retire um alíquot de 10 μL e mantenha-se em um tubo separado de 1,5 mL.
- Adicione 50 μL de contas magnéticas de streptavidin do kit de enriquecimento de progenitor(Tabela de Materiais),à suspensão celular restante de 450 μL. Incubar a 4 °C em uma coqueteleira por 15 min.
- Adicione 15 mL de buffer e centrífuga o tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 5 mL de buffer e transfira a solução para um tubo de 15 mL.
- Leve o tubo para um separador de células automatizado(Tabela de Materiais). Executar um programa de lavagem para enxaguar e preparar a tubulação do separador celular. Coloque a amostra e dois tubos de coleta no suporte do tubo. Realizar a separação usando o programa"Esgotar". Colete as frações positivas e negativas do separador de células automatizado uma vez que a corrida tenha terminado.
Nota: Na ausência de um separador automático de células, os usuários podem usar colunas magnéticas manuais e ímãs correspondentes, de acordo com o manual do usuário. Os usuários devem ter em mente que o processo de separação manual é mais lento do que o automatizado. Além disso, as colunas manuais são mais propensas a entupimento. Portanto, os usuários são aconselhados a diluir a amostra e carregar na coluna lentamente. - Descarte a fração positiva. Encha o tubo de fração negativa com tampão. Centrífuga do tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos em 1 mL de solução de volume final e os controles de cor única em 200 μL de solução de volume final, conforme descrito na Tabela de Materiais e tabela 1.
Nota: Se o TMRM e a mancha mitocondrial fluorescente verde devem ser combinados com a coloração do marcador da pilha de haste, substitua então CD150-PE com CD150-PEcy5 e vermelho de Streptavidin-Tx com laranja de Streptavidin-Pac. - Recolher o tubo de amostra da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 1 mL de mistura de anticorpos. Adicione 10 μL de células (a partir do passo 1.13) em cada um dos tubos de controle de cor única (exceto linhagem). Adicione 10 μL de células (a partir do passo 1.14) no tubo de cor única linhagem.
- Incubar a amostra e tubos de controle de cor única a 4 °C em uma coqueteleira por 45 minutos. Cubra o balde de gelo com uma tampa ou folha de alumínio.
- Encha todos os tubos com tampão e centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a amostra em 1 mL de controles de buffer e de cor única em 200 μL de buffer.
- Transfira a amostra e os controles de cor única para tubos FACS topos do filtro 5 mL.
- Leve os tubos para a máquina de classificação e classificar a população HSC (estratégia gating na Figura 1A)em tubos de 1,5 mL contendo 400 μL de meio de expansão de células-tronco.
2. Ex Vivo Cultura de Células-Tronco Hematopoiéticas
- Coletar tubos contendo células classificadas (ver seção 1 para extração celular). Centrífuga s os tubos a 300 x g por 5 min a 4 °C. Remova delicadamente a maioria do supernatant sem desalojar a pelota e deixe 50-80 μL sobre a pelota da pilha. Isso minimiza a perda celular.
- Resuspende a pelota celular na expansão de células-tronco média a um volume final dependente do número de condições a serem testadas (contagem de 100 μL por poço/condição de cultura).
- Prepare um meio de cultura 2x contendo fator de expansão de células-tronco, fator de células-tronco (200 ng/mL), ligand FLT3 (4 ng/mL) e antibióticos de pen-strep (1%) (2x médio basal; Tabela de Materiais).
- Pegue uma cultura de tecido estéril tratado 96 U-bottom placa bem(Tabela de Materiais)e identificar os poços onde as células serão cultivadas (design da placa na Figura 1B).
Nota: Os usuários são aconselhados a evitar poços marginais, pois são mais suscetíveis à evaporação. - Coloque 100 μL de 2x médio basal previamente preparado na etapa 2.3 nestes poços. Na NR marcada bem adicionar 2 μL de uma solução 100x NR(Tabela de Materiais). Reabastecer NR a cada 24 h.
Nota: O reabastecimento é específico para a NR. Outros moduladores metabólicos podem ou não precisar de reposição. - Semente 100 μL das pilhas preparadas na etapa 2.2 sobre os poços que contêm o meio basal de 2x. Neste experimento, o número de HSCs semeados por poço estava entre 800-1.000 células.
- Prepare cinco poços extras contendo 2x médio basal. Em cada uma delas adiciona 100.000 células inteiras de medula óssea (do passo 1.13) resuspendidas em 100 μL de meio de expansão de células-tronco para serem usadas como controles de coloração para análise de citometria pós-cultura.
Nota: Se os usuários quiserem combinar marcadores de células-tronco e marcadores mitocondriais para análise pós-cultura, recomenda-se, adicionalmente, classificar a população de progenitores (células Ckit+ ou células LKSCD150). Semente estes progenitores classificados nos poços de controle de coloração para análise de citometria pós-cultura. Prepare um poço por única cor de mancha. - Coloque 200 μL de água autocllavada em todos os poços circundantes para reduzir a evaporação de poços contendo células. Deixe a placa intacta em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2 para a duração do período de cultura (72 h). Retire a placa para reabastecer NR a cada 24 h e colocá-lo de volta na incubadora.
3. Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana
- Ao final do período cultural, prepare uma solução 100x de TMRM (20 μM) e Mitotracker verde (10 μM) (mancha fluorescente verde) no meio de expansão de células-tronco(Tabela de Materiais).
- Adicione 2 μL da solução TMRM 100x e 2 μL de 100x solução de mancha fluorescente verde em cada um dos poços de teste. Adicione 2 μL de 100x TMRM no poço de controle TMRM. Adicione 2 μL de 100x mancha fluorescente verde no controle Mitotracker bem. Coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2 para 45 min. Cubra a parte superior da placa com papel alumínio.
Nota: Um controle adicional com Verapamil (inibidor da bomba ABC) pode ser preparado se a bomba ABC mediado dintileflux tineflux precisa ser testado. Para isso, adicione 50 μM Verapamil em um dos poços de teste 1 h antes de colorir para TMRM e mancha fluorescente verde. - Retire a placa da incubadora e centrífuga-lo a 300 x g por 5 min. Invert a placa para remover o supernatant. Adicione 200 μL de buffer FACS padrão (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrífuga a placa em 300 x g por 5 min. Retire o supernatant. Repita este passo de lavagem 3x. Os usuários devem garantir que a placa seja sempre coberta com papel alumínio, para fornecer exposição mínima à luz direta.
Nota: Se os usuários precisarem combinar a coloração mitocondrial com coloração de células-tronco, a amostra precisará ser incubada com uma mistura de anticorpos de todos os marcadores de células-tronco e os controles de cor única precisarão ser manchados com anticorpos individuais separadamente a 4 °C por 30-45 min.
Nota: Em todas as etapas os usuários devem manter a placa coberta com folha de alumínio. Os usuários devem notar que esta etapa de coloração adicional e etapas de lavagem subsequentes podem resultar em perda adicional de células. - Resuspenda as células em 200 μL de buffer FACS e transfira para tubos FACS.
- Executar as amostras no citometro de fluxo (ver Figura 1). Os tubos de cor simples que contêm WBM incluem: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) mancha fluorescente verde (FITC); (5) Mancha total (PE e FITC).
- Primeiro adquirir os controles de cor única para configurar a máquina. Use o software de execução na máquina para calcular a compensação. Uma vez aplicada uma compensação, adquirir a amostra HSC e registrar tantos eventos quanto possível.
Nota: Se as células-tronco e marcadores mitocondriais são combinados, os usuários precisam ser particularmente cuidadosos com a compensação entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) e Sca-1 (APC). Além disso, as amostras devem ser executadas imediatamente após a coloração. - Exportar os arquivos FACS do citometro e analisar os dados em um software de análise(Tabela de Materiais).
- Para a análise, abra o arquivo sobre o software de análise. Usando FSC-A e SSC-A gating identificar a população celular. Identifique as anotações nos portões ao lado antes de traçar a fração negativa da DAPI (células vivas). No portão celular ao vivo fazer um lote de contorno no TMRM e canal mancha fluorescente verde para medir Δ 'm e massa, respectivamente (Figura 2A). Exportar a intensidade média da fluorescência (MFI) destes dois canais na porta viva da pilha.
- A porta baixa de TMRM é ajustada baseada na população do ombro na canaleta de TMRM. O controle de cor única TMRM pode ser usado para identificar essa população de ombro para definir o portão. Exportar a proporção de células vivas no portão baixo TMRM em seu controle e amostras de teste para conspirar.
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Representative Results
Na Figura 1 mostramos a estratégia de gating para o isolamento das células-tronco hematopoiéticas da medula óssea do rato e o layout da placa para sua cultura ex vivo. A Figura 1A mostra a identificação da fração de linfócitos na trama do SSC-A/FSC-A. Os doublets foram removidos na porta do singlet seguida pela identificação de pilhas vivas pela ausência do sinal de DAPI. A população de LKS, definida pela linhagem- Sca1+cKit+, foi identificada. Esta população é conhecida por conter células-tronco e progenitoras. HSCs formam cerca de 5-10% das células da população LKS e foram identificados por gating para CD150+CD48- população. A Figura 1B representa o layout da placa de 96 poços para a cultura ex vivo. HSCs classificados foram banhados em diferentes condições de cultura: Neste caso, controle e NR complementou as condições culturais. As células inteiras da medula óssea também foram banhadas como controles de cor única, conforme descrito no protocolo. É importante encher todos os poços circundantes com água para evitar a evaporação dos meios de comunicação a partir de poços contendo células. Além disso, como mencionado anteriormente, poços marginais foram evitados para a cultura celular por serem mais suscetíveis à evaporação.
A figura 2 mostra a medida do potencial da membrana mitocondrial (Δ'm) e massa em HSCs pós-cultura. Figura 2A mostra parcelas representativas dos níveis de TMRM (acima) e mancha mitocondrial fluorescente verde (abaixo) em HSCs cultivadas no controle e NR condições complementadas. O tratamento de NR mostrou um aumento desobstruído nabaixa população de TMRM. A Figura 2B mostra a quantificação de três amostras independentes. O tratamento de NR aumentou significativamente a proporção de pilhas na portabaixa de TMRM e mostrou uma diminuição significativa da intensidade da fluorescência de TMRM. A massa mitocondrial (representada pela intensidade da fluorescência verde) não mudou após a suplementação de NR. Além disso, combinamos a coloração do marcador de células-tronco com a cultura pós-coloração mitocondrial. A Figura 2C mostra a estratégia de gating para identificar HSCs a partir de linhagem negativa e populações LKS pós cultura nas duas condições de cultura. O TMRM e o perfil verde fluorescente da mancha mitocondrial destes HSCs fechados são vistos na figura 2D. A exposição ao NR mostrou um aumento significativo nabaixa população do TMRM do %e uma diminuição significativa na intensidade da fluorescência de TMRM em HSCs fechados. O sinal verde fluorescente do verde do verde da mancha permaneceu inalterado nas duas circunstâncias.
A figura 3 mostra a medição do potencial da membrana mitocondrial (Δ'm) e a massa em diferentes células T humanas: células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) CD4+ e célulasT CD8 +, bem como CD4+ e CD8+ tumor infiltrando linfócitos (TILs) após o protocolo de expansão rápida (REP). Figura 3A mostra parcelas representativas dos níveis de TMRM (acima) e níveis de mancha mitocondrial verde-fluorescente (abaixo) de circular (PBMC) e tumor-infiltrando (TIL) CD4+ e CD8+ células T. TILs mostrou um aumento claro no TMRM e verde fluorescente sinal de mancha mitocondrial em comparação com as células T circulando. Figura 3B mostra a quantificação MFI de TMRM e manchas mitocondriais fluorescentes verdes. Os TILs exibiram tmrm mais alto e sinais de coloração mitocondrial fluorescente verde em comparação com as células T derivadas do PBMC. Estes dados indicam que os TILs têm um perfil metabólico distinto com maior δe m e massa mitocondrial.
Figura 1: Isolamento e cultura das células-tronco hematopoiéticas. (A)Estratégia de gating para o isolamento das células-tronco hematopoiéticas (HSCs) com base em marcadores de superfície celular. HSCs foram identificados como linhagem- Sca1+ cKit+ (LKS) CD150+CD48-. (B)Design de 96 prato swell colocar na cultura. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2:Perfis mitocondriais de HSCs. (A)enredo de contorno FACS mostrando HSCs pós cultura em condições basais ou NR complementadas. Os perfis de TMRM (acima) e mancha mitocondrial fluorescente verde (Mitotracker) (abaixo) são mostrados. (B) Quantificação de TMRM e sinal de mancha mitocondrial fluorescente verde. A suplementação de NR resultou em uma diminuição no perfil de TMRM ao manter o sinal fluorescente verde da mancha mitocondrial. (C)Parcelas contorno mostrando a identificação da população HSC no controle e NR condições complementadas pós cultura. (D)Parcelas de contorno e quantificação de TMRM e sinal de mancha mitocondrial fluorescente verde em HSCs phenotípico pós cultura. A suplementação de NR reduziu o sinal de TMRM, enquanto o sinal de mancha mitocondrial fluorescente verde permaneceu inalterado em HSCs. Teste t do aluno ***p < 0,001, ** p < 0,01, não significativo > 0,05, barras de erro = SEM. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura3: Perfis mitocondriais de PBMCs humanos e TILs: (A)ENREDO de contorno FACS mostrando CD4+ e CD8+ recém-isolado de PBMCs ou CD4 e CD8 derivados de tumores + pós-REP (protocolo de expansão rápida). Os perfis de TMRM (acima) e mancha mitocondrial fluorescente verde (Mitotracker) (abaixo) são mostrados. (B) Quantificação de TMRM e sinal de mancha mitocondrial fluorescente verde. As TILs apresentaram menor atividade mitocondrial e massa. Estudante t-teste ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, não significativo > 0.05, barras de erro = SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| S.No | Nome do anticorpo | Diluição de trabalho |
| 1 | Streptavidin Tx vermelho | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Para ser usado somente se as células-tronco e marcadores mitocondriais combinados. | ||
| 6 | Laranja de Streptavidin Pac | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tabela 1: Diluições de anticorpos.
