Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón
Summary
Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.
Abstract
Este es un protocolo para la visualización dual de microglia e infiltración de macrófagos en el tejido cerebral del ratón. TMEM119 (que etiqueta la microglia selectivamente), cuando se combina con IBA1 (que proporciona una visualización excepcional de su morfología), permite investigar los cambios en la densidad, distribución y morfología. La cuantificación de estos parámetros es importante para proporcionar información sobre los roles ejercidos por la microglia, los macrófagos residentes del cerebro. En condiciones fisiológicas normales, la microglia se distribuye regularmente en un patrón similar a un mosaico y presenta un pequeño soma con procesos ramificados. Sin embargo, como respuesta a factores ambientales (es decir, trauma, infección, enfermedad o lesión), la densidad microglial, la distribución y la morfología se alteran de diversas maneras, dependiendo del insulto. Además, el método de doble tinción descrito permite la visualización de macrófagos infiltrados en el cerebro en función de su expresión de IBA1 y sin colocalización con TMEM119. Por lo tanto, este enfoque permite la discriminación entre la microglia y la infiltración de macrófagos, que se requiere para proporcionar información funcional sobre su participación distinta en la homeostasis cerebral en diversos contextos de salud y enfermedad. Este protocolo integra los últimos hallazgos en neuroinmunología que se refieren a la identificación de marcadores selectivos. También sirve como una herramienta útil tanto para los neuroinmólogos experimentados como para los investigadores que buscan integrar la neuroinmunología en los proyectos.
Introduction
Ya sea aguda o crónica, la neuroinflamación está fuertemente influenciada por la microglia, los macrófagos residentes del cerebro. Visualizar la microglia a través de la inmunomancha es valioso para el estudio de la neuroinflamación con el uso de microscopía de luz, una técnica altamente accesible. En condiciones homeostáticas, la microglia se distribuye típicamente en un patrón no superpuesto, similar a un mosaico. Exhiben pequeños somas que se extienden procesos ramificados1, que a veces se ponen en contacto entre sí2. Los procesos ramificados microgliales examinan dinámicamente el parénquima cerebral, interactuando con las neuronas, otras células gliales y los vasos sanguíneos durante las condiciones fisiológicas normales3. Microglia están equipadas con un arsenal de receptores que les permiten realizar tareas inmunológicas y responder a los cambios en el entorno cerebral, a la muerte celular o al daño tisular. Además, ejercen funciones fisiológicas clave, especialmente en la formación sináptica, mantenimiento, y eliminación4,5.
Entre los marcadores disponibles utilizados para estudiar la microglia, la molécula de adaptador de calcio ionizado 1 (IBA1) es una de las más utilizadas. IBA1 es una proteína de unión al calcio que proporciona una visualización excepcional de la morfología microglial, incluidos los procesos distales finos, como lo confirma la microscopía electrónica6. Esta herramienta ha sido fundamental para caracterizar la transformación microglial, anteriormente llamada “activación”, en una amplia gama de modelos de enfermedades animales7,8,9. En presencia de neuroinflamación, la respuesta microglial incluye: microgliosis que se define como un aumento de la densidad celular, cambios en la distribución que a veces resultan en clustering, agrandamiento del cuerpo celular, así como engrosamiento y acortamiento de procesos asociados con formas más ameboideas10,11,12,13.
La inmunomancha está limitada por la disponibilidad de anticuerpos dirigidos contra marcadores específicos. Es importante destacar que IBA1 se expresa mediante microglia, pero también por macrófagos periféricos que se infiltran en el cerebro14. Mientras que la observación de células IBAN1 positivas dentro del cerebro se ha convertido en un marcador de microglia en este campo de investigación, la infiltración de macrófagos periféricos se ha reportado bajo diversas condiciones, incluso marginalmente en el cerebro sano15,16 ,17,18. En consecuencia, el uso de IBA1 por sí solo no permite la visualización selectiva de microglia. Además, los macrófagos adoptan características moleculares y morfológicas de la microglia residente una vez que se han infiltrado en el cerebro, lo que dificulta la diferenciación19. Esto representa un desafío a la hora de investigar la función de la microglia y de la infiltración de macrófagos.
Si bien los macrófagos periféricos y microglia tienen orígenes distintos (por ejemplo, del saco de yema embrionaria y la médula ósea, respectivamente20,21), hay un número cada vez mayor de hallazgos que indican que las poblaciones de dos células ejercen diferentes roles en el cerebro19. Por lo tanto, es crucial utilizar métodos que discriminen entre estas dos poblaciones sin manipulaciones invasivas (es decir, quimeras de médula ósea o parabiosis) que puedan modular su densidad, distribución, morfología y función. TMEM119 ha surgido como un marcador específico de microglia en todas las condiciones de salud y enfermedad22. Cuando se combina con IBA1, este marcador se vuelve útil para diferenciar estas células de los macrófagos infiltrados, que son TMEM119-negativo e IBA1-positivo. Si bien está regulada por el desarrollo, TMEM119 se expresa ya en los días postnatales 3 (P3) y 6 (P6), aumentando constantemente hasta alcanzar los niveles adultos entre P10 y P1422. Iba1 se expresa desde el día embrionario 10.5 (E10.5)23. Por lo tanto, el protocolo de doble etiquetado propuesto es útil para estudiar estas dos poblaciones a lo largo de la vida posnatal.
Este protocolo proporciona un procedimiento de inmunostainización paso a paso que permite la discriminación entre la microglia y los macrófagos periféricos. También explica cómo realizar un análisis cuantitativo de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como el análisis de la infiltración de macrófagos periféricos. Si bien la investigación de microglia y macrófagos periféricos es útil por sí sola, este protocolo permite además la localización de vestíbulos neuroinflamatorios; por lo tanto, también sirve como plataforma para identificar regiones específicas para investigar, con el uso de técnicas complementarias (aún, más lentas y que consumen recursos).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se puede dividir en dos partes críticas: calidad de la tinción y análisis. Si la tinción no es óptima, no representará adecuadamente las células microgliales, afectando así las mediciones de densidad, distribución y morfología. Además, se puede subestimar la proporción de células mieloides periféricas de infiltración. Esta es una versión optimizada del protocolo de tinción, pero hay varios factores que pueden resultar en imágenes subóptimas. A pesar de que la perfusión del animal no est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Nathalie Vernoux por su orientación y ayuda con los experimentos. También queremos dar las gracias a los Doctores Emmanuel Planel y Serge Rivest por el uso de su fluorescencia y microscopios confocales, respectivamente. Este trabajo fue financiado en parte con becas del Consejo Mexicano de Ciencia y Tecnología (CONACYT; a F.G.I), Fundación Famille-tette y Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec – Santé (a M.B.), y Choqueté Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), así como una beca Discovery del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) a M.E.T. M.E.T. tiene una Cátedra de Investigación de Canadá (Nivel II) de Plasticidad Neuroinmune en Salud y Terapia.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
