Immunofluorescenza Colorazione utilizzando IBA1 e TMEM119 per densità microgliale, morfologia e infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel cervello del mouse
Summary
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro passo-passo per la costaintura immunofluorescente di IBA1 e TMEM119, oltre all’analisi della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché dell’infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel tessuto cerebrale del topo.
Abstract
Questo è un protocollo per la doppia visualizzazione della microglia e l’infiltrazione di macrofagi nel tessuto cerebrale del topo. TMEM119 (che etichetta la microglia in modo selettivo), se combinato con IBA1 (che fornisce un’eccezionale visualizzazione della loro morfologia), consente di sforare i cambiamenti nella densità, nella distribuzione e nella morfologia. Quantificare questi parametri è importante per fornire informazioni sui ruoli esercitati dalla microglia, i macrofagi residenti del cervello. In condizioni fisiologiche normali, le microglie sono regolarmente distribuite in un modello a mosaico e presentano un piccolo soma con processi ramificati. Tuttavia, come risposta a fattori ambientali (ad esempio, traumi, infezioni, malattie o lesioni), la densità microgliale, la distribuzione e la morfologia vengono alterate in vari modi, a seconda dell’insulto. Inoltre, il metodo di doppia colorazione descritto consente la visualizzazione di macrofagi infiltrati nel cervello in base alla loro espressione di IBA1 e senza colocalizzazione con TMEM119. Questo approccio consente quindi la discriminazione tra microglia e infiltrazione di macrofagi, che è necessaria per fornire informazioni funzionali sul loro distinto coinvolgimento nell’omeostasi cerebrale in vari contesti di salute e malattia. Questo protocollo integra le ultime scoperte in neuroimmunologia relative all’identificazione di marcatori selettivi. Serve anche come strumento utile sia per i neuroimmunologi esperti che per i ricercatori che cercano di integrare la neuroimmunologia nei progetti.
Introduction
Che sia acuta o cronica, la neuroinfiammazione è strettamente influenzata dalla microglia, i macrofagi residenti del cervello. La visualizzazione della microglia attraverso l’immunostaining è preziosa per lo studio della neuroinfiammazione con l’uso della microscopia leggera, una tecnica altamente accessibile. In condizioni omeostatiche, la microglia è tipicamente distribuita in un modello non sovrapponi, simile a un mosaico. Essi esibiscono piccoli somas che estendono processi ramificati1, che a volte si contattanol’unl’altro 2 . I processi microgliali ramificati esaminano dinamicamente il parenchyma cerebrale, interagendo con neuroni, altre cellule gliali e vasi sanguigni durante le normali condizioni fisiologiche3. Le microglia sono dotate di un arsenale di recettori che consentono loro di eseguire compiti immunologici e rispondere ai cambiamenti nell’ambiente cerebrale, alla morte cellulare o ai danni ai tessuti. Inoltre, esercitano funzioni fisiologiche chiave, in particolare nella formazione sinaptica, manutenzione, ed eliminazione4,5.
Tra i marcatori disponibili utilizzati per studiare la microglia, l’adattatore legante di calcio ionizzato molecola 1 (IBA1) è uno dei più utilizzati. IBA1 è una proteina legante di calcio che fornisce una visualizzazione eccezionale della morfologia microgliale, compresi i processi distale fini, come confermato dalla microscopia elettronica6. Questo strumento è stato determinante nella caratterizzazione della trasformazione microgliale, precedentemente chiamata “attivazione”, in una vasta gamma di modelli di malattie animali7,8,9. In presenza di neuroinfiammazione, la risposta microgliale comprende: microgliosi che è definita come un aumento della densità cellulare, cambiamenti nella distribuzione che a volte si traducono in clustering, allargamento del corpo cellulare, così come ispessimento e ispessimento e accorciamento dei processi associati a più forme ameboide10,11,12,13.
L’immunostaining è limitato dalla disponibilità di anticorpi diretti contro marcatori specifici. È importante sottolineare che IBA1 è espresso dalla microglia ma anche dai macrofagi periferici che si infiltrano nel cervello14. Mentre l’osservazione delle cellule iBA1 positive all’interno del cervello è diventata un marcatore di microglia in questo campo di ricerca, l’infiltrazione di macrofagi periferici è stata segnalata in varie condizioni, anche marginalmente nel cervello sano15,16 ,17,18. Di conseguenza, l’uso di IBA1 da solo non consente la visualizzazione selettiva della microglia. Inoltre, i macrofagi adottano caratteristiche molecolari e morfologiche della microglia residente una volta che si sono infiltrati nel cervello, ostacolando così la differenziazione19. Questo rappresenta una sfida quando si studia la funzione della microglia e dell’infiltrazione dei macrofagi.
Mentre le microglia e i macrofagi periferici hanno origini distinte (ad esempio, dal sacco del tuorlo embrionale e dal midollo osseo, rispettivamente20,21), vi è un numero crescente di rilievi che indicano che le due popolazioni di cellule esercitano diversi ruoli nel cervello19. È quindi fondamentale utilizzare metodi che discriminano tra queste due popolazioni senza manipolazioni invasive (cioè chimere di midollo osseo o parabiosi) che possono modularne la densità, la distribuzione, la morfologia e la funzione. Il TMEM119 è emerso come un marcatore specifico della microglia in tutte le condizioni di salute e malattia22. In combinazione con IBA1, questo marcatore diventa utile per differenziare queste cellule dall’infiltrazione di macrofagi, che sono TMEM119-negativi e IBA1-positivi. Mentre è regolamentato dal punto di vista dello sviluppo, TMEM119 è espresso già nei giorni postnatali 3 (P3) e 6 (P6), in costante aumento fino a raggiungere i livelli degli adulti tra P10 e P1422. IBA1 è espresso già come giorno embrionale 10.5 (E10.5)23. Il protocollo di doppia etichettatura proposto è quindi utile per studiare queste due popolazioni per tutta la vita postnatale.
Questo protocollo fornisce una procedura di immunostaining passo-passo che consente la discriminazione tra microglia e macrofagi periferici. Spiega anche come condurre un’analisi quantitativa della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché un’analisi dell’infiltrazione dei macrofaghi periferici. Mentre lo studio di microglia e macrofagi periferici è utile da solo, questo protocollo consente ulteriormente la localizzazione di foyer neuroinfiammatori; quindi, serve anche come piattaforma per identificare aree specifiche da studiare, con l’uso di tecniche complementari (ancora, più dispendiose in termini di tempo e risorse).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo può essere diviso in due parti critiche: la qualità della colorazione e l’analisi. Se la colorazione non è ottimale, non riuscirà a rappresentare adeguatamente le cellule microgliali, influenzando così la densità, la distribuzione e le misurazioni della morfologia. Inoltre, la percentuale di cellule mieloidi periferiche di infiltrazione può essere sottovalutata. Questa è una versione ottimizzata del protocollo di colorazione, ma ci sono diversi fattori che possono provocare immagini non ottimali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Nathalie Vernoux per la sua guida e assistenza con gli esperimenti. Vorremmo anche ringraziare i dottori Emmanuel Planel e Serge Rivest per l’uso della loro fluorescenza e microscopi confocali, rispettivamente. Questo lavoro è stato in parte finanziato da borse di studio del Consiglio messicano della scienza e della tecnologia (CONACYT; a F.G.I), Fondation Famille-Choquette e Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; a K.P.), Fonds de Recherche du Québec – Santé (a M.B.), e Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), così come una sovvenzione Discovery dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) al M.E.T.M.E.T. ha una cattedra di ricerca canadese (livello II) di plasticità neuroimmune in salute e terapia.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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