एकाधिकार ी माइटोटिक स्पिंडल में कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी द्वारा माइक्रोट्यूब्यूल डायनेमिक्स का मापन
Summary
यहां हम लाइव-सेल स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और मैटलैब-आधारित छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके प्रोमेटफेज में सिंक्रोनाइज्ड कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबबुल गतिशीलता विश्लेषण की एक मजबूत और विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
हम जीवित कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबबुल गतिशीलता निर्धारित करने के लिए एक स्थापित विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल माइक्रोट्यूब्यूल्स (टीडीटोमेटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए EB3) और हाई-स्पीड, हाई-रेजोल्यूशन, कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग के सकारात्मक सिरों के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मार्कर की अभिव्यक्ति पर आधारित है। सेल साइकिल सिंक्रोनाइजेशन और माइक्रोट्यूब्यूल के बढ़ते घनत्व को माइटोटिक कोशिकाओं में सेंट्रोसोमल अलगाव को बाधित करके प्राप्त किया जाता है, और ओपन-सोर्स यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विकास का विश्लेषण किया जाता है। कम लेजर पावर के संयोजन में एक उज्ज्वल और लाल-स्थानांतरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग और डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए आवश्यक कम एक्सपोजर समय फोटोटॉक्सिकिटी और प्रकाश-प्रेरित कलाकृतियों की संभावना को कम करता है। यह मानक संस्कृति की स्थिति के तहत एक विकास माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखते हुए एक ही तैयारी में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । क्योंकि विश्लेषण एक पर्यवेक्षित स्वचालित फैशन में किया जाता है, परिणाम सांख्यिकीय मजबूत और प्रजनन योग्य हैं ।
Introduction
माइक्रोट्यूबबुल (एमटी) अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं जो लगभग सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में और कुछ बैक्टीरिया1में पाई जाती हैं। ऐक्टिन और इंटरमीडिएट फिलामेंट्स के साथ मिलकर वे साइटोस्केलेटन2,3को मूर्तिकला देते हैं । सेल डिवीजन4, अणु परिवहन5,फ्लैगेलर बीटिंग6,प्राइमरी सिलियम7के माध्यम से आसपास के वातावरण की अनुभूति, श्रवण (किनोसिलियम),8,9, भ्रूणजनजी10,11,12,आक्रमण और मेटाटैसिस13,14,और यहां तक कि स्मृति गठन15,16,17,18, और कई अन्य प्रक्रियाएं मुख्य रूप से एमटी पर भरोसा करती हैं। इन सभी घटनाओं में एमटी की भागीदारी विकास (बहुलककरण) और सिकुड़न (डिपॉलीमराइजेशन) के बीच तेजी से स्विच करने की उनकी उल्लेखनीय क्षमता के बिना असंभव होगी। इस संपत्ति को गतिशील अस्थिरता19बताया गया है । एमटी गतिशीलता कई रोग स्थितियों में बदल जाती है20,21,22. इसलिए, इस संपत्ति की प्रकृति का निर्धारण रोग तंत्र और बाद में उनके उपचार को समझने में मदद कर सकता है।
एमटी गतिशीलता विश्लेषण के लिए तरीकों की एक लंबी सूची विकसित की गई है, जिनमें से अधिकांश इमेजिंगतकनीक23पर आधारित हैं। प्रारंभ में, विट्रो24में ट्यूबलिन पॉलिमर के गठन को देखने के लिए व्यापक क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। अंत बाध्यकारी (ईबी) की खोज- प्रोटीन जो एमटी प्लस-सिरों पर एकत्र होते हैं और प्रोटीन को फ्लोरोसेंटी लेबल करने के तरीकों के विकास ने व्यापक क्षेत्र और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप25,26,27के साथ जीवित कोशिकाओं में सीधे एमटी के व्यवहार का पालन करना संभव बनाया। एक ईबी-प्रोटीन एंड-बाइंडिंग प्रोटीन 3 (ईबी3)28है; अतिव्यक्त करने और ट्रैकिंग EB3 एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े द्वारा, मीट्रिक टन प्लस अंत विधानसभा दरों29,30निर्धारित किया जा सकता है ।
कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग अक्सर एमटी गतिशीलता का पालन करने के लिए किया जाता है। हालांकि, यह इमेजिंग तकनीक फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग, लाइव सेल और मंद नमूना इमेजिंग31के लिए दो अवांछनीय प्रक्रियाओं का उच्च जोखिम बन गई है। आदेश में एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, लेजर शक्ति और जोखिम अवधि काफी उच्च होना चाहिए, जबकि नमूनों को नुकसान नहीं है, और यह गति के बदले में संकल्प त्याग की आवश्यकता है । सीएलएसएम का एक उपयुक्त विकल्प डिस्क माइक्रोस्कोपी32कताई है। यह इमेजिंग मोडलिटी एक निको डिस्क33के उपयोग पर आधारित है, जिसमें पिनहोल की एक सरणी वाले एक चलती डिस्क होती है, और एक ही नमूने को एक साथ34इमेजिंग करने वाले कई सीएलएस माइक्रोस्कोप के समान रूप से काम करती है। इसलिए, लेजर से प्रकाश नमूने में कई क्षेत्रों को एक साथ रोशन करेगा लेकिन कॉन्फोकल प्रकृति को बनाए रखेगा। निकोडिस्क, इसलिए, सीएलएसएम के समान छवियों को प्राप्त करने और तेजी से और कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की अनुमति देता है। निकोवा डिस्क को योकोगावा इलेक्ट्रिक द्वारा और बेहतर किया गया था, जिसने उस पर माइक्रोलेंस की एक सरणी के साथ एक दूसरी डिस्क पेश की जो व्यक्तिगत रूप से एक संबंधित पिनहोल में प्रत्यक्ष प्रकाश, फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग35को कम करती है। इस प्रकार, कताई डिस्क लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेजिंग के लिए पसंद की एक विधि बन गई, और यह उच्च गति31,36पर उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ छवियों को प्राप्त करना संभव बनाता है, जो तेजी से बढ़ते मीट्रिक सिरों से संकेतों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है।
मीट्रिक टन गतिशीलता अस्थायी रूप से भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक एमटी इंटरफेज वाले37,38की तुलना में अधिक गतिशील होते हैं। इसी प्रकार, विकास दर और सिकुड़न में अंतर एक ही सेल चक्र चरण के भीतर भी देखा गया है, जैसे माइटोसिस39,40। इसलिए, झूठे डेटा संग्रह से बचने के लिए, एमटी गतिशीलता का माप सेल चक्र के दौरान एक संकीर्ण समय-खिड़की तक सीमित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रोमेथेराफेज में एमटी गतिशीलता का माप नप डायमेथिलेंस्ट्रॉन (डीएमई) के साथ कोशिकाओं का इलाज करके प्राप्त किया जा सकता है, एक मोनोस्ट्रोल एनालॉग जो मोटर किनेसिन Eg541 को रोकता है और द्विध्रुवी माइटोटिक स्पिंडल42के गठन को रोकता है। Eg5 अवरोधक डीएमई और अन्य मोनोस्ट्रोल डेरिवेटिव के साथ प्रोमेटाफेज में कोशिकाओं का अवरोध एमटी गतिशीलता43,44,45को प्रभावित नहीं करता है, जो डीएमई को निश्चित और जीवित कोशिकाओंदोनोंमें एमटी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाता है ।
यहां हम ड्यूल कताई डिस्क इमेजिंग के साथ एर्टिच एट अल44 द्वारा वर्णित प्रोमेटाफेज कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता विश्लेषण की विधि को जोड़ते हैं। यह विधि उच्च इमेजिंग दर के साथ एक ही फोकल प्लेन से एकत्र की गई प्रोमेटाफेज कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता की माप की अनुमति देती है, फिर भी फोटोब्लीचिंग और न्यूनतम फोटोटॉक्सिकिटी के बिना। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में, हम मिलकर डामर टोमैटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (टीडीटमाटर) का उपयोग करते हैं जिसने हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की तुलना में चमक और फोटोस्थिरता में सुधार किया है और कम ऊर्जा प्रकाश46से उत्साहित है। इसलिए, टीडीमैटो को उत्तेजना के लिए कम लेजर पावर की आवश्यकता होती है और यह कम फोटोटॉक्सिक है। कुल मिलाकर, हम फोटोटॉक्सिकिटी को कम करके और एमटी गतिशीलता विश्लेषण के लिए आवश्यक संकल्प और पोस्टप्रोसेसिंग में सुधार करके विधि में और सुधार करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम अन्य सिंक्रोनाइजेशन तकनीकों के साथ इसे जोड़कर विधि के भविष्य के संशोधनों के लिए एक आधार बनाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम पहले एर्टिच एट अल44द्वारा स्थापित विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं। कई अन्य संशोधनों के साथ, हम एमटी गतिशीलता विश्लेषण की इस तकनीक को दोहरी कताई डिस्क कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ जोड़ते है?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा, मैक्स-प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन के सदस्यों को उनकी विशेषज्ञ सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
| DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
| Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
| jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
| EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
| Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium |
| µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
| Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
| Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100XC Oil |
| ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm | |
| Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier | |
| HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
| MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
| Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |
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