Målet med denne protokollen er å bruke temperatur for å kontrollere strømningshastigheter av tredimensjonale aktive væsker. Fordelen med denne metoden gir ikke bare mulighet for regulering av strømningshastigheter i situ, men gir også dynamisk kontroll, som periodisk tuning strømningshastigheter opp og ned.
Vi presenterer en metode for bruk av temperatur for å justere strømnings hastighetene til kinesin, mikrotubulinettverket tredimensjonale (3D) aktive væsker. Denne metoden gjør det mulig å stille inn hastighetene i situ uten å måtte produsere nye prøver for å nå forskjellige ønskede hastigheter. Videre muliggjør denne metoden dynamisk kontroll av hastighet. Sykling temperaturen fører væskene til å flyte raskt og sakte, med jevne mellomrom. Denne kontrollerbarhet er basert på Arrhenius karakteristisk for den kinesin-mikrotubulinettverket reaksjonen, som viser et kontrollert strømnings hastighetsområde på 4 – 8 μm/s. Den presenterte metoden vil åpne døren til utformingen av mikrovæskebasert enheter der strømningshastigheter i kanalen er lokalt tunable uten behov for en ventil.
Aktiv materie er differensiert fra konvensjonell passiv materie på grunn av sin evne til å konvertere kjemisk energi til mekanisk arbeid. Et materiale som besitter slik evne kan bestå av levende eller ikke-levende enheter som bakterier, insekter, Colloids, korn, og cytoskjelettkomponenter filamenter1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse materielle enhetene samhandle med sine naboer. I større skala, de selv-organisere enten turbulente-lignende virvlene (aktiv turbulens) eller materiale renn11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En forståelse av egen organisering av aktiv materie har ført til ulike anvendelser innen molekylær transport, optiske enheter og parallell beregning21,22,23. Å bringe søknader til neste nivå krever kontroll utover selv-organisasjon. For eksempel, utviklet Palacci et al. en hematitt-innkapslet kolloid som selvgående bare når de utsettes for manuelt kontrollert blått lys, noe som førte til fremveksten av levende krystaller24. Morin et al. etablerte kontroll av rullende Kvinke Colloids ved hjelp av en tunable ekstern elektrisk felt, noe som resulterer i kolloidalt flokker i en veddeløpsbane-lignende kanal25. Disse tidligere verkene demonstrerer rollen som lokal kontroll i applikasjoner og fremme kunnskapsbasen av aktiv materie.
I denne artikkelen fokuserer vi på kontrollerbarhet av kinesin-drevne, mikrotubulinettverket (MT)-baserte 3D aktive væsker. Væskene består av tre hovedkomponenter: MTs, kinesin molekylære motorer og depletants. Depletants induserer en trykk kraft for å pakke inn MTs, som senere blir Brokoblet av motor klynger. Disse motorene går langs MTstoward pluss enden. Når et par av bro MTsis antiparallel, den tilsvarende motorene går i motsatt retning. Men motorene er bundet i en klynge og er ikke i stand til å gå fra hverandre, slik at de samarbeider skyve hverandre par av MTs (interfilament glidende, figur 1a). Disse glidende dynamikk akkumuleres, forårsaker bunter av MTsto forlenge til nå sine knekking ustabilitet punkt og Break (extensile bunter, figur 1B)26. Den ødelagte bunter er glødet av nedbryting kraft, som senere strekker seg igjen, og dynamikken gjenta. Under prosessen med gjentatt dynamikk, bunt bevegelsene røre den nærliggende væsken, inducing flyter som kan visualisere ved doping med mikron-skala Bevegelsesuskarphet (figur 1C). Sanchez et al. og Henkin et al. har karakterisert den gjennomsnittlige hastighet på bevegelsesuskarphet, finne at hastighetene ble tunable ved å variere konsentrasjonen av adenosin trifosfat (ATP), depletants, motor klynger, og MTS19,27. Men slike justeringsevne eksisterte bare før aktiv væske syntese. Etter syntese var justeringsevne tapt, og væskene selv-organisert på sin egen måte. For å kontrollere aktiv væske aktivitet etter syntese, Ross.et al. rapporterte en metode ved hjelp av lys aktivert dimerization av motor proteiner, slik at væske aktivitet skal stilles på og av ved hjelp av lys28. Mens lys kontroll er praktisk i form av lokalt aktivere væsker, krever metoden omstrukturere strukturene av motor proteiner, sammen med å endre de optiske banene i et mikroskop. Her gir vi en lett-å-bruke metode for lokalt kontrollerende væske strømmer uten mikroskop modifisering samtidig holde motoren strukturen intakt.
Vår metode for lokalt tuning aktiv væske strømning er basert på Arrhenius loven fordi kinesin-Mt reaksjonen har blitt rapportert å øke med temperatur29,30,31,32. Våre tidligere studier viste at temperaturen avhengighet av gjennomsnittlig hastighet på en aktiv væske strømning fulgt Arrhenius ligningen: v = A exp (-EA/RT), hvor en er en pre-eksponentiell faktor, R er gassen konstant, EA er aktiviseringen energi, og T er system temperaturen33. Derfor er væske aktivitet følsom for temperatur miljøet, og system temperaturen må være konsistent for å stabilisere motorytelsen, og følgelig er væske strømningshastigheten34. I denne artikkelen viser vi bruken av motorens temperatur avhengighet for å kontinuerlig tune strømnings hastighetene til aktive væsker ved å justere system temperaturen. Vi viser også utarbeidelsen av en aktiv væske prøve, etterfulgt av montering av prøven på et mikroskop scene der temperaturen styres via dataprogramvare. Ved å øke temperaturen fra 16 ° c til 36 ° c økes gjennomsnittlig strømningshastighet fra 4 til 8 μm/s. i tillegg er justeringsevne reversibel: gjentatte ganger økende og synkende temperaturen sekvensielt akselererer og bremser flyten. Den viste metoden gjelder for et bredt spekter av systemer der de viktigste reaksjonene adlyder Arrhenius lov, for eksempel Mt gliding analysen29,30,31,32.
Kontrollerende aktiv materie in situ åpner døren til regissert selvorganisering av aktiv materie4,5,24,28,54. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for bruk av temperatur for å kontrollere kinesin-drevne, MT-baserte aktive væsker in situ, basert på Arrhenius karakteristisk for systemet29,30</su…
The authors have nothing to disclose.
Plasmider K401-BCCP-H6 var en gave fra Dr. Zvonimir Dogic. Denne forskningen ble støttet av Dr. kun-ta Wu ‘ s oppstart fondet i Worcester Polytechnic Institute. Vi takker Dr. Zvonimir Dogic for protokollene å rense og merke tubulin og å syntetisere aktive væsker. Vi er takknemlige for Dr. Marc Ridilla for sin ekspertise på protein uttrykk og rensing. Vi takker Dr. William Benjamin Roger for å hjelpe oss med å bygge den temperaturstyrte scenen. Vi erkjenner Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) for bruk av biologiske materialer Facility (BMF). Vi erkjenner Royal Society of Chemistry for å tilpasse tallene fra Bate et al. på Soft Matter33.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white – 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply |
Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |