تلطيخ المناعية باستخدام IBA1 و TMEM119 لكثافة Microglial ، المورفولوجية والطرفية الخلية النخاعية تحليل تسلل في الدماغ الماوس
Summary
يصف هذا البروتوكول سير العمل خطوه بخطوه للحصول علي التكلفة المناعية لIBA1 و TMEM119 ، بالاضافه إلى تحليل الكثافة الصغرى والتوزيع والتشكل ، فضلا عن تسلل الخلايا النقوي الطرفية في انسجه المخ الماوس.
Abstract
هذا هو بروتوكول لتصور مزدوج من الخلايا الصغيرة والتسلل الضامة في انسجه المخ الماوس. TMEM119 (التي تسمي الميكروبات الصغيرة بشكل انتقائي) ، عندما يقترن IBA1 (الذي يوفر التصور استثنائيه من المورفولوجية) ، يسمح التحقيق في التغيرات في الكثافة والتوزيع والتشكل. التحديد الكمي لهذه المعلمات أمر مهم في توفير رؤى حول الأدوار التي تمارسها الخلايا الصغيرة ، الضامة المقيمة في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم توزيع الخلايا الصغيرة بانتظام في نمط يشبه الفسيفساء وتقدم سوما صغيره مع العمليات الدقيقة. ومع ذلك ، وكاستجابة للعوامل البيئية (اي الصدمات ، والعدوى ، والمرض ، أو الاصابه) ، يتم تغيير الكثافة الصغرى ، والتوزيع ، والمورفولوجية في مختلف الآداب ، اعتمادا علي الاهانه. بالاضافه إلى ذلك ، فان طريقه التلطيخ المزدوج الموصوفة تسمح بتصور الضامة التسلل في الدماغ استنادا إلى التعبير عن IBA1 ودون التنظير مع TMEM119. التالي فان هذا النهج يسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة المتسللة ، وهو أمر مطلوب لتوفير رؤى وظيفية لمشاركتها المتميزة في توازن الدماغ في مختلف سياقات الصحة والمرض. يدمج هذا البروتوكول أحدث النتائج في المناعة العصبية التي تتعلق بتحديد علامات انتقائية. كما انها بمثابه أداه مفيده لكل من خبراء المناعة العصبية ذوي الخبرة والباحثين الذين يسعون إلى دمج المناعة العصبية في المشاريع.
Introduction
سواء الحاده أو المزمنة ، ويتاثر التهاب العصبي باحكام من الخلايا الصغيرة ، والضامة المقيمين في الدماغ. يعتبر تصور الخلايا الصغيرة من خلال المناعة أمرا قيما لدراسة التهاب العصبي مع استخدام المجهر الضوئي ، وهي تقنيه يمكن الوصول اليها بشكل كبير. في ظروف التماثل المنزلي ، يتم عاده توزيع الخلايا الصغيرة في نمط غير متراكب يشبه الفسيفساء. هم يبديون [سومد] صغيره ان يمدد عمليات [رفيد]1, اي أحيانا اتصلت واحده آخر2. العمليات المجهرية التي يتم مسحها بشكل حيوي الدماغ parenchyma ، والتفاعل مع الخلايا العصبية ، وغيرها من الكريات الدبقيه ، والاوعيه الدموية خلال الظروف الفسيولوجية العادية3. وقد تم تجهيز ميكروليا مع ترسانة من المستقبلات التي تسمح لهم بأداء المهام المناعية والاستجابة للتغيرات في وسط الدماغ, لموت الخلايا, أو لتلف الانسجه. الاضافه إلى ذلك ، فانها تمارس الوظائف الفسيولوجية الرئيسية ، ولا سيما في تشكيل متشابك ، والصيانة ، والقضاء علي4،5.
ومن بين العلامات المتاحة المستخدمة لدراسة الخلايا الصغيرة ، المتاينه الكالسيوم ملزمه محول جزيء 1 (IBA1) هي واحده من أكثر استخداما علي نطاق واسع. IBA1 هو بروتين ملزم للكالسيوم يوفر تصورا استثنائيا لمورفولوجية المجهرية ، بما في ذلك العمليات البعيدة الدقيقة ، كما يؤكد ذلك المجهر الكتروني6. وقد كانت هذه الاداه مفيده في توصيف التحول ميكروجليال ، وكان يسمي سابقا “التنشيط” ، في مجموعه واسعه من الامراض الحيوانية نماذج7،8،9. في وجود التهاب عصبي ، وتشمل الاستجابة ميكروجليال: ميكروجليسيس التي يتم تعريفها بأنها زيادة في كثافة الخلوية ، والتغيرات في التوزيع التي تؤدي في بعض الأحيان إلى التكتل ، وتوسيع جسم الخلية ، وكذلك سماكه تقصير العمليات المرتبطة بالاشكال الأكثر اميبويد10،11،12،13.
