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Engineering

Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60484
, , ,
1Department of Physics,Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics,Brandeis University

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la temperatura per controllare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali. Il vantaggio di questo metodo non solo consente di regolare le velocità di flusso in situ, ma consente anche il controllo dinamico, ad esempio l’ottimizzazione periodica delle velocità di flusso verso l’alto e verso il basso.

Abstract

Presentiamo un metodo per utilizzare la temperatura per ottimizzare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali (3D) basati sulla kinesina e basati su microtubuli. Questo metodo consente di regolare le velocità in situ senza la necessità di produrre nuovi campioni per raggiungere diverse velocità desiderate. Inoltre, questo metodo consente il controllo dinamico della velocità. In bicicletta la temperatura porta i fluidi a fluire veloce e lento, periodicamente. Questa controllabilità si basa sulla caratteristica di Arrhenius della reazione kinesina-microtubule, dimostrando un intervallo di velocità di flusso medio controllato di 4-8 sm/s. Il metodo presentato aprirà la porta alla progettazione di dispositivi microfluidici in cui le portate nel canale sono localmente regolabili senza la necessità di una valvola.

Introduction

La materia attiva è differenziata dalla materia passiva convenzionale a causa della sua capacità di convertire l’energia chimica in lavoro meccanico. Un materiale che possiede tale capacità può consistere in entità viventi o non viventi come batteri, insetti, colloidi, cereali e filamenti citoscheletrici1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste entità materiali interagiscono con i rispettivi vicini. Su scala più ampia, si auto-organizzano in vortici turbolenti (turbolenza attiva) o flussi di materiale11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensione dell’auto-organizzazione della materia attiva ha portato a varie applicazioni in navette molecolari, dispositivi ottici e calcolo parallelo21,22,23. Per portare le applicazioni al livello successivo richiede un controllo al di là dell’auto-organizzazione. Ad esempio, Palacci e altri hanno sviluppato un colloide incapsulato di ematite che si è autopropulso solo se esposto alla luce blu controllata manualmente, che ha portato alla comparsa di cristalli viventi24. Morin ealtri stabilì il controllo dei colloidi Quincke rotolanti utilizzando un campo elettrico esterno regolabile, con conseguente affollamento colloidale in un canale 25 simile a uncircuito. Questi lavori precedenti dimostrano il ruolo del controllo locale nelle applicazioni e migliorano la base di conoscenze della materia attiva.

In questo articolo, ci concentriamo sulla controllabilità dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli (MT) basati sulla kinesina. I fluidi sono costituiti da tre componenti principali: MT, motori molecolari di chinasina e impoveritori. Gli esaurienti inducono una forza di esaurimento per impacchettare le MT, che vengono successivamente colmeggiate da cluster motori. Questi motori camminano lungo l’MTsverso l’estremità più. Quando una coppia di MTsis pontianti antiparallela, i motori corrispondenti camminano in direzioni opposte. Tuttavia, i motori sono legati in un cluster e non sono in grado di camminare a parte, in modo da scivolare in modo cooperativo coppie di MT (interfilamento scorrevole, Figura 1A). Queste dinamiche scorrevoli si accumulano, causando fasci di MT per estendere fino a raggiungere il loro punto di instabilità deformazione e rottura (fasci estensivi, Figura 1B)26. I fasci rotti sono anneriti dalla forza di esaurimento, che successivamente si estende di nuovo, e le dinamiche si ripetono. Durante il processo della dinamica di ripetizione, i movimenti del fascio mescolano il liquido vicino, inducendo flussi che possono essere visualizzati doping con traccianti in scala micron(Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. hanno caratterizzato le velocità medi dei traccianti, scoprendo che le velocità erano regolabili variando le concentrazioni di adenosina tripfofoso (ATP), impoverimenti, gruppi motori, e MT19,27. Tuttavia, tale sintunabilità esisteva solo prima della sintesi del fluido attivo. Dopo la sintesi, la sintonificabilità è stata persa e i fluidi si sono auto-organizzati a modo loro. Per controllare l’attività dei fluidi attivi dopo la sintesi, Ross.et al. ha riportato un metodo utilizzando la dimerizzazione attivata dalla luce delle proteine motorie, consentendo di attivare e disattivare l’attività del fluido utilizzando la luce28. Mentre il controllo della luce è conveniente in termini di attivazione locale dei fluidi, il metodo richiede di riprogettare le strutture delle proteine motorie, insieme a modificare i percorsi ottici in un microscopio. Qui, forniamo un metodo facile da usare per controllare localmente i flussi fluidi senza modifica del microscopio, mantenendo intatta la struttura motoria.

