نقدم هنا طريقه قويه ومفصله لتحليل ديناميات البولية المجهرية في الخلايا المتزامنة في طليعة باستخدام الخلية الحية الغزل القرص المجهري المجهر ومعالجه الصور المستندة إلى matlab.
ونحن نقدم وصفا لتعديل طريقه محدده لتحديد ديناميات البولية الصغيرة في الخلايا الحية. ويستند البروتوكول علي التعبير عن علامة المشفرة وراثيا لغايات ايجابيه من الأنابيب الدقيقة (EB3 الموسومة مع بروتين الفلورسنت tdTomato) وعاليه السرعة, عاليه الدقة, التصوير الخلوي الحي باستخدام القرص الدوار المجهر المجهري. يتم تحقيق تزامن دوره الخلية وزيادة كثافة الأنابيب الدقيقة من خلال تثبيط الانفصال الوسطي في الخلايا المتصوقيه ، ويتم اجراء تحليل النمو باستخدام برنامج المسار المفتوح المصدر. ان استخدام بروتين فلوري مشرق واحمر اللون ، بالاشتراك مع طاقة الليزر المنخفضة ووقت التعرض المنخفض المطلوب لدوران القرص المجهري يقلل من السمية الضوئية واحتمال القطع الاثريه المستحثة ضوئيا. وهذا يسمح بتصوير عدد أكبر من الخلايا في نفس الاعداد مع الحفاظ علي الخلايا في وسط النمو في ظل ظروف الثقافة القياسية. ونظرا لان التحليل يتم بطريقه تلقائية خاضعه للاشراف ، فان النتائج قويه إحصائيا وقابله للتكرار.
الأنابيب المجهرية (MTs) هي هياكل ديناميكية للغاية وجدت في جميع الخلايا الحقيقية النواة تقريبا وفي بعض البكتيريا1. مع [اكتين] وخيوط متوسطه, ينحت هم [ستوسيكلتون]2,3. تقسيم الخلية4، جزيء النقل5، الضرب الصواري6، والإحساس من البيئة المحيطة من خلال الابتدائية هدب7، السمع (kinocilium)8،9، الاجنه10،11،12، الغزو وورم خبيث13،14، وحتى تكوين الذاكرة15،16،17،18، والعديد من العمليات الأخرى تعتمد أساسا علي MTs. سيكون من المستحيل مشاركه الmts في جميع هذه الاحداث دون قدرتها الملحوظة علي التحول بسرعة بين النمو (البلمره) والانكماش (التحلل). وصفت هذه الخاصية بأنها عدم الاستقرار الديناميكي19. يتم تغيير MT ديناميستي في العديد من الحالات المرضية20،21،22. التالي ، فان تحديد طبيعة هذه الخاصية يمكن ان يساعد علي فهم أليات المرض وبعد ذلك معالجتها.
وقد وضعت قائمه طويلة من الأساليب لتحليل ديناميات MT, معظمها تستند إلى تقنيات التصوير23. في البداية ، تم استخدام المجاهر الضوئية واسعه المجال لمراقبه تشكيل أنابيب البوليمرات في المختبر24. الاكتشاف من [ند-كندينغ] ([ب])-بروتينات ان يجمع في [مت] [بلس-نهاي] والتطوير الطرق إلى فلوريسسينتلي تسميه بروتينات جعل هو يمكن ان يلاحظ التصرف ال [MTs] مباشره في [ليفينغ سل] مع مجال واسعه و [كونككلر] مجاهر مجهر25,26,27. واحده [آيب-بروتين] [ند-بيندينغ] بروتين 3 (EB3)28; من خلال التعبير المفرط وتتبع EB3 تنصهر إلى بروتين الفلورسنت ، يمكن تحديد معدلات التجميع MT plus-نهاية29،30.
