Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato
Summary
Este protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a costainização imunofluorescente de IBA1 e TMEM119, além da análise da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como infiltração periférica de células mieloides no tecido cerebral do rato.
Abstract
Este é um protocolo para a visualização dupla de microglia e infiltração de macrófagos no tecido cerebral do rato. TMEM119 (que rotula microglia seletivamente), quando combinado com IBA1 (que fornece uma visualização excepcional de sua morfologia), permite a investigação de mudanças na densidade, distribuição e morfologia. Quantificar esses parâmetros é importante para fornecer insights sobre os papéis exercidos pela microglia, os macrófagos residentes do cérebro. Em condições fisiológicas normais, a microglia é regularmente distribuída em um padrão semelhante ao mosaico e apresenta uma pequena soma com processos ramificados. No entanto, como resposta a fatores ambientais (ou seja, trauma, infecção, doença ou lesão), densidade microglial, distribuição e morfologia são alterados de várias maneiras, dependendo do insulto. Além disso, o método de coloração dupla descrito permite a visualização de macrófagos infiltrados no cérebro com base em sua expressão de IBA1 e sem colocalização com TMEM119. Esta abordagem permite assim a discriminação entre microglia e macrófagos infiltrados, que é necessário para fornecer insights funcionais sobre o seu envolvimento distinto na homeostase cerebral em vários contextos de saúde e doença. Este protocolo integra os resultados os mais atrasados na neuroimunologia que pertence à identificação de marcadores seletivos. Ele também serve como uma ferramenta útil para neuroimunologistas experientes e pesquisadores que procuram integrar a neuroimunologia em projetos.
Introduction
Se aguda ou crônica, neuroinflamação é fortemente influenciada pela microglia, os macrófagos residentes do cérebro. Visualizar a microglia através da imunocoloração é valioso para o estudo da neuroinflamação com o uso de microscopia de luz, uma técnica altamente acessível. Em condições homeostáticas, a microglia é normalmente distribuída em um padrão não sobreposto, semelhante a um mosaico. Eles exibem pequenas somas que estendem os processos ramificados1, que às vezes entram em contato uns com os outros2. Os processos microgliais ramified examinam dinamicamente o parenchyma do cérebro, interagindo com os neurônios, outras pilhas gliais, e vasos sanguíneos durante circunstâncias physiological normais3. Microglia são equipados com um arsenal de receptores que lhes permitem realizar tarefas imunológicas e responder a mudanças no meio do cérebro, a morte celular, ou a danos nos tecidos. Além disso, eles exercem funções fisiológicas fundamentais, nomeadamente na formação sináptica, manutenção e eliminação4,5.
Entre os marcadores disponíveis usados para estudar a microglia, a molécula de adaptação de ligação ionizada de cálcio 1 (IBA1) é uma das mais utilizadas. Iba1 é uma proteína de ligação ao cálcio que fornece visualização excepcional da morfologia microglial, incluindo processos distais finos, como confirmado pela microscopia eletrônica6. Esta ferramenta tem sido fundamental na caracterização da transformação microglial, anteriormente chamada de “ativação”, em uma vasta gama de modelos de doenças animais7,8,9. Na presença de neuroinflamação, a resposta microglial inclui: microgliosis que é definido como um aumento na densidade celular, alterações na distribuição que às vezes resultam em agrupamento, ampliação do corpo celular, bem como espessamento e espessamento e encurtamento dos processos associados com formas mais ameboid10,11,12,13.
A imunomancha é limitada pela disponibilidade de anticorpos direcionados contra marcadores específicos. Importante, IBA1 é expressa por microglia, mas também por macrófagos periféricos que se infiltram no cérebro14. Enquanto a observação de células IBA1-positivas dentro do cérebro tornou-se um marcador de microglia neste campo de pesquisa, infiltração de macrófagos periféricos tem sido relatada várias condições, mesmo marginalmente no cérebro saudável15,16 17,18. Consequentemente, o uso do IBA1 por si só não permite a visualização seletiva da microglia. Além disso, macrófagos adotar características moleculares e morfológicas da microglia residente, uma vez que se infiltraram no cérebro, impedindo assim a diferenciação19. Isso representa um desafio ao investigar a função da microglia e infiltrar macrófagos.
Enquanto microglia e macrófagos periféricos têm origens distintas (por exemplo, a partir do saco de gema embrionária e medula óssea, respectivamente20,21), há um número crescente de achados indicando que as duas populações celulares exercem diferentes papéis no cérebro19. Assim, é crucial o uso de métodos que discriminem entre essas duas populações sem manipulações invasivas (ou seja, quimeras de medula óssea ou parabiose) que possam modular sua densidade, distribuição, morfologia e função. TMEM119 emergiu como um marcador específico da microglia em condições de saúde e doença22. Quando combinado com iba1, este marcador torna-se útil para diferenciar essas células de infiltrar macrófagos, que são TMEM119-negativo e IBA1-positivo. Embora seja regulada de desenvolvimento, o TMEM119 é expresso tão cedo quanto os dias pós-natais 3 (P3) e 6 (P6), aumentando constantemente até atingir os níveis adultos entre P10 e P1422. Iba1 é expresso tão cedo quanto o dia embrionário 10.5 (E10.5)23. O protocolo de rotulagem dupla proposto é, portanto, útil para estudar essas duas populações ao longo da vida pós-parto.
Este protocolo fornece um procedimento de imunocoloração passo a passo que permite a discriminação entre microglia e macrófagos periféricos. Também explica como realizar uma análise quantitativa da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como a análise da infiltração periférica de macrófagos. Embora a investigação de microglia e macrófagos periféricos seja útil por si só, este protocolo permite ainda a localização de foyers neuroinflamatórios; assim, também serve como uma plataforma para identificar regiões específicas para investigar, com o uso de técnicas complementares (ainda, mais demoradas e consumidoras de recursos).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo pode ser dividido em duas partes críticas: qualidade da coloração e análise. Se a coloração não for ideal, ela não representará adequadamente as células microgliais, afetando assim as medições de densidade, distribuição e morfologia. Além disso, a proporção de células mieloides periféricas de infiltração pode ser subestimada. Esta é uma versão otimizada do protocolo de coloração, mas existem vários fatores que podem resultar em imagens abaixo do ideal. Mesmo que a perfusão do ani…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Nathalie Vernoux por sua orientação e assistência com os experimentos. Gostaríamos também de agradecer aos Drs. Emmanuel Planel e Serge Rivest pelo uso de sua fluorescência e microscópios confocais, respectivamente. Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsas de estudo do Conselho Mexicano de Ciência e Tecnologia (CONACYT; a F.G.I), Fondation Famille-Choquette e Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec – Santé (a M.B.), e Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), bem como uma concessão discovery do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) para M.E.T. M.E.T. detém uma cadeira de pesquisa do Canadá (Nível II) de Plasticidade Neuroimune em Saúde e Terapia.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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