Summary

Иммунофлуоресценция пятно использованием IBA1 и TMEM119 для микроглиальной плотности, морфологии и периферической миелоидной клеточной инфильтрации анализа в мышиный мозг

Published: October 27, 2019
doi:

Summary

Этот протокол описывает пошаговой рабочий процесс для иммунофлуоресцентного костейни IBA1 и TMEM119, в дополнение к анализу микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также периферической миелоидной инфильтрации в ткани мозга мыши.

Abstract

Это протокол для двойной визуализации микроглии и проникновения макрофагов в ткани мозга мыши. TMEM119 (который маркирует микроглию выборочно), в сочетании с IBA1 (который обеспечивает исключительную визуализацию их морфологии), позволяет исследует изменения плотности, распределения и морфологии. Количественная оценка этих параметров имеет важное значение для получения информации о роли, которую играет микроглия, резидентные макрофаги мозга. В нормальных физиологических условиях микроглия регулярно распределяется по мозаичному узору и представляет собой небольшую сому с беспорядочными процессами. Тем не менее, в ответ на экологические факторы (наиболее травмы, инфекции, болезни или травмы), микроглиальная плотность, распределение и морфология изменяются различными способами, в зависимости от оскорбления. Кроме того, описанный метод двойного окрашивания позволяет визуализировать проникновение макрофагов в мозг на основе их экспрессии IBA1 и без колокализации с TMEM119. Таким образом, такой подход позволяет проводить дискриминацию между микроглией и инфильтративающимися макрофагами, что необходимо для обеспечения функционального понимания их явного участия в гомеостазе мозга в различных контекстах здоровья и болезней. Этот протокол интегрирует последние выводы в нейроиммунологии, которые относятся к идентификации селективных маркеров. Он также служит полезным инструментом как для опытных нейроиммунологов, так и для исследователей, стремящихся интегрировать нейроиммунологию в проекты.

Introduction

Будь то острое или хроническое, нейровоспаление находится под сильным влиянием микроглии, резидентов макрофагов мозга. Визуализация микроглии с помощью иммуностоинга ценна для изучения нейровоспаления с использованием световой микроскопии, высокодоступной техники. В гомеостастатных условиях, микроглии, как правило, распространяются в nonoverlapping, мозаика, как картина. Они проявляют небольшие сомы, которые расширяют неразрешимые процессы1, которые иногда контактируют друг с другом2. Микроглиальные неразрежденные процессы динамически обследуют паренхиму головного мозга, взаимодействуя с нейронами, другими глиальными клетками и кровеносными сосудами при нормальных физиологических условиях3. Микроглия оснащена арсеналом рецепторов, которые позволяют им выполнять иммунологические задачи и реагировать на изменения в среде мозга, на гибель клеток или на повреждение тканей. Кроме того, они оказывают ключевые физиологические функции, в частности, в синаптической формирования, технического обслуживания и ликвидации4,5.

Среди доступных маркеров, используемых для изучения микроглии, ионизированная молекула адаптера связывания кальция 1 (IBA1) является одним из наиболее широко используемых. IBA1 является кальциевым связывающим белком, который обеспечивает исключительную визуализацию микроглиальной морфологии, включая тонкие дистальные процессы, что подтверждается электронной микроскопией6. Этот инструмент сыграл важную роль в характеристике микроглиальной трансформации, ранее называемой “активацией”, в широком спектре моделей болезней животных7,8,9. При наличии нейровоспаления микроглиальный ответ включает в себя: микроглиоз, который определяется как увеличение плотности клеток, изменения в распределении, которые иногда приводят к кластеризации, увеличению тела клетки, а также утолщение и сокращение процессов, связанных с более амибойдформы10,11,12,13.

Иммуностогирование ограничено наличием антител, направленных против конкретных маркеров. Важно отметить, что IBA1 выражается в микроглии, но и периферических макрофагов, которые проникают в мозг14. В то время как наблюдение IBA1-положительных клеток внутри мозга стало маркером микроглии в этой области исследований, периферийные инфильтрации макрофагов было сообщено в различных условиях, даже незначительно в здоровом мозге15,16 ,17,18. Следовательно, использование IBA1 само по себе не позволяет селективной визуализации микроглии. Кроме того, макрофаги принимают молекулярно-морфологические особенности резидентов микроглии, как только они проникли в мозг, тем самым препятствуя дифференциации19. Это представляет собой проблему при изучении функции как микроглии, так и инфильтрации макрофагов.

В то время как микроглии и периферических макрофагов имеют четкое происхождение (например, от эмбрионального желтка мешок и костный мозг, соответственно20,21), есть все большее число выводов, указывающих, что две популяции клеток оказывают различные роли в мозге19. Поэтому крайне важно использовать методы, которые различают эти две популяции без инвазивных манипуляций (т.е. химер костного мозга или парабиоза), которые могут модулировать их плотность, распределение, морфологию и функции. TMEM119 стал микроглии конкретных маркера через здоровье и болезни условия22. В сочетании с IBA1, этот маркер становится полезным для дифференциирования этих клеток от проникновения макрофагов, которые TMEM119-отрицательный и IBA1-положительный. Хотя это регулируется в развитии, TMEM119 выражается уже в послеродовые дни 3 (P3) и 6 (P6), неуклонно растет до достижения взрослых уровней между P10 и P1422. IBA1 выражается уже в эмбриональный день 10.5 (E10.5)23. Таким образом, предлагаемый протокол двойной маркировки полезен для изучения этих двух популяций на протяжении всей послеродовой жизни.

Этот протокол обеспечивает пошаговую иммуностоинизационную процедуру, которая допускает дискриминацию между микроглией и периферийными макрофагами. В нем также объясняется, как проводить количественный анализ микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также анализ инфильтрации периферических макрофагов. В то время как исследование микроглии и периферических макрофагов полезно само по себе, этот протокол далее позволяет локализацию нейровоспалительных фойе; таким образом, он также служит платформой для определения конкретных регионов для проведения расследований с использованием дополнительных (пока больше времени и затрат) методов.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами институциональных комитетов по этике животных в соответствии с Канадским советом по уходу за животными и Комитетом по уходу за животными Университета Лаваля. 1. Иммуностоидинг <…

Representative Results

На рисунке 1 показана сомаркировка микроглии с использованием IBA1 и TMEM119 в корональном разделе суставного гиппокампа, изображенного в 20x флуоресценционной микроскопией. Успешное окрашивание показывает микроглиальные клеточные тела и их тонкие процесс…

Discussion

Этот протокол можно разделить на две критические части: качество окрашивания и анализа. Если окрашивание не является оптимальным, оно не сможет представлять микроглиальные клетки адекватно, тем самым влияя на плотность, распределение и измерения морфологии. Кроме того, доля инфильтра?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Натали Верно за ее руководство и помощь в проведении экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Эммануэль Планель и Серж Ривест за использование их флуоресценции и конфокальных микроскопов, соответственно. Эта работа частично финансировалась за счет стипендий От Мексиканского совета по науке и технике (CONACYT; F.G.I), Фонда Фамиль-Чокетт и Центра тематика де речерче-н-р неврологии (CTRN; к К.П.), Фонды де Рехерче дю Квебек – Санте (до М.Б.), и Шастри Индо-канадский институт (к KB), а также Грант Discovery от естественных наук и инженерных исследований Совета Канады (NSERC) в M.E.T. M.E.T. имеет канадский научно-исследовательский кафедры (Tier II) нейроиммунной пластичности в области здравоохранения и терапии.

Materials

Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Play Video

Cite This Article
González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

View Video