Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

Summary

Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l’elaborazione delle immagini basata su MATLAB.

Abstract

Descriviamo una modifica di un metodo stabilito per determinare la dinamica dei microtubuli nelle cellule viventi. Il protocollo si basa sull’espressione di un marcatore geneticamente codificato per le estremità positive dei microtubuli (EB3 etichettato con proteina fluorescente tdTomato) e dell’imaging ad alta velocità, ad alta risoluzione e a cellule vive utilizzando la microscopia confocale del disco rotante. La sincronizzazione del ciclo cellulare e l’aumento della densità dei microtubuli si ottengono inibendo la separazione centrosomica nelle cellule mitotiche e l’analisi della crescita viene eseguita utilizzando il software U-Track open-source. L’uso di una proteina fluorescente luminosa e rossa, in combinazione con la minore potenza laser e la riduzione del tempo di esposizione necessaria per la microscopia su disco rotante riduce la fototossicità e la probabilità di artefatti indotti dalla luce. Ciò consente di imaging di un maggior numero di cellule nella stessa preparazione, mantenendo le cellule in un mezzo di crescita in condizioni di coltura standard. Poiché l’analisi viene eseguita in modo automatico supervisionato, i risultati sono statisticamente robusti e riproducibili.

Introduction

I microtubuli (MT) sono strutture altamente dinamiche che si trovano praticamente in tutte le cellule eucariotiche e in alcuni batteri¹. Insieme ad actin e filamenti intermedi, scolpiscono il citoscheletro^2,3. Divisione cellulare⁴, trasporto molecolare⁵, flagellir battendo⁶, la sensazione dell’ambiente circostante attraverso il ciglio primario⁷, udito (kinocio)^8,9, embriogenesi^10,11,12, invasione e metastasi^13,14, e anche la formazione della memoria^15,16,17,18, e molti altri processi si basano principalmente sulle MT. La partecipazione degli MT in tutti questi eventi sarebbe impossibile senza la loro notevole capacità di passare rapidamente dalla crescita (polimerizzazione) al restringimento (depolimerizzazione). Questa proprietà è descritta come instabilità dinamica¹⁹. La dinamicità MT è alterata in molte condizioni patologiche^20,21,22. Quindi, determinare la natura di questa proprietà può aiutare a comprendere i meccanismi della malattia e successivamente il loro trattamento.

È stata sviluppata una lunga lista di metodi per l’analisi delle dinamiche MT, la maggior parte dei quali si basa noto su tecniche di imaging²³. Inizialmente, sono stati utilizzati microscopi a luce a campo largo per osservare la formazione di polimeri di tubulina in vitro²⁴. La scoperta di proteine di legame finale (EB) che si raccolgono a MT plus-end e lo sviluppo di metodi per etichettare fluorescenti proteine ha permesso di osservare il comportamento delle MT direttamente nelle cellule viventi con ampi campi e microscopi a confocalizzazione della confraternita^25,26,27. Una proteina EB è la proteina di legame finale 3 (EB3)²⁸; sovraesprimendo e tracciando EB3 fuso a una proteina fluorescente, MT più tassi di assemblaggio end possono essere determinati^29,30.

La microscopia a fluorescenza a scansione laser confocale (CLSM) viene spesso utilizzata per seguire la dinamica MT. Tuttavia, questa tecnica di imaging rappresenta un alto rischio di fototossicità e fotosbiancamento, due processi indesiderati per l’imaging campione di cellule vive e dim³¹. Al fine di ottenere un migliore rapporto segnale-rumore, la potenza del laser e la durata dell’esposizione dovrebbero essere sufficientemente elevate senza danneggiare i campioni, e questo richiede di sacrificare la risoluzione in cambio di velocità. Un’alternativa adatta al CLSM è la microscopia a disco rotante³². Questa modalità di imaging si basa sull’uso di un disco Nipkow³³, che consiste in un disco in movimento recante una serie di fori, e funziona in modo equivalente a molti microscopi CLS che immaginino lo stesso campione contemporaneamente³⁴. Pertanto, la luce del laser illuminerà diverse regioni del campione contemporaneamente, ma manterrà la natura confocale. Il disco Nipkow, quindi, permette di ottenere immagini simili a CLSM ma più velocee e utilizzando meno potenza laser. Il disco Nipkow è stato ulteriormente migliorato da Yokogawa Electric, che ha introdotto un secondo disco con una serie di microlenti su di esso che dirigere individualmente la luce in un rispettivo foro stenopeico, riducendo ulteriormente la fototossicità e il fotosbiancamento³⁵. Così, la microscopia a scansione laser su disco rotante è diventata un metodo di scelta per l’imaging delle cellule vive, e permette di ottenere immagini con alto rapporto segnale-rumore ad alta velocità^31,36, che è fondamentale per risolvere segnali come quelli provenienti dalle estremità MT in rapida crescita.

Le dinamiche MT differiscono temporaneamente. Ad esempio, gli MT mitotici sono più dinamici di quelli interfase^37,38. Analogamente, sono state osservate differenze nel tasso di crescita e nel restringimento anche all’interno della stessa fase del ciclo cellulare, come la mitosi^39,40. Pertanto, per evitare la falsa raccolta dei dati, la misurazione delle dinamiche MT dovrebbe essere limitata a una stretta finestra di tempo durante il ciclo cellulare. Ad esempio, la misurazione della dinamica di MT nella prometafase può essere ottenuta trattando le cellule con dimetilnastronastron (DME), un analogo monastrolo che inibisce la cinematosina Eg5⁴¹ e impedisce la formazione del mandrino mitotico bipolare⁴². L’inibizione delle cellule alla prometafase con l’inibitore Di Eg5 DME e altri derivati monastrol non influisce sulla dinamica MT^43,44,45, che rende DME uno strumento utile per studiare la dinamica MT sia nelle cellule fisse che vive⁴⁴.

Qui combiniamo il metodo di analisi della dinamica MT nelle cellule prometafase descritto da Ertych et al.⁴⁴ con doppia imaging del disco rotante. Questo metodo consente di misurazione della dinamica MT nelle cellule prometaphase raccolte da un singolo piano focale con una maggiore frequenza di imaging, ma senza fotosbiancamento e fototossicità minima. Inoltre, come reporter fluorescente, utilizziamo proteine fluorescenti tomato (tdTomato) che hanno migliorato luminosità e fotostabilità rispetto alla proteina fluorescente verde (EGFP) ed è entusiasta di luce a bassa energia⁴⁶. Pertanto, tdTomato richiede meno potenza laser per l’eccitazione ed è meno fototossico. Complessivamente, miglioriamo ulteriormente il metodo riducendo la fototossicità e migliorando la risoluzione e post-elaborazione necessarie per l’analisi delle dinamiche MT. Inoltre, creiamo una base per le modifiche future del metodo combinandolo con altre tecniche di sincronizzazione.

Protocol

1. Semina delle cellule HeLa Preparare 2 mL di 5 soluzione fibronectina a 5 g/mL in salina tampobuffer di fosfato (PBS) e aggiungerne 450 l in ogni pozzetti di un coperchio 4 ben camerato (#1.5). Incubare lo scivolo per 15 min a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2. Risciacquare le celle HeLa in crescita asincrona con Dulbecco’s Phosped Buffered Saline (DPBS) e incubare con trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) per 5 min a 37 . Fermare la reazione enzimatica con l’aggiunta del Roswell Park Memoria…

Representative Results

Seguendo il protocollo descritto nella figura 1A, il plasmidp pEB3-tdTomato è stato espresso in modo temporaneo in celle HeLa in crescita asincrona. Le cellule sono state sincronizzate 48 h dopo la trasfezione a prometafase attraverso il trattamento DME(Figura 1B). Questo passaggio ha assicurato che la misurazione della dinamica MT è sempre stata eseguita nella stessa fase del ciclo cellulare. I filmati time-lapse sono stati ulteriormente elaborati e analizzat…

Discussion

Qui, descriviamo una modifica di un metodo stabilito per la prima volta da Ertych et al.⁴⁴. Insieme a diverse altre modifiche, combiniamo questa tecnica di analisi della dinamica MT con l’imaging confocale a doppio disco rotante. L’uso del doppio disco rotante migliora la risoluzione delle MT in crescita riducendo la fototossicità³⁶. Riduciamo ulteriormente il fotosbiancamento e i danni indotti dalla luce laser delle cellule passando a un reporter fluorescente a lunghezza …

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software