Il nostro metodo di sintonizzazione locale del flusso di fluido attivo si basa sulla legge Arrhenius perché la reazione kinesin-MT è stata segnalata per aumentare con temperatura29,30,31,32. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che la dipendenza dalla temperatura della velocità media di un flusso di fluido attivo ha seguito l’equazione di Arrhenius: v – A exp(-Ea/RT), dove A è un fattore pre-esponenziale, R è la costante di gas, Ea è l’energia di attivazione e T è la temperatura del sistema33. Pertanto, l’attività del fluido è sensibile all’ambiente di temperatura e la temperatura del sistema deve essere costante per stabilizzare le prestazioni del motore e, di conseguenza, la velocità di flusso del fluido34. In questo articolo, dimostriamo l’uso della dipendenza dalla temperatura del motore per ottimizzare continuamente le velocità di flusso dei fluidi attivi regolando la temperatura del sistema. Dimostriamo anche la preparazione di un campione di fluido attivo, seguito dal montaggio del campione in una fase del microscopio la cui temperatura è controllata tramite software per computer. L’aumento della temperatura da 16 a 36 gradi centigradi accelera la velocità media di flusso da 4 a 8 m/s. Inoltre, la sintonabilità è reversibile: aumentando ripetutamente e diminuendo la temperatura in sequenza accelera e decelera il flusso. Il metodo dimostrato è applicabile a una vasta gamma di sistemi in cui le principali reazioni obbediscono alla legge Arrhenius, come l’analisi MT che scivola29,30,31,32.

Protocol

1. Preparazione delle MT AVVISO: In questo passaggio purifichiamo le tubuline dal tessuto cerebrale bovino. Cervello bovino può causare variante malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Pertanto, i rifiuti cerebrali e le relative soluzioni, bottiglie e punte di pipette dovrebbero essere raccolti in un sacchetto di rifiuti organici e smaltiti come rifiuti biopericolosi secondo le regole dell’istituzione. Purificare le tubuline dal cervello bovino (modificato da…

Representative Results

La preparazione dei fluidi attivi basati sulla kinesina e basati su MT richiede sia kinesin che MT. Le MT sono state polimerizzate dalle tubuline etichettate (passaggi 1.3 e 1.4) che sono state purificate dai cervelli bovini (passaggio 1.1, Figura 2A), seguiti dal riciclaggio per migliorare la purezza (passaggio 1.2, Figura 2B). Le proteine motorie della cinesia sono state espresse e purificate da E. coli (passaggi 2.1 …

Discussion

Il controllo della materia attiva in situ apre la porta all’auto-organizzazione diretta della materia attiva4,5,24,28,54. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l’utilizzo della temperatura per controllare i fluidi attivi guidati dalla chinesina, basati su MT in situ, in base alla caratteristica di Arrhenius del sistema29<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Plasmid K401-BCCP-H6 è stato un dono del Dr. Svonimir Dogic. Questa ricerca è stata sostenuta dal fondo start-up del Dr. Kun-Ta Wu nel Worcester Polytechnic Institute. Ringraziamo il Dr. vonimir Dogic per i protocolli per purificare ed etichettare la tubulina e per sintetizzare i fluidi attivi. Siamo grati al Dr. Marc Ridilla per la sua esperienza nell’espressione e purificazione delle proteine. Ringraziamo il dottor William Benjamin Roger per averci aiutato a costruire il palco a temperatura controllata. Riconosciamo Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) per l’uso dello strumento dei materiali biologici (BMF). Riconosciamo la Royal Society of Chemistry per l’adattamento delle figure di Bate et al. su Soft Matter33.

Materials

(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white – 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		 Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).
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