Summary
ここでは、生細胞紡糸ディスク共焦点顕微鏡法とMATLABベースの画像処理を用いてプロメタフェイズで同期した細胞における微小管ダイナミクス解析の堅牢かつ詳細な方法を提示する。
Abstract
生細胞における微小管ダイナミクスを決定するための確立された方法の改変について説明する。このプロトコルは、微小管(TdTomato蛍光タンパク質で標識されたEB3)の陽性端に対する遺伝的にコードされたマーカーの発現と、紡糸ディスク共焦点顕微鏡を用いた高速、高解像度、生細胞イメージングに基づいている。細胞周期同期と微小管の密度の増加は、有糸分裂細胞における遠心分離を阻害することによって達成され、そして成長の分析はオープンソースのU-Trackソフトウェアを用いて行われる。明るく赤ずれた蛍光タンパク質を使用すると、レーザーパワーが低く、スピンディスク顕微鏡検査に必要な露光時間が短縮され、光毒性や光誘起アーティファクトの確率が低下します。これにより、標準的な培養条件下で増殖培地中の細胞を維持しながら、同じ調製物でより多くの細胞をイメージングすることができます。解析は教師付き自動で実行されるため、結果は統計的に堅牢で再現可能です。
Introduction
微小管(MT)は、事実上すべての真核細胞およびいくつかの細菌1に見られる非常に動的な構造である。アクチンおよび中間フィラメントと共に、それらは細胞骨格2、3を彫刻する。細胞分裂4、分子輸送5、フラッラー打ち負かす6、原発性シリウム7を介した周囲環境の感覚、聴覚(キノチリウム)8、9、胚発生10、11、12、浸潤および転移13、14、さらには記憶形成15、16、17、そして、他の多くのプロセスは、主にMTに依存しています。このプロパティは、動的不安定性 19 として記述されます。MTの動的性は、多くの病理学的条件20、21、22で変化する。したがって、この特性の性質を決定することは、疾患のメカニズムとその後の治療を理解するのに役立ちます。
MTダイナミクス解析のための方法の長いリストが開発されており、そのほとんどはイメージング技術23に基づいています。当初、広視野光顕微鏡は、インビトロ24におけるチューブリンポリマーの形成を観察するために使用された。MTプラスエンドで集まるエンド結合(EB)タンパク質の発見と、タンパク質を蛍光標識する方法の開発により、広視野および共焦点蛍光顕微鏡25、26、27を有する生細胞におけるMTの挙動を直接観察することが可能となった。1つのEBタンパク質は、エンド結合タンパク質3(EB3)28である。蛍光タンパク質に融合したEB3を過剰発現および追跡することにより、MTプラスエンド組み立て率は29、30を決定することができる。
共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡(CLSM)は、MTダイナミクスに従うために頻繁に使用されます。しかしながら、この撮像技術は、光毒性および光脱色のリスクが高く、生細胞および薄暗い試料イメージング31に対する2つの望ましくないプロセスを有する。より良い信号対雑音比を得るためには、レーザーパワーと露光時間はサンプルにダメージを与えない状態で十分に高くする必要があり、速度と引き換えに解像度を犠牲にする必要があります。CLSMに代わる適切な代替手段は、回転ディスク顕微鏡32である。このイメージングモダリティは、ピンホールの配列を有する移動ディスクからなるニプコウディスク33の使用に基づいており、同じサンプルを同時に34個撮像する多くのCLS顕微鏡と同等に動作する。したがって、レーザーからの光は、同時にサンプル内のいくつかの領域を照らすが、共焦点性を保持します。したがって、Nipkowディスクは、CLSMに似た画像を取得できますが、より高速で、より少ないレーザーパワーを使用することができます。ニプコウディスクは、個別に光をそれぞれのピンホールに導くマイクロレンズの配列を持つ第2のディスクを導入した横川電機によってさらに改良され、光毒性と光脱色35をさらに低減しました。このように、紡糸ディスクレーザー走査顕微鏡は生細胞イメージングの選択肢となり、高速31、36で高い信号対雑音比の画像を得ることが可能となり、急速に成長するMT末端からの信号等の解決に不可欠である。
MT ダイナミクスは一時的に異なります。たとえば、有糸分裂性の M は、相間のM7、38よりも動的です。同様に、有糸分裂39、40などの同じ細胞周期期内においても増殖速度および収縮の違いが観察されている。したがって、誤ったデータ収集を避けるために、MTダイナミクスの測定は、細胞周期中の狭い時間枠に制限する必要があります。例えば、プロメタフェイズにおけるMTダイナミクスの測定は、モータキネシンEg541を阻害し、バイポーラ有糸状スピンドル42の形成を防止するモナストロル類似体であるジメチルエナストロン(DME)で細胞を処理することによって達成することができる。Eg5阻害剤DMEおよび他のモナストロル誘導体を有するプロメタフェイズにおける細胞の阻害は、MTダイナミクス43、44、45に影響を及ぼさない、これはDMEを固定細胞および生細胞44の両方でMTダイナミクスを研究するための有用なツールとなる。
ここでは、Ertych et al.44で説明したプロメタフェイズ細胞におけるMTダイナミクス解析の方法とデュアルスピニングディスクイメージングを組み合わせる。この方法は、光漂白および最小限の光毒性なしで、より高いイメージング速度を有する単一の焦点面から収集されたプロメタフェイズ細胞におけるMTダイナミクスの測定を可能にする。さらに、蛍光レポーターとして、緑色蛍光タンパク質(EGFP)に比べて明るさや光安定性が向上し、エネルギー光46を低くして励起されるタンデムダイマートマト蛍光タンパク質(tdTomato)を用いた。したがって、tdTomatoは励起のためのより少ないレーザーパワーを必要とし、より少ない光毒性です。全体として、光毒性を低減し、MTダイナミクス解析に必要な分解能と後処理を改善することで、この方法をさらに改善します。さらに、メソッドを他の同期手法と組み合わせることで、メソッドを将来変更するための基礎を作成します。
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Protocol
1. HeLa細胞の播種
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5μg/mLフィブロネクチン溶液の2mLを調製し、4ウェルチャンバーカバースリップ(#1.5)の各ウェルに450 μLを加えます。スライドを37°Cで15分間インキュベートし、5%CO2.
- リンスは、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩酸(DPBS)でHeLa細胞を非同期的に増殖させ、トリプシンEDTA(0.05%:0.02%;w:v)を37°Cで5分間インキュベートします。ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地を添加して、10%熱不活性化胎児胎児血清(FCS)を添加したトリプシン-EDTAの比率(v:v)で添加することにより酵素反応を停止します。
注:HeLa細胞は、37°Cおよび5%CO2で10%熱不活性化FCSを添加したRPMI 1640培地中に維持され、上述したように80〜90%の結合に達すると日常的に通過した。 - ノイバウアーチャンバーを使用して細胞濃度を決定します。セル懸濁液の50μLアリコートをトリパンブルーで1:1(v:v)比で混合し、再サスペンドし、懸濁液の10°Lをチャンバーに移します。4つの大きな正方形の中のトリパン青陰性細胞のみを数えます(詳細はPhelan et al.47を参照)。次の式を使用して、カウントされたセル番号からセル濃度を導出します。
- 細胞を300 x gで2分間遠心分離してペレット化し、1 x 106セル/mLを得るために新鮮なRPMI 1640で再サスペンドします。
- チャンバー付きカバースリップからフィブロネクチンを取り出し、DPBSでウェルを2回洗浄し、井戸あたり50,000細胞を種子します。
- 細胞と一緒にチャンバ入りのカバースリップをインキュベーターに戻し、37°Cと5%CO2で24時間成長させます。
2. HeLa細胞におけるpEB3-tdTomatoの発現
- 1.5 mLマイクロ遠心管を準備します。チューブごとに、トランスフェクションバッファ(水溶液中の合成物)でpEB3-tdTomato48を2μg希釈し、最終体積396μLにします。
- トランスフェクション試薬(非脂質、ポリエチレニミンを含む)を第1チューブに4μL添加し、直ちに10sのボルテックスを加える。
- マイクロ遠心分離機でチューブを短時間スピンダウンし、室温(RT)で10分間インキュベートします。
- インキュベーターから HeLa 細胞を取り除きます。ドロップワイズ、トランスフェクション混合物の100μLを4ウェルチャンバーカバースリップの各ウェルに加え、細胞をインキュベーターに戻す。
- 37°Cおよび5%CO2で4時間インキュベートした後、細胞を新鮮な増殖培地で補い、37°Cと5%CO2で少なくとも24時間インキュベートする。
注:細胞タイプごとにトランスフェクション条件を最適化する必要があります。式レベルは、単一の MT 成長端の識別を可能にするのに十分な低さである必要があります。あるいは、EB3-tdTomatoを安定して発現する細胞株を実験に使用することもできる。これは、同じ調製物49からの調製物間および細胞間のEB3-tdTomatoの発現レベルの変動性を低下させるであろう。
3. pEB3-tdTomato発現HeLa細胞の同期と生細胞イメージング
- フェノールレッドフリーダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)にジメチルエナストロン(DME)の2.5μM溶液を調製し、10%FCSおよび2mM L-グルタミンまたは代替グルタミン供給を補充します。
- チャンバ入りカバースリップの成長培地を2.5μM DMEを含む成長培地の500°Lに交換し、細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
- DMEによるインキュベーションを3.5時間行った後、細胞を顕微鏡に移し、チャンバカバースリップを37°Cおよび5%CO2で撮像するためのダークパネルを備えた環境室に取り付け、さらに全インキュベーション時間が4時間になるまでインキュベートする。
注:変動のない37°Cでの温度維持は、実験に不可欠です。 - 100x 1.49 N.A. オイル浸漬目的、二重紡糸ディスク共焦点システム、および焦点面の継続的なメンテナンスのための信頼性の高いオートフォーカスシステムを搭載した反転顕微鏡でタイムラプスイメージングを実行します。イメージング パラメータを次のように定義します。
注:電子乗算電荷結合デバイスカメラ(EM-CCD)を使用しています。- EB3-tdTomato励起の場合は、200ミリ秒の露光時間を持つ561 nmレーザーラインを使用します。4倍のバンドパス(405、488、561、640 nm)の二色ミラーと600/52 nmの発光フィルタを介して放出された光を収集します。
注:レーザーパワーは、画像の飽和を防ぐために、画像化されたセルごとに調整することができます。ここで与えられたすべてのタイムラプス映画では、レーザーパワーは5.3 mWに設定されました。 - プロフェーズの細胞を見つけ、単極有糸状スピンドルの中心に対応するZ平面に焦点を合わせます。ビニングなし、露出間の照明なしの合計1分にわたって0.5 sごとに画像を取得します。
- EB3-tdTomato励起の場合は、200ミリ秒の露光時間を持つ561 nmレーザーラインを使用します。4倍のバンドパス(405、488、561、640 nm)の二色ミラーと600/52 nmの発光フィルタを介して放出された光を収集します。
4. Uトラックv2.2.0を用いたMTダイナミクスの解析
- MTダイナミクスを解析するには、数値計算環境ソフトウェア(例えばMATLAB)が必要である。
注:ソフトウェアの基本的な理解は、分析のために十分です。包括的なヘルプ資料とチュートリアルは、開発者の Web サイト (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html) で入手できます。 - 「https://github.com/DanuserLab/u-track Readme_u-track.pdf」ファイル50、51、52に記載されている詳細な指示に従って、オープンソースのU-Track v2.2.0ソフトウェアをダウンロードしてインストールします。
- 数値解析ソフトウェアを起動し、サブフォルダを含む U-Track v2.2.0 フォルダをソフトウェア検索パスに追加します。
- コマンド ウィンドウから "movieSelectorGUI" を呼び出します。これにより、顕微鏡で画像取得ソフトウェアによって生成された生ファイルをインポートできるダイアログ ウィンドウが開きます (補足図 1、図 2、図 3、図 4)。
注:Uトラックソフトウェアは、他の画像データ形式と互換性があります。これは、異なるライフサイエンスデータ形式53を認識するバイオフォーマットを使用しています。 - 各イメージのサイズは、メタデータから自動的に読み取られます。目的の開口数 (この場合は 1.49) とイメージングに使用する時間間隔 (0.5 秒) を手動で入力します (補足図 1B)。さらに、励起波長、蛍光色素、露光時間に関する情報も提供できますが、さらなる分析には重要ではありません。
- すべての画像が読み込まれたら、「ムービーリストとして保存」を選択して、入力したタイムラプスシリーズをムービーリストとして保存します。ダイアログ ウィンドウの右側にある[U-Track]オプションを選択し、[続行]をクリックします (補足図 1C)。
注:値は HeLa セル用に最適化されます。別のセルラインに切り替える場合は、値を再度定義する必要があります。または、ソフトウェア開発者が推奨する設定を使用します。各パラメータとその定義方法の詳細な説明は、以前のバージョンのソフトウェアに付属の技術レポート plusTipTracker50にあります。 - ポップアップ ウィンドウで [マイクロチューブプラスエンド]を選択し、[ >OK」(補足図 1C) を押します。新しいダイアログ ウィンドウでは、検出、追跡、および追跡分析である分析の 3 つのステップ (補足図 1D)のパラメーターを決定できます。
- 手順 1 で [設定] を選択し、ドロップダウン メニューから検出方法として [彗星検出] を選択します (補足図 2B)。
- 新しいダイアログ ウィンドウから、ガウス フィルタと集水域セグメンテーションの違いのパラメータを次のように定義します (補足図 2C):検出に使用するマスク プロセス = なし;低パスガウス標準偏差 = 1ピクセル。ハイパスガウス標準偏差 = 3ピクセル。最小しきい値 = 3 標準偏差。しきい値ステップサイズ = 0.25 標準偏差。[すべてのムービーに設定を適用する]を選択し、[適用]を選択します。
- 手順 2 では、リンク、ギャップの終了、マージと分割、および Kalman フィルタ関数のパラメータは、ピンク、緑、青で強調表示された 3 つのステップで定義されます (補足図 3B)。これらの手順では、「マイクロチューブ・プラスエンド・ダイナミクス」を選択し、「設定」オプションから、補足図 3C-Eに示すように値を定義します。
- 次元に関する問題については、ドロップダウンメニューから「2」を選択します。[最大ギャップ] を使用して閉じる = 5 フレーム。最初のステップからのトラック セグメントの最小長 = 3 フレーム。前と同様に、[すべてのムービーに設定を適用]を選択し、[適用]をクリックします。
- 分析のステップ3では、検出されたMTトラックが分類される(補足図4)。トラック分析方法として、「微小管ダイナミクス分類」を選択し、補足図 4B,Cに示すように「設定」ボタンを使用してパラメータを定義します。その後、[すべてのムービーに設定を適用]ボックスを選択し、[適用]をクリックします。
- すべてのパラメータを定義したら、[コントロール パネル-U-Track]ウィンドウ (補足図 1D)で [すべてのムービーにチェック/チェックを適用]チェック ボックスをオンにし、[すべてのムービーを実行]ボックスをオンにして[実行]をクリックします。これにより、タイムラプスシリーズのMT解析が開始されます。
- ムービーの処理が完了すると、「ムービーが正常に処理されました」というメッセージが表示されます。「OK」を押してから、「保存」を押します。
- 今、数値解析ソフトウェアを終了しても安全です。ムービー処理の結果は、未加工ファイルが格納されているフォルダ内の m ファイルとしてサブフォルダ構造に格納されます。
MTダイナミクスの統計解析
- m ファイルを優先統計分析プログラムにインポートします。
注:この例では、まず標準スプレッドシートにファイルをインポートして読みやすくします。Mファイルには、異なるパラメータ(成長率、MTダイナミクスなど)の統計情報(中央値、平均、標準偏差)が含まれます。パラメータの詳細なリストは、以前のバージョンのソフトウェアで提供された技術レポートに記載されています。生成されたMファイルは、他のデータ処理ソフトウェアにインポートすることもできます。 - 「成長速度平均」パラメータを選択し、統計および表示用のテーブルにインポートします。新しいテーブルまたは同じグループ化されたテーブルとプロットの新しい列に、他のパラメータ("動的性"など)に関する情報を入力します。
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Representative Results
図1Aに概説された所定のプロトコルに続いて、pEB3-tdTomatoプラスミドは、非同期増殖HeLa細胞で一過性に発現した。細胞をDME処理を介してプロメタフェイズでトランスフェクションした後48時間同期させた(図1B)。このステップにより、MTダイナミクスの測定は常に細胞周期の同じ段階で行われました。タイムラプスムービーは、補足文書50、51 、52で説明されているように、U-Trackv2.2.0 でさらに処理および分析されました。プラスエンド結合タンパク質はMT成長相のみをトレースするが、U-Track v2.2.0は、順次成長相をリンクし、完全な軌道26、50を再構築することによって、休止および収縮事象に関する情報を推定する。このアルゴリズムは、Jaqaman et al.51によって記述された空間的および時間的にグローバルな追跡フレームワークに基づいています。
解析の感度と精度は、複数の解析パラメータに大きく依存することに注意してください。一例として、タイムラプスムービーはプロトコル(図1C、ビデオ1「前」、およびビデオ2「分析後」)に記載されているように分析され、得られた成長速度とダイナミクス(生涯にわたってギャップを含むトラックの集合的な変位)がそれぞれ図1E,Fにプロットされる(黒い円)。次いで、「最大ギャップ長」や「最大収縮率」などの解析50に大きく影響するように記載されたパラメータを、同じタイムラプス映画のセットに対して変更した(それぞれビデオ3および4)。成長速度と動的度の対応する値は、それぞれ赤い正方形と青い三角形として図 1E,Fに示されています。その結果得られた成長速度は深く影響を受けなかった。ただし、「最大ギャップ長」を変更した場合、動的性に対して得られた値は大きく異なり、「最大収縮率」を変更しても変わりません。図 1Dに示すように、3 つのケースすべてで MT サブトラックの検出も同様に堅牢でした。しかし、「最大ギャップ長」が15に設定されている場合、完全なMT軌道の再構築は主に影響を受けました(図1D、差し込み画像)。また、撮像条件がMT挙動に干渉しているかどうかを評価するために、タイムラプス系列の第1(1~61フレーム)と第2(61~121フレーム)半分を別々に分析し、対応する成長速度と動態値をそれぞれ比較した(図1G,H、)。予想通り、タイムラプスシリーズの2つの部分間に有意な差は検出されなかった。ビデオでは、プロフェーズで同期し、EB3-tdTomatoを発現する有糸分裂細胞のタイムラプス画像が与えられます(持続時間= 1分、間隔 = 0.5 s)。
図1:プロメタフェイズで同期されたHeLa細胞におけるMTダイナミクスの解析。(A) プロトコルの手順の概要。(B)単極有糸状紡錘のDME媒介形成の機構の概略表現。(C) 2 フレームごとに U-Track ソフトウェアで処理されたタイムラプスムービーの最初の 10 フレームのモンタージュ。MT成長の検出された軌道は赤でマークされます。(D)生画像ファイルの時系列投影とMT追跡後のプロトコル(「最適」)に記載の設定を用いて、「最大ギャップ長」または「最大収縮係数」のいずれかを変更する場合が与えられる。インセットは、成長(赤)、一時停止(水色)、収縮(黄色)、成長(緑)として再分類されたギャップ、およびギャップが一時停止(濃い青)イベントとして再分類された完全なMT軌道を表します。成長速度平均(E)と動的度 (F) 値が表示され、推奨される最適基準 (黒い円)、最大ギャップ長が 15 (赤い四角形)に設定された場合、または最大収縮係数が 1.0 (青い三角形) に設定された結果がプロットされます (n = 45 セル;平均 ± SEM;トゥッキーポスト ホック検定による一方向 ANOVA 分析)成長速度は、タイムラプスムービーの最初の(1~61フレーム)と2番目(61~121フレーム)の半分(n =45セル;平均±SEM;ウェルチ補正との対になっていないt検定)に対して、ダイナミクス(G)とダイナミクス(H)値が表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:分析前のプロメタフェーズセルの代表的なタイムラプス生画像。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ 2: U-Track ソフトウェアの推奨設定を使用して、ビデオ 1 のセル内の MT を検出および追跡します。説明した設定を使用してU-Track v2.2.0ソフトウェアで処理されたビデオ1の同じタイムラプス画像と、検出された成長トラックが赤色でマークされます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ 3: 「最大ギャップ長」の最適でない値を使用して、ビデオ 1 のセル内の MT の検出と追跡。ビデオ 1 の同じタイムラプス イメージは、以前と同じ設定を使用して U-Track v2.2.0 ソフトウェアで処理されましたが、「最大ギャップ長」は 15 に設定されています。残りのパラメータは変更されませんでした。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ 4: 「最大収縮係数」の最適でない値を使用して、ビデオ 1 のセル内の MT の検出と追跡。ビデオ 1 の同じタイムラプス イメージは、以前と同じ設定を使用して U-Track v2.2.0 ソフトウェアで処理されましたが、「最大収縮係数」は 1 に設定されています。残りのパラメータは変更されませんでした。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ5:細胞破片を持つセルのタイムラプスシリーズの例。分析の後、MT追跡中にソフトウェアによっていくつかの細胞破片も検出されました。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ 6: ビデオ 5 に対応する生データ。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ 7: EB3-tdTomato の高い表現を持つセルのタイムラプスシリーズの例。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ 8: ビデオ 7 に対応する生データ。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
補足図1:U-Trackソフトウェアを使用した解析のワークフロー(A) ソフトウェアが採用するステップの概略図。(B) タイムラプスファイルのインポート方法を示すバイオフォーマットインポータのスクリーンショット。(C) ファイルをアップロードした後、MT プラスエンド モジュールを使用して U トラックが選択されます。(D) 彗星検出、トラッキング、およびトラック分析の設定が定義されている U-Track のコントロール パネルのスクリーンショット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図2:分析の第1工程の説明、彗星検出。(A) アルゴリズムによって実行される主なイベントの概要。(B, C)ソフトウェアのスクリーンショットは、示された最適な値で与えられます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 3: 分析の 2 番目のステップの説明, 彗星の追跡.(A) アルゴリズムによって実行される主な手順の概要を示します。(B) 「トラッキング」パネルのスクリーンショットが表示されます。[最大ギャップクローズ]は[最大ギャップ長さ]に対応し、5 に設定されます。赤、緑、青の長方形で強調表示された 3 つのサブステップの追跡。(C,D,E)各サブステップに必要な数値がここに入力されます。[最大収縮係数]は、 (D) に示すように 1.5 に設定されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 4: 分析の最後のステップの説明、トラック分析。(A) 複合トラックの MT ダイナミクス分類と再分類は、このステップ中に実行されます。(B,C)トラック分析のスクリーンショットと対応する設定が表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、Ertychら44によって最初に確立された方法の改変について説明する。他のいくつかの変更と共に、MTダイナミクス解析のこの技術とデュアルスピニングディスク共焦点イメージングを組み合わせます。デュアルスピニングディスクの使用は、光毒性36を低減しながら、成長するMTの解像度を向上させます。さらに、より長波長の蛍光レポーターに切り替えることで、細胞の光脱色やレーザー光によるダメージを低減します。tdTomato蛍光タンパク質は、EGFP46に比べて光安定性と輝度の係数が高い。最後に、Mtダイナミクスの測定は、Uトラックによるフォローアップ解析の制限により、Zプレーンを1つだけに制限します。Uトラックソフトウェアは、XYZ軸50、51で蛍光標識されたMTチップを検出するように設計されています。したがって、Zスタックタイムラプスシリーズを取り、最大投影タイムラプスシリーズを作成すると、誤った結果が生成される傾向があります。異なるZ平面で検出され、同じ成長MTに属していない信号が最大投影でまとめられ、MT成長の誤った軌道が生じます。
ここで使用される同期プロトコルは、有糸分裂紡錘を単極構造に制限することによって高密度のMを誘導する。有糸分裂性のMは成長と収縮の段階を有する非常に動的な構造であり、それらの間の遷移で一時停止する19、54、55である。M の密度が高いため、一時停止イベントの検出に続いて収縮または成長が発生すると、追跡パラメータが正しく設定されていないと誤った結果が生じやすくなります。U-Trackソフトウェアトラッキングモジュールは、いわゆるサブトラック(継続的な成長のエピソード)を検出し、一時停止イベントが「ギャップ」と呼ばれる複合トラックとして分類します。Applegate et al. は、トラッキングとサブトラックリンク50に不可欠な2つのパラメータについて説明します。これらは「最大ギャップ長」と「最大収縮係数」です。後続のサブトラックが後続の時間ステップで MT の増加方向に再び現れる場合は、前方ギャップとして分類されます。一方、サブトラックが成長方向と反対に再び現れる場合は、後方ギャップに分類されます。[最大ギャップ長]は、前方ギャップと後方ギャップを検索するフレームの数を定義します。前述のように、有糸分裂性の高密度および性質上高い力学は限界を設定し、より小さい値を定義する必要があります。図 1Eに示すように、動的性が最も影響を受けます。ダイナミックは、グローバル寿命にわたるギャップを含むすべてのトラックの集合的な変位として計算されます。2 番目のパラメータである[最大収縮係数]は、動的性または成長速度にほとんど影響を与えがありません(図 1D,E)。
一般に、MT成長特性を研究する際には、撮像条件に細心の注意を払う必要があります。まず、MTは温度に非常に敏感であり、冷間成長媒体56、57、58、59にさらされると脱重合する。したがって、誤った結果の収集を避けるために、温度は実験全体を通して厳密に制御されるべきです。第2に、実験中に使用される培地のイオン組成物は、MT成長58、60に影響を及ぼし得る。例えば、カルシウムイオンへの曝露は、MTダイナミクスに異なる方法で影響を及ぼす 61,62.したがって、すべての実験で使用される成長培地の組成は同じであるべきである。同様に、解析のパラメータは一度定義し、すべての繰り返しに対して一定に維持する必要があります。さらに、分析後に生成されたタイムラプスムービーは目視で検査する必要があり、バックグラウンドノイズが誤検知を引き起こし(ビデオ5と6)、またはtdTomatoの高発現を伴い、MT成長チップの解像度が低い(ビデオ7と8)、さらなる統計分析から除外する必要があります。
近年、微端紡錘の格子光シート顕微鏡を2秒間隔で組み合わせることで、高度な画像処理と共に、3次元63、64におけるMT組み立て率の解析が可能である。これはCLSMに対して明らかな利点があるが、Uトラックで使用される戦略を第3次元26、50、63に拡大するなど、一般的な使用になる前にさらなる改善が必要となる。
ここで説明するMTダイナミクス検出のプロトコルは、薬物スクリーニングのための選択の方法であり得る。この方法は堅牢であり、手動で実行される解析と比較して人間の偏りをうまく取り除きます。ムービー処理の自動化により、各セル内の数千もの MT トラックの分析が可能になり、解析の統計的能力が向上します。さらに、この方法は、例えば、同期プロトコルを変更し、細胞周期の異なる相から細胞を得ることによって変更することができる。これは、例えば、相間および分裂細胞に対する効果を区別する必要がある場合に化学療法薬を標的とするMTをスクリーニングするための有用なツールであり得る。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
私たちは、彼らの専門家のアドバイスとサポートのために、光顕微鏡施設、マックスプランク実験医学研究所のメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
| DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
| Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
| jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
| EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
| Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium |
| µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
| Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
| Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100xC Oil |
| ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm | |
| Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier | |
| HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
| MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
| Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |
References
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