Målet med detta protokoll är att använda temperatur för att kontrollera flödeshastigheterna hos tredimensionella aktiva vätskor. Fördelen med denna metod gör det inte bara möjligt att reglera flödeshastigheter på plats, utan möjliggör även dynamisk styrning, till exempel att regelbundet trimma flödeshastigheter upp och ned.
Vi presenterar en metod för att använda temperatur för att finjustera flödeshastigheterna för kinesindrivna, mikrotubule-baserade tredimensionella (3D) aktiva vätskor. Denna metod gör det möjligt att trimma hastigheter på plats utan att behöva tillverka nya prover för att nå olika önskade hastigheter. Dessutom möjliggör denna metod dynamisk kontroll av hastighet. Cykling temperaturen leder vätskor för att flöda snabbt och långsamt, regelbundet. Denna manövrerbarhet baseras på Arrhenius-karakteristik för kinesinmikrotubule-reaktionen, vilket visar ett kontrollerat medelvärde för flödeshastighet på 4 – 8 μm/s. Den presenterade metoden kommer att öppna dörren till utformningen av mikroflödessystem enheter där flödeshastigheter i kanalen är lokalt avstämbar utan behov av en ventil.
Aktiv materia är differentierat från konventionell passiv materia på grund av dess förmåga att omvandla kemisk energi till mekaniskt arbete. Ett material som besitter sådan förmåga kan bestå av levande eller icke-levande enheter såsom bakterier, insekter, kolloider, korn, och cytoskelett filament1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa material enheter interagerar med sina grannar. I större skala, de själv organisera i antingen turbulenta-liknande virvlar (aktiv turbulens) eller materialflöden11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En förståelse för självorganisering av aktiv materia har lett till olika tillämpningar i molekylära shuttles, optiska enheter och parallell beräkning21,22,23. För att få program till nästa nivå kräver kontroll bortom självorganisering. Till exempel, Palacci et al. utvecklat en hematite-inkapslad kolloid som självgående endast när de utsätts för manuellt kontrollerade blått ljus, vilket ledde till uppkomsten av levande kristaller24. Morin et al. etablerat kontroll av rullande Quincke kolloider med hjälp av en avstämbara yttre elektriska fält, vilket resulterar i kolloidal flockas i en travet-liknande kanal25. Dessa tidigare arbeten visar den roll som den lokala kontrollen har i tillämpningar och avancerar kunskapsbasen för aktiv materia.
I den här artikeln fokuserar vi på manövrerbarheten av kinesindrivna, mikrotubule (MT)-baserade 3D-aktiva vätskor. Vätskorna består av tre huvudkomponenter: MTs, kinesinet molekylära motorer och nedbrytande medel. De nedbrytande inducerar en utarmning kraft för att bunta MTs, som senare överbryggas av motor kluster. Dessa motorer går längs MTstoward plus änden. När ett par brygged MTsis antiparallel, motsvarande motorer gå i motsatt riktning. Men motorerna är bundna i ett kluster och kan inte gå isär, så de kooperativt glida isär par MTs (interfilament glidande, figur 1a). Dessa glidande dynamik ackumuleras, orsakar buntar av MTsto förlänga tills de når sin buckling instabilitet punkt och bryta (extensile buntar, figur 1B)26. De trasiga buntarna glödgas av den utarmning kraft, som därefter sträcker sig igen, och dynamiken upprepa. Under processen av den upprepande dynamiken, bunt rörelser rör den närliggande vätskan, inducera flöden som kan visualiseras genom dopning med Micron-skala spårämnen (figur 1C). Sanchez et al. och Henkin et al. har karakteriserat medelvärdet av tracers, att finna att hastigheterna var avstämbara genom att variera koncentrationerna av adenosintrifosfat (ATP), beklagar, motoriska kluster, och MTS19,27. Emellertid, sådan inställnings existerade endast före aktiv vätske syntes. Efter syntesen, var inställnings förlorad, och vätskorna självorganiserade på sitt eget sätt. För att kontrollera aktiv vätske aktivitet efter syntes, rapporterade Ross.et al. en metod med hjälp av ljus-aktiverade Dimerization av motorproteiner, vilket gör att vätske aktivitet att stämmas av och på med hjälp av ljus28. Medan ljusstyrning är praktiskt när det gäller lokalt aktivera vätskor, metoden kräver omkonstruktion av strukturer av motorproteiner, tillsammans med att ändra de optiska banorna i ett mikroskop. Här ger vi en lättanvänd metod för lokalt kontrollerade vätskeflöden utan Mikroskop modifiering samtidigt som motor strukturen hålls intakt.
Vår metod för lokalt trimning av aktivt vätskeflöde baseras på Arrhenius-lagen eftersom kinesin-MT-reaktionen har rapporterats öka med temperatur29,30,31,32. Våra tidigare studier visade att temperaturberoendet av medelhastigheten av ett aktivt vätskeflöde följde Arrhenius ekvation: v = a exp (-Ea/RT), där a är en före exponentiell faktor, R är gaskonstanten, EA är aktiveringsenergin och T är system temperaturen33. Därför är vätske aktivitet känslig för temperatur miljön, och system temperaturen måste vara konsekvent för att stabilisera motorns prestanda, och därmed vätske flödeshastigheten34. I den här artikeln visar vi användningen av motorns temperaturberoende för att kontinuerligt ställa in flödeshastigheterna för aktiva vätskor genom att justera system temperaturen. Vi demonstrerar också beredningen av ett aktivt vätske prov, följt av att montera provet på ett Mikroskop skede vars temperatur styrs via datorprogram. Att öka temperaturen från 16 ° c till 36 ° c påskyndar medelvärdet av flödeshastigheterna från 4 till 8 μm/s. Dessutom är inställnings reversibel: upprepade gånger ökar och minskar temperaturen sekventiellt accelererar och bromsar flödet. Den demonstrerade metoden är tillämplig på ett brett spektrum av system där de viktigaste reaktionerna lyda Arrhenius lag, såsom MT glidflygning assay29,30,31,32.
Styra aktiv materia in situ öppnar dörren till riktad självorganisering av aktiv materia4,5,24,28,54. I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att använda temperatur för att styra kinesindrivna, MT-baserade aktiva vätskor på plats, baserat på Arrhenius karakteristiska för systemet29,30<…
The authors have nothing to disclose.
Plasmid K401-BCCP-H6 var en gåva från Dr Zvonimir Dogic. Denna forskning stöddes av Dr. kun-ta Wu ‘ s startfond i Worcester Polytechnic Institute. Vi tackar Dr Zvonimir Dogic för protokollen att rena och etikett tubulin och att syntetisera aktiva vätskor. Vi är tacksamma för Dr Marc Ridilla för hans expertis inom proteinuttryck och rening. Vi tackar Dr William Benjamin Roger för att hjälpa oss med att bygga den temperaturstyrda scenen. Vi erkänner Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) för användning av biologiska material Facility (BMF). Vi erkänner det kungliga kemi förbundet för att anpassa siffrorna från BATE et al. on Soft Matter33.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white – 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply |
Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |