마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색
Summary
이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
이것은 microglia의 이중 시각화및 마우스 뇌 조직에 있는 대식세포 침투를 위한 프로토콜입니다. TMEM119(마이크로글리아를 선택적으로 라벨로 표시함)는 IBA1(형태에 대한 탁월한 시각화를 제공함)과 결합될 때 밀도, 분포 및 형태학의 변화를 조사할 수 있습니다. 이러한 매개 변수를 정량화하는 것은 뇌의 상주 대식세포인 microglia가 가하는 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 중요합니다. 정상적인 생리적 조건하에서, microglia는 모자이크 와 같은 패턴으로 정기적으로 분포하고 난폭한 과정으로 작은 소마를 제시합니다. 그럼에도 불구하고, 환경 적 요인 (즉, 외상, 감염, 질병, 또는 상해)에 대한 반응으로서, 미세 교밀도, 분포 및 형태는 모욕에 따라 다양한 방식으로 변경된다. 추가적으로, 기술된 이중 염색 방법은 TMEM119를 가진 공동 현지화 없이 IBA1의 그들의 표현에 근거를 둔 두뇌에 있는 대식세포 침투의 시각화를 허용합니다. 이 접근은 이렇게 건강과 질병의 각종 맥락에서 두뇌 항상성에 있는 그들의 명백한 관여에 기능적인 통찰력을 제공하기 위하여 요구되는 microglia와 침투대식세포 사이 차별을 허용합니다. 이 프로토콜은 선택적 마커의 식별에 관련된 신경 면역학의 최신 연구 결과를 통합합니다. 그것은 또한 프로젝트에 신경 면역학을 통합 하고자 하는 경험이 풍부한 신경 면역 학자와 연구자 모두에 대 한 유용한 도구 역.
Introduction
급성 또는 만성 여부, 신경 염증은 단단히 microglia에 의해 영향을, 뇌의 상주 대 식 세포. 면역 염색을 통해 미세 글리아를 시각화하는 것은 매우 접근 가능한 기술인 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 신경 염증을 연구하는 데 유용합니다. 동종 조건에서, microglia는 일반적으로 비 오버랩, 모자이크 같은 패턴으로 분포된다. 그들은 때때로 서로 접촉 1, ramified 프로세스1을확장 작은 소마를 전시2. Microglial ramified 프로세스는 동적으로 뇌 의 실조를 조사, 뉴런과 상호 작용, 다른 신경교 세포, 정상적인 생리 적 조건 동안 혈관3. Microglia는 면역 학적 작업을 수행하고 뇌 milieu의 변화, 세포 사멸 또는 조직 손상에 반응 할 수있는 수용체의 무기고를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 시냅스 형성, 유지 보수 및 제거4,5에서특히 주요 생리 기능을 발휘합니다.
마이크로글리아를 연구하는 데 사용되는 마커 들 중, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(IBA1)은 가장 널리 사용되는 것 중 하나이다. IBA1은 전자 현미경6에의해 확인된 바와 같이 미세 원위 과정을 포함하여 미세 교안 형태학의 뛰어난 시각화를 제공하는 칼슘 결합 단백질입니다. 이 도구는 동물 질병 모델7,8,9의광대 한 배열에서 이전에 “활성화”라고 불리는 미세 교어 변환을 특성화하는 데 중요한 역할을했습니다. 신경 염증의 존재, microglial 응답 포함: 세포 밀도의 증가로 정의 되는 microgliosis, 때로는 클러스터링 귀 착되는 분포의 변화, 세포 신체의 확대, 뿐만 아니라 두껍게 하 고 더 ameboid 모양10,11,12,13와관련된 프로세스의 단축 .
면역 염색은 특정 마커에 대하여 지시된 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 중요한 것은, IBA1은 마이크로글리아에 의해뿐만 아니라 뇌에 침투하는 말초 대식세포에 의해 발현된다14. 뇌 내부의 IBA1 양성 세포의 관찰이 연구 분야에서 마이크로 글리아의 마커가되었지만, 말초 대식세포 침투는 건강한 뇌에서 도 미미하게, 다양한 조건하에서 보고되었습니다15,16 ,17,18. 따라서, IBA1 단독의 사용은 마이크로글리아의 선택적 시각화를 허용하지 않는다. 또한, 대식세포는 일단 뇌에 침투하면 상주 마이크로글리아의 분자 및 형태학적 특징을 채택하여 분화19를방해한다. 이것은 microglia의 기능을 조사하고 대식세포에 침투할 때 도전을 나타냅니다.
미세글리아 및 말초 대식세포는 뚜렷한 기원을 가지고 있지만(예를 들어, 배아 노른자 낭과 골수에서 각각20,21),두 세포 집단이 운동한다는 것을 나타내는 발견의 수가 증가하고 있다. 뇌의 다른 역할19. 따라서 그들의 밀도, 분포, 형태학 및 기능을 조절할 수 있는 침략적인 조작 (즉, 골수 키메라 또는 parabiosis) 없이 이 2개의 인구 사이 구별하는 방법을 사용하는 것이 중요합니다. TMEM119는 건강 및 질병 상태22에걸쳐 마이크로글리아 특이적 마커로 나타났다. IBA1와 결합될 때, 이 마커는 TMEM119 음성 및 IBA1 양성인 대식세포에 침투하는 이 세포를 분화하는 데 유용하게 됩니다. TMEM119는 발달조절이 되는 반면, TMEM119는 출생 후 3일(P3) 및 6(P6)으로 일찍 발성되며, P10과 P1422사이의 성인 수준에 도달할 때까지 꾸준히 증가한다. IBA1은 배아일10.5(E10.5)23일부터발현된다. 제안된 이중 표지 프로토콜은 이렇게 출생 후 생활 내내 이 2개의 인구를 공부하는 것이 유용합니다.
이 프로토콜은 마이크로글리아와 말초 대식세포 사이의 차별을 허용하는 단계별 면역 염색 절차를 제공합니다. 또한 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 정량적 분석뿐만 아니라 말초 대식세포 침투의 분석을 수행하는 방법에 대해서도 설명합니다. microglia 및 말초 대식 세포의 조사는 그 자체로 유용하지만,이 프로토콜은 신경 염증성 조련사를 국소화 할 수 있습니다. 따라서 보완적인(아직 더 많은 시간 및 리소스 소모적인) 기술을 사용하여 조사할 특정 지역을 식별하는 플랫폼의 역할도 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 염색 및 분석의 품질이라는 두 가지 중요한 부분으로 나눌 수 있습니다. 염색이 최적이 아닌 경우 미세 교세포를 적절히 나타내지 못하여 밀도, 분포 및 형태 측정에 영향을 미칩니다. 또한, 침윤 말초 골수성 세포의 비율은 과소 평가될 수 있다. 이것은 염색 프로토콜의 최적화된 버전이지만 최적이 아닌 이미지를 초래할 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 동물의 관류가이 프로토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나탈리 베르누(Nathalie Vernoux)의 지도와 실험에 대한 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 각각 그들의 형광및 공초점 현미경의 사용에 대한 박사 에마누엘 플래넬과 세르지 Rivest에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 멕시코 과학 기술 위원회 (CONACYT; F.G.I), 재단 파밀 – 초케트 및 센터 테마티크 드 recherche en 신경 과학 (CTRN; K.P.), 퐁 드 레체체 뒤 퀘벡 – 산테 (M.B.) 장학금에 의해 지원되었다 샤스트리 인도 -캐나다 연구소 (K.B.), 뿐만 아니라 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에서 발견 보조금 (NSERC) M.E.T. M.E.E.E.T.는 건강과 치료에 있는 신경 면역 가소성의 캐나다 연구 의자 (Tier II)를 보유하고 있습니다.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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