Immunofluorescence farging bruke IBA1 og TMEM119 for Mikrogliaaggregater Density, morfologi og perifere myelogen Cell infiltrasjon analyse i Mouse Brain
Summary
Denne protokollen beskriver en trinnvis arbeidsflyt for immunofluorescent costaining av IBA1 og TMEM119, i tillegg til analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi, samt perifere myelogen celle infiltrasjon i mus hjernevev.
Abstract
Dette er en protokoll for den doble visualisering av mikroglia og infiltrere makrofager i mus hjernevev. TMEM119 (som etiketter mikroglia selektivt), kombinert med IBA1 (som gir en eksepsjonell visualisering av morfologi deres), tillater gransking av endringer i tetthet, distribusjon og morfologi. Kvantifisere disse parametrene er viktig for å gi innsikt i de rollene som utøves av mikroglia, bosatt makrofager av hjernen. Under normale fysiologiske forhold, mikroglia er regelmessig fordelt i en mosaikk-lignende mønster og presentere et lite Soma med ramified prosesser. Likevel, som et svar på miljømessige faktorer (dvs. traumer, infeksjon, sykdom, eller skade), mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi er endret i ulike manerer, avhengig av fornærmelse. I tillegg tillater den beskrevne dobbel farge metoden visualisering av infiltrere makrofager i hjernen basert på deres uttrykk for IBA1 og uten colocalization med TMEM119. Denne tilnærmingen tillater dermed diskriminering mellom mikroglia og infiltrere makrofager, som er nødvendig for å gi funksjonell innsikt i deres distinkte engasjement i hjernens homeostase på tvers av ulike kontekster av helse og sykdom. Denne protokollen integrerer de siste funnene i neuroimmunology som gjelder for identifisering av selektive markører. Det fungerer også som et nyttig verktøy for både erfarne neuroimmunologists og forskere som ønsker å integrere neuroimmunology i prosjekter.
Introduction
Enten akutt eller kronisk, nevroinflammasjon er tett påvirket av mikroglia, bosatt makrofager av hjernen. Visualisering mikroglia gjennom immunostaining er verdifullt for studiet av nevroinflammasjon med bruk av lys mikroskopi, en lett tilgjengelig teknikk. I homøostatisk forhold er mikroglia vanligvis fordelt i et nonoverlapping, mosaikk-lignende mønster. De viser små somas som forlenger ramified prosesser1, som noen ganger kontakter hverandre2. Mikrogliaaggregater ramified prosesser dynamisk undersøkelse hjernen parenchyma, i samspill med neurons, andre gliacellene celler, og blodkar under normale fysiologiske forhold3. Mikroglia er utstyrt med et arsenal av reseptorer som tillater dem å utføre immunologiske oppgaver og reagere på endringer i hjernen miljø, til celle død, eller til vevsskade. I tillegg utøver de viktige fysiologiske funksjoner, spesielt i Synaptic formasjon, vedlikehold og eliminering4,5.
Blant de tilgjengelige markører som brukes til å studere mikroglia, ionisert kalsium bindende adapter molekyl 1 (IBA1) er en av de mest brukte. IBA1 er et kalsium bindende protein som gir eksepsjonell visualisering av mikrogliaaggregater morfologi, inkludert fine, klare prosesser, som bekreftet av elektron mikroskopi6. Dette verktøyet har vært medvirkende i karakteriserer mikrogliaaggregater transformasjon, tidligere kalt “aktivisering”, i et stort utvalg av dyr sykdom modeller7,8,9. I nærvær av nevroinflammasjon, mikrogliaaggregater respons inkluderer: microgliosis som er definert som en økning i cellulær tetthet, endringer i fordelingen som noen ganger resulterer i klynger, utvidelse av celle kroppen, samt tykkelse og forkortelse av prosesser knyttet til mer ameboid figurer10,11,12,13.
Immunostaining er begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer rettet mot spesifikke markører. Viktigere er IBA1 uttrykt ved mikroglia, men også av perifere makrofager som infiltrere hjernen14. Mens observasjon av IBA1-positive celler inne i hjernen har blitt en markør for mikroglia i denne forskningen feltet, perifere macrophage infiltrasjon har blitt rapportert under ulike forhold, selv marginalt i sunn hjernen15,16 ,17,18. Følgelig, bruk av IBA1 alene tillater ikke selektiv visualisering av mikroglia. I tillegg har makrofager vedta molekylære og morfologiske funksjoner av fastboende mikroglia når de har infiltrere hjernen, og dermed hindre differensiering19. Dette representerer en utfordring når man undersøker funksjonen til både mikroglia og infiltrere makrofager.
Mens mikroglia og perifere makrofager har distinkt opprinnelse (f. eks, fra embryonale eggeplomme og benmarg, henholdsvis20,21), det er et økende antall funn som indikerer at de to celle populasjoner utøve ulike roller i hjernen19. Det er derfor avgjørende å bruke metoder som diskriminerer mellom disse to populasjoner uten invasiv manipulasjoner (dvs. benmarg chimeras eller parabiose) som kan modulere deres tetthet, distribusjon, morfologi og funksjon. TMEM119 har dukket opp som en mikroglia-spesifikk markør på tvers av helse og sykdom forhold22. Når det kombineres med IBA1, blir denne markøren nyttig for å skille disse cellene fra infiltrere makrofager, som er TMEM119-negative og IBA1-positive. Mens det er developmentally regulert, er TMEM119 uttrykt så tidlig som postnatal dager 3 (P3) og 6 (P6), stadig økende til de når voksen nivåer mellom P10 og P1422. IBA1 uttrykkes så tidlig som embryonale dagen 10,5 (E 10.5)23. Den foreslåtte dobbel merking protokollen er derfor nyttig å studere disse to populasjoner gjennom postnatal livet.
Denne protokollen gir en trinnvis immunostaining prosedyre som tillater diskriminering mellom mikroglia og perifere makrofager. Det forklarer også hvordan å gjennomføre en kvantitativ analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi, samt analyse av perifere macrophage infiltrasjon. Mens etterforskningen av mikroglia og perifere makrofager er nyttig på egen hånd, tillater denne protokollen videre lokalisering av neuroinflammatory Foyers; dermed fungerer det også som en plattform for å identifisere bestemte regioner for å undersøke, med bruk av komplementære (ennå, mer tid-og ressurskrevende) teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen kan deles i to viktige deler: kvaliteten på farging og analyse. Hvis farging ikke er optimal, vil den ikke representerer mikrogliaaggregater celler tilstrekkelig, og dermed påvirker tettheten, fordelingen, og morfologi målinger. I tillegg kan andelen av infiltrasjon perifere myelogen celler undervurderes. Dette er en optimalisert versjon av farge protokollen, men det er flere faktorer som kan føre til suboptimal bilder. Selv om av dyret ikke er inkludert i denne protokollen, hvis hjernen fiksering e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Nathalie Vernoux for hennes veiledning og assistanse med eksperimenter. Vi vil også gjerne takke DRS. Emmanuel Planel og Serge Rivest for bruk av deres fluorescens og konfokalmikroskopi mikroskop, henholdsvis. Dette arbeidet ble delvis finansiert av stipend fra Mexican Council of Science and Technology (CONACYT; til F. G. I), Fondation famille-Choquette og Centre thématique de Recherche en Neurosciences (CTRN; til K.P.), fonds de Recherche du Québec-santé (til M.B.), og Shastri Indo-kanadiske Institute (til K.B.), samt en Discovery stipend fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC) til M.E.T. M.E.T. har en Canada Research Chair (tier II) av Neuroimmune plastisitet i helse og terapi.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
