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Engineering

温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60484
, , ,
1Department of Physics,Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics,Brandeis University

Summary

このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。

Abstract

温度を用いてキネシン駆動の微小管系3次元(3D)活性流体の流速を調整する方法を提示する。この方法は異なった望ましい速度に達するために新しいサンプルを製造する必要性なしで座って速度を調整することを可能にする。さらに、この方法は速度の動的制御を可能にする。温度をサイクリングすると、液体は速く、ゆっくりと、定期的に流れます。この制御性は、キネシン微小管反応のアレニウス特性に基づいており、4~8μm/sの制御された平均流量速度範囲を示します。提示された方法は、チャネルの流量がバルブを必要とせずに局所的に調整できないマイクロ流体デバイスの設計への扉を開きます。

Introduction

活物質は、化学エネルギーを機械的な作業に変換する能力により、従来の受動物質と区別されます。このような能力を有する材料は、細菌、昆虫、コロイド、穀物、および細胞骨格フィラメント1、2、3、4、5、6、7、8、9、10などの生きているまたは非生きている実体から成ることができる。これらのマテリアル エンティティは、隣接するエンティティと対話します。より大きなスケールでは、乱流のような渦(アクティブ乱流)または材料流れが11、12、13、14、15、16、17、18、19、20のいずれかに自己組織化する。活性物質の自己組織化を理解することは、分子シャトル、光学デバイス、および並列計算21、22、23における様々な応用につながっている。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、自己組織化を超えた制御が必要です。例えば、Palacciららは、手動で制御された青色光にさらされたときにのみ自走するヘマタイト封入コロイドを開発し、生きている結晶24の出現につながった。Morin et al. は、調整不可能な外部電界を用いて圧延キンケコロイドの制御を確立し、その結果、競馬場状のチャネル25にコロイド群れが生じる。これらの以前の作品は、アプリケーションにおけるローカル制御の役割を示し、アクティブな物質のナレッジベースを進めます。

この記事では、キネシン駆動、微小管(MT)ベースの3D活性流体の制御性に焦点を当てます。流体は、MT、キネシン分子モーター、および枯渇剤の3つの主要成分で構成されています。枯渇剤は、後でモータクラスタによってブリッジされるMTをバンドルするために枯渇力を誘発します。これらのモーターはプラス端に向かってMTsに沿って歩く。一対の橋渡しされたMTsisアンチパラレルの場合、対応するモータは反対方向に歩きます。ただし、モータはクラスタ内にバインドされ、離れて歩くことができないため、一対の M (インターフィラメントスライド、図 1A)を協調的にスライドさせます。これらの摺動ダイナミクスが蓄積し、座屈不安定点とブレーク(伸張バンドル、図1B)26に達するまで拡張するMTstoの束を引き起こす。壊れたバンドルは、その後再び伸びる枯渇力によってアニールされ、ダイナミクスが繰り返されます。繰り返しダイナミクスの過程で、バンドルの動きは近くの液体をかき混ぜ、ミクロンスケールトレーサーでドーピングすることによって可視化できる流れを誘導する(図1C)。Sanchez et al. および Henkin et al. はトレーサーの平均速度を特徴付けており、アデノシン三リン酸(ATP)、枯渇剤、運動クラスター、および MTs19,27の濃度を変化させることによって速度が調整可能であったことを発見した。しかしながら、このようなタンビリティは活性流体合成の前にのみ存在していた。合成後、タンビリティが失われ、流体は独自の方法で自己組織化されました。合成後の活性流体活性を制御するために、Ross.etal.は、運動タンパク質の光活性化二量体化を用いた方法を報告し、光28を用いて流体活性をオン/オフすることを可能にする。光制御は、流体を局所的に活性化するという点で便利ですが、この方法では、顕微鏡で光路を修正するとともに、運動タンパク質の構造を再設計する必要があります。ここでは、モータ構造をそのまま維持しながら、顕微鏡の改造を行わずに流体の流れを局所的に制御するための使いやすい方法を提供します。

キネシン-MT反応は温度29、30、31、32で増加することが報告されているので、局所的に活性流体の流れを調整する私たちの方法は、アレニウス法に基づいています。これまでの研究では、活性流体流れの平均速度の温度依存性がアレニウス方程式に従ったことを示した: v = exp(-Ea/RT)、Aは前指数因子、Rはガス定数、Eは活性化エネルギー、Tはシステム温度33である。 従って、流体活性は温度環境に敏感であり、かつシステム温度がモータ性能を安定させるために一貫している必要があり、その結果、流体流量速度34。この記事では、モータの温度依存性を使用して、システム温度を調整してアクティブ流体の流速を連続的に調整する方法を示します。また、活性流体サンプルの調製をデモンストレーションし、次にコンピュータソフトウェアを介して温度を制御する顕微鏡ステージにサンプルを取り付けます。温度を16°Cから36°Cに上げると、平均流量速度が4μm/sに速くなり、さらに、タンビリティは可逆的です:温度を繰り返し増減すると、流れを順次加速および減速します。実証された方法は、MT滑空アッセイ29、30、31、32などのアレニウス法に主な反応が従う広範なシステムに適用可能である。

Protocol

1. MTの作成 注意:このステップでは、牛の脳組織からチューブリンを浄化します。牛の脳は、変異型クロイツフェルトヤコブ病(vCJD)35を引き起こす可能性があります。したがって、脳廃棄物および関連するソリューション、ボトル、およびピペットチップは、バイオ廃棄物袋に収集し、施設のルールに従ってバイオ有害廃棄物として処分する必要がありま?…

Representative Results

キネシン駆動のMTベースの活性流体を準備するには、キネシンとMの両方が必要です。MTを、牛の脳から精製した標識チューブリン(ステップ1.3および1.4)から重合し、続いてリサイクルして純度を高めた(ステップ1.2、図2B)。キネシン運動タンパク質を大腸菌(ステップ2.1および2.2、図2B)41、52から発現および<sup class="xref"…

Discussion

その場所でアクティブな物質を制御することは、アクティブマター4、5、24、28、54の指向的な自己組織化への扉を開きます。本稿では、システム29、30、31のアレニウス特性に基づいて、温度を使用し?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

プラスミドK401-BCCP-H6はズヴォニミール・ドギック博士からの贈り物でした。この研究は、ウースター工科大学のクンタ・ウー博士のスタートアップファンドによって支援されました。我々は、ツボニミール・ドギッチ博士がチューブリンを浄化し、ラベルを付け、活性流体を合成するプロトコルに感謝する。マルク・リディラ博士のタンパク質発現と精製に関する専門知識に感謝しています。ウィリアム・ベンジャミン・ロジャー博士は、温度管理されたステージの構築を支援してくださったようお礼を申し上げます。我々は、生物学的材料施設(BMF)の使用のためのブランダイスMRSEC(NSF-MRSEC-1420382)を認めます。我々は、ソフトマター33にBateらからの数字を適応するための化学の王立協会を認める.

Materials

(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white – 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		 Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera
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References

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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).
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