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Discussion
Uma regulamentação rigorosa da função do HSC é importante para manter a hematopoiese estável durante a vida de um organismo. Como vários outros tipos de células no corpo, um componente-chave que contribui para a regulação da função HSC é o metabolismo celular. Estudos anteriores do nosso laboratório9 e outros2,3 implicaram a importância das mitocôndrias na manutenção de um estado metabólico distinto em HSCs. Devido ao número extremamente baixo de HSCs isolados da medula óssea da urina, é difícil analisá-los através de ensaios metabólicos padrão (por exemplo, consumo de oxigênio com SeaHorse). Com base em nosso trabalho anterior, padronizamos um ensaio de citometria de fluxo simples para medir de forma confiável o potencial de massa mitocondrial e membrana (uma leitura indireta para a atividade) em um baixo número de células (ou seja, HSCs). Este ensaio permite a medição em pilhas vivas sem comprometer sua viabilidade9,fazendo as disponíveis para todos os ensaios funcionais downstream (tais como CFUs ou transplantações da medula) que os usuários podem desejar executar. Prevemos que este ensaio está sendo empregado em experimentos de triagem, permitindo uma leitura rápida sobre o perfil mitocondrial de HSCs de diferentes origens genéticas ou modelos de nocaute. Importante, nosso ensaio pode ser combinado com a coloração cfse para ter uma leitura dupla sobre a proliferação de HSC e seu perfil mitocondrial9,10, permitindo a análise do destino metabólico de dividir HSCs. Considerando que é um procedimento de coloração difícil e estamos trabalhando com um baixo número de células (HSCs), é importante que pós centrífuga os usuários sempre deixam 80-100 μL de solução nos tubos, a fim de minimizar a perda celular. Além disso, durante todos os passos de coloração pós os tubos ou placas devem ser protegidos da luz, seja cobrindo-os em papel alumínio ou trabalhando em um ambiente de pouca luz. Se os usuários decidirem combinar a mancha de HSC com corantes mitocondriais, eles devem verificar se a compensação é realizada corretamente, especialmente entre TMRM (PE), PeCy5 e APC.
Importante, uma publicação recente questiona o uso de corantes mitocondriais em HSCs porque eles podem ser suscetíveis a bomba efflux. Estes estudos relatam que a maioria dos compartimentos hematopoiéticos primitivos têm um maior número de mitocôndrias em comparação com seus progenitores comprometidos20. Em nossa experiência, o uso de modelos genéticos de camundongos (camundongos mito eGFP21),métodos de coloração de tinuoso-independentemitos (anticorpo TOM20), análise QPCR suporta a noção de que compartimentos hematopoiéticos mais primitivos têm menor teor mitocondrial10. Acreditamos que mais estudos têm de ser realizados para esclarecer essa discrepância no campo.
Paralelamente, demonstramos que o uso de perfis mitocondriais poderia ser explorado para determinar a aptidão metabólica das TILs humanas e desenvolver estratégias metabólicas destinadas a restaurar a função das células T esgotadas. Na verdade, as células T isoladas de PBMCs apresentam menor atividade mitocondrial (TMRM) e massa (Mitotracker Green), enquanto células T mais esgotadas, como TILs, têm maior atividade mitocondrial e massa, sugerindo uma possível reprogramação metabólica ocorrendo durante a exaustão. Assim, estudos publicados anteriores demonstraram que as células T de memória semelhantes a células-tronco (TSCM), células T com maior persistência e capazes de resposta a longo prazo de recall, têm menor δe e tratamentos visando o metabolismo das células T podem influenciar fortemente sua função22,23.
Finalmente, acreditamos que nossa abordagem pode ser uma ferramenta valiosa para a identificação de novos compostos que podem reparar HSCs disfuncionais (por exemplo, envelhecimento ou malignidades hematológicas) restaurando sua aptidão mitocondrial.
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Disclosures
Alguns elementos deste trabalho foram apresentados como pedido P1828EP00 ao Instituto Europeu de Patentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Unil Flow Cytometry Core Facility pelo seu apoio, especialmente o Dr. Romain Bedel. Este trabalho foi apoiado pela concessão da fundação Kristian Gerhard Jebsen para n.v e o.n.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
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