وكثيرا ما يستخدم المجهر الضوئي الليزر البؤري المجهري (CLSM) لمتابعه ديناميات MT. ومع ذلك ، فان تقنيه التصوير هذه تشكل خطرا عاليا من السمية الضوئية والرشح الضوئي ، وهما عمليتان غير مرغوب فيهما للخلايا الحية وعينات التصوير الخافتة31. من أجل الحصول علي نسبه أفضل من الاشاره إلى الضوضاء ، يجب ان تكون قوه الليزر ومده التعرض عاليه بما يكفي في حين لا تضر العينات ، وهذا يتطلب التضحية بالقرار في مقابل السرعة. بديل مناسب ل CLSM هو الغزل القرص المجهر32. ويستند هذا الأسلوب التصوير علي استخدام القرص Nipkow33، والذي يتكون من قرص متحرك تحمل مجموعه من الثقوب ، ويعمل اي ما يعادل إلى العديد من المجاهر CLS التصوير نفس العينة في وقت واحد34. ولذلك ، فان الضوء من الليزر سوف تضيء عده مناطق في العينة في وقت واحد ولكن الحفاظ علي الطبيعة المحورية. التالي ، فان قرص Nipkow يسمح بالحصول علي صور مشابهه ل CLSM ولكن بشكل أسرع وباستخدام طاقة ليزر اقل. تم تحسين القرص Nipkow كذلك من قبل Yokogawa الكهربائية, التي أدخلت القرص الثاني مع مجموعه من العدسات الدقيقة علي ذلك ان الضوء المباشر بشكل فردي في ثقب الدبوس المعنية, مزيد من الحد من السمية الضوئية والتصوير الضوئي35. وهكذا, الغزل القرص الليزر المسح المجهري أصبحت طريقه الاختيار للتصوير الخلية الحية, ويجعل من الممكن الحصول علي الصور مع ارتفاع نسبه الاشاره إلى الضوضاء في سرعه عاليه31,36, وهو أمر حاسم لحل الإشارات مثل تلك من نهايات MT سريعة النمو.
ديناميات MT تختلف مؤقتا. علي سبيل المثال ، ميتيك MTs هي أكثر ديناميكية من تلك المرحلة البينية37،38. المثل ، لوحظت الاختلافات في معدل النمو والانكماش حتى داخل نفس مرحله دوره الخلية ، مثل انقسام39،40. لذلك ، لتجنب جمع البيانات الزائفة ، يجب ان يقتصر قياس ديناميات MT علي اطار زمني ضيق اثناء دوره الخلية. علي سبيل المثال ، يمكن تحقيق قياس ديناميات MT في طليعة عن طريق علاج الخلايا مع dimethylenastron (DME) ، وهو التناظرية monastrol الذي يمنع المحرك كينيسن Eg541 ويمنع تشكيل المغزل القطبين القطبية42. تثبيط الخلايا في طليعة مع مثبطات Eg5 DME وغيرها من المشتقات monastrol لا يؤثر علي mt ديناميات43،44،45، مما يجعل من DME أداه مفيده لدراسة ديناميات mt علي حد سواء في الخلايا الثابتة والحية44.
هنا نحن الجمع بين طريقه تحليل ديناميات MT في الخلايا بروتافاز الموصوفة من قبل Ertych وآخرون44 مع التصوير المزدوج القرص الغزل. يسمح هذا الأسلوب قياس ديناميات MT في الخلايا prometase التي تم جمعها من المستوي البؤري واحد مع معدل التصوير اعلي ، ولكن دون الرشح الضوئي والحد الأدنى من السمية الضوئية. وعلاوة علي ذلك ، وكمراسل الفلورسنت ، ونحن نستخدم البروتينات الفلورية ديمر الطماطم (tdtomato) التي تحسنت السطوع والاستقرار الضوئي بالمقارنة مع البروتين الفلوري الأخضر (egfp) ومتحمس مع انخفاض الطاقة الخفيفة46. لذلك ، يتطلب tdTomato طاقة ليزر اقل للاثاره واقل سميه ضوئيه. الإجمال ، فاننا نقوم بتحسين الطريقة من خلال الحد من السمية الضوئية وتحسين الدقة والمعالجة اللاحقة المطلوبة لتحليل ديناميات MT. بالاضافه إلى ذلك ، نقوم بإنشاء أساس للتعديلات المستقبلية للأسلوب عن طريق الجمع بينها وبين تقنيات التزامن الأخرى.
هنا ، ونحن وصف تعديلا للأسلوب الذي انشاته Ertych وآخرون44. مع العديد من التعديلات الأخرى ، ونحن الجمع بين هذه التقنية من تحليل ديناميات MT مع المزدوج الغزل القرص التصوير البؤري. استخدام القرص الدوار المزدوج يحسن دقه النامية MTs مع الحد من السمية الضوئية36. كما نقوم بتقلي…
The authors have nothing to disclose.
ونشكر أعضاء مرفق المجهر الضوئي ، معهد ماكس بلانك للطب التجريبي ، علي مشورتهم المتخصصة ودعمهم.
Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
DPBS | Gibco | 14190-094 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |