Immunofluorescensfärgning med IBA1 och TMEM119 för Mikroglial densitet, morfologi och perifer myeloid cell infiltration analys i mushjärna
Summary
Detta protokoll beskriver ett steg-för-steg-arbetsflöde för Immunofluorescerande cofärgning av IBA1 och TMEM119, förutom analys av mikroglial densitet, distribution och morfologi, samt perifer myeloisk cell infiltration i mus hjärnvävnad.
Abstract
Detta är ett protokoll för den dubbla visualiseringen av mikroglia och infiltrerande makrofager i mus hjärnvävnad. TMEM119 (vilka etiketter mikroglia selektivt), i kombination med IBA1 (som ger en exceptionell visualisering av deras morfologi), möjliggör utredning av förändringar i densitet, distribution och morfologi. Kvantifiera dessa parametrar är viktigt för att ge insikter i de roller som utövas av microglia, bosatt makrofager i hjärnan. Under normala fysiologiska förhållanden, mikroglia regelbundet distribueras i en mosaik-liknande mönster och presentera en liten Soma med förgrenade processer. Ändå, som ett svar på miljöfaktorer (dvs trauma, infektion, sjukdom, eller skada), mikroglial densitet, distribution och morfologi ändras på olika sätt, beroende på förolämpningen. Dessutom, den beskrivna dubbel-färgning metod tillåter visualisering av infiltrerande makrofager i hjärnan baserat på deras uttryck av IBA1 och utan colocalization med TMEM119. Detta tillvägagångssätt möjliggör diskriminering mellan mikroglia och infiltrerande makrofager, vilket krävs för att ge funktionella insikter i deras distinkta engagemang i hjärnans homeostas över olika sammanhang av hälsa och sjukdom. Detta protokoll integrerar de senaste fynden i Neuroimmunologi som hänför sig till identifieringen av selektiva markörer. Det fungerar också som ett användbart verktyg för både erfarna neuroimmunologer och forskare som vill integrera Neuroimmunologi i projekt.
Introduction
Oavsett om akut eller kronisk, neuroinflammation är tätt påverkad av microglia, den bosatta makrofager i hjärnan. Att visualisera mikroglia genom immunofärgning är värdefullt för studiet av neuroinflammation med hjälp av ljusmikroskopi, en mycket lättillgänglig teknik. I homeostatiska förhållanden distribueras mikroglia vanligtvis i ett icke-överlappande, mosaik-liknande mönster. De uppvisar små Somas som sträcker förgrenat processer1, som ibland kontakta varandra2. Microglial förgrenat processer dynamiskt undersökning av hjärnparenkymet, interagera med nervceller, andra gliaceller och blodkärl under normala fysiologiska förhållanden3. Microglia är utrustade med en arsenal av receptorer som gör att de kan utföra immunologiska uppgifter och reagera på förändringar i hjärn miljön, celldöd eller vävnadsskada. Dessutom, de utövar viktiga fysiologiska funktioner, särskilt i synaptisk formation, underhåll, och eliminering4,5.
Bland de tillgängliga markörer som används för att studera microglia, Joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1 (IBA1) är en av de mest använda. IBA1 är ett kalcium bindnings protein som ger exceptionell visualisering av mikroglial morfologi, inklusive fina distala processer, vilket bekräftas av elektronmikroskopi6. Detta verktyg har varit avgörande för att karakterisera mikroglial omvandling, tidigare kallad “aktivering”, i ett brett spektrum av djursjukdomar modeller7,8,9. I närvaro av neuroinflammation, den mikrogliala svar inkluderar: microgliosis som definieras som en ökning av cellulär densitet, förändringar i distributionen som ibland resultera i klustring, utvidgningen av cellkroppen, samt förtjockning och förkortning av processer i samband med mer ameboid former10,11,12,13.
Immunofärgning begränsas av tillgången på antikroppar riktade mot specifika markörer. Viktigt, IBA1 uttrycks av mikroglia men också av perifera makrofager som infiltrera hjärnan14. Medan observation av IBA1-positiva celler inne i hjärnan har blivit en markör för mikroglia inom detta forskningsområde, perifer makrofag infiltration har rapporterats under olika förhållanden, även marginellt i den friska hjärnan15,16 ,17,18. Användningen av IBA1 ensamt tillåter därför inte selektiv visualisering av mikroglia. Dessutom, makrofager anta molekylära och morfologiska egenskaper hos Resident mikroglia när de har infiltrerat hjärnan, vilket hindrar differentiering19. Detta är en utmaning när man undersöker funktionen hos både mikroglia och infiltrerande makrofager.
Medan mikroglia och perifera makrofager har distinkta ursprung (t. ex. från den embryonala äggula säcken och benmärgen, respektive20,21), finns det ett ökande antal fynd som indikerar att de två cell populationerna utövar olika roller i hjärnan19. Det är därför viktigt att använda metoder som diskriminerar mellan dessa två populationer utan invasiva manipulationer (dvs., benmärgs chimärer eller parabios) som kan modulera deras densitet, distribution, morfologi, och funktion. TMEM119 har dykt upp som en microglia-specifik markör över hälsa och sjukdomstillstånd22. När den kombineras med IBA1, blir denna markör användbar för att differentiera dessa celler från infiltrerande makrofager, som är TMEM119-negativa och IBA1-positiva. Medan det är utvecklingsreglerat, TMEM119 uttrycks så tidigt som postnatal dag 3 (P3) och 6 (P6), stadigt ökar tills når vuxna nivåer mellan P10 och P1422. IBA1 uttrycks så tidigt som embryonala dag 10,5 (E 10.5)23. Den föreslagna dubbel märkning protokollet är därför användbart att studera dessa två populationer under postnatal liv.
Detta protokoll ger en stegvis immunfärgnings procedur som möjliggör diskriminering mellan mikroglia och perifera makrofager. Det förklarar också hur man genomför en kvantitativ analys av mikroglial densitet, distribution, och morfologi, samt analys av perifer makrofaginfiltration. Medan utredningen av mikroglia och perifera makrofager är användbar på egen hand, detta protokoll ytterligare tillåter lokalisering av neuroinflammatoriska Foyers; Således fungerar det också som en plattform för att identifiera specifika regioner att undersöka, med hjälp av kompletterande (ännu, mer tids-och resurskrävande) tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll kan delas in i två kritiska delar: kvaliteten på färgning och analys. Om infärgning inte är optimalt, kommer det inte att representera mikrogliala celler adekvat, vilket påverkar tätheten, distribution, och morfologi mätningar. Dessutom kan andelen infiltrations perifera myeloida celler underskattas. Detta är en optimerad version av infärgnings protokollet, men det finns flera faktorer som kan resultera i suboptimala bilder. Även om perfusion av djuret inte ingår i detta protokoll, om hjärnan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Nathalie Vernoux för hennes vägledning och hjälp med experimenten. Vi skulle också vilja tacka DRS. Emmanuel Planel och Serge Rivest för användning av deras fluorescens och konfokala Mikroskop, respektive. Detta arbete finansierades delvis av stipendier från mexikanska vetenskaps-och teknik rådet (CONACYT, till F. G. I), Fondation Famille-Choquette och Centre Thématique de Recherche en neurovetenskap (ctrn; to K.P.), fonds de Recherche du Québec-santé (till M.B.), och Shastri Indo-kanadensiska Institute (till K.B.), samt ett Discovery Grant från Natural Sciences och Engineering Research Council of Canada (NSERC) till M.E.T. M.E.T. innehar en Canada Research Chair (Tier II) av Neuroimmunplasticitet i hälsa och terapi.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