المناعة محدوده بتوافر الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات محدده. الأهم من ذلك ، يتم التعبير عن IBA1 من قبل ميكروليا ولكن أيضا من قبل الضامة الطرفية التي تخترق الدماغ14. في حين أصبحت مراقبه الخلايا الايجابيه الIBA1ه داخل المخ علامة علي الميكروبات في هذا المجال البحثي ، تم الإبلاغ عن تسلل الضامة المحيطيه تحت ظروف مختلفه ، حتى هامشيا في الدماغ صحية15،16 و17و18. التالي ، فان استخدام IBA1 وحده لا يسمح التصور الانتقائي من الخلايا الصغيرة. الاضافه إلى ذلك ، تعتمد الضامة السمات الجزيئية والمورفولوجية من الخلايا الدقيقة المقيمة بمجرد انها تسللت إلى الدماغ ، التالي عرقله التمايز19. وهذا يمثل تحديا عند التحقيق في وظيفة كل من الخلايا الصغيرة والضامة التسلل.
في حين ان الخلايا الصغرى والضامة الطرفية لها أصول متميزة (علي سبيل المثال ، من كيس الصفار الجنيني ونخاع العظم ، علي التوالي20،21) ، هناك عدد متزايد من النتائج التي تشير إلى ان اثنين من السكان الخلية تمارس ادوار مختلفه في الدماغ19. التالي فمن الاهميه بمكان استخدام الأساليب التي تميز بين هذين الشعبين دون تلاعبات الغازية (اي النخاع العظمي الشمبانزي أو بارابيوسيس) التي يمكن ان تعدل كثافتها ، والتوزيع ، والشكل ، والوظيفة. وقد برزت TMEM119 كعلامة خاصه بالخلايا الصغيرة في جميع الحالات الصحية والامراض22. عند دمجها مع IBA1 ، يصبح هذا المؤشر مفيدا للتمييز بين هذه الخلايا وبين الضامة التي يتم التسلل اليها ، والتي هي TMEM119 سالبه و IBA1 موجبه. وفي حين انها تخضع للتنظيم التنموي ، فانه يتم التعبير عن TMEM119 في وقت مبكر من أيام ما بعد الولادة 3 (P3) و 6 (الرؤساء الستة) ، وتزداد باطراد حتى تصل إلى مستويات الكبار بين P10 و P1422. ويعبر عن IBA1 في وقت مبكر من اليوم الجنيني 10.5 (E 10.5)23. ولذلك فان البروتوكول المقترح لوضع العلامات المزدوجة مفيد لدراسة هذين النوعين من السكان طوال فتره ما بعد الولادة.
يوفر هذا البروتوكول إجراءات مناعية خطوه بخطوه تسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة الطرفية. كما يشرح كيفيه اجراء تحليل كمي لكثافة ميكروجليال ، والتوزيع ، والمورفولوجية ، فضلا عن تحليل تسلل الضامة المحيطيه. في حين ان التحقيق في الخلايا الصغيرة والضامة الطرفية هو مفيد من تلقاء نفسها, هذا البروتوكول كذلك يسمح توطين الاجنه التهابيه العصبية; التالي ، فانه يعمل أيضا كمنبر لتحديد مناطق معينه للتحقيق فيها ، مع استخدام تقنيات تكميليه (ولكنها أكثر استهلاكا للوقت والموارد).
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن تقسيم هذا البروتوكول في جزاين الحرجة: نوعيه تلطيخ والتحليل. إذا كان تلطيخ ليس الأمثل ، وسوف تفشل في تمثيل الخلايا الدقيقة بشكل كاف ، التالي تؤثر علي الكثافة ، والتوزيع ، وقياسات المورفولوجية. الاضافه إلى ذلك ، يمكن الاستهانة بنسبه الخلايا النخاعية الطرفية للتسلل. هذا هو الإصدار الأم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لناتالي فرناكس علي توجيهها ومساعدتها في التجارب. ونود أيضا ان نشكر السيد ايمانويل بلانيل سيرج ريفيست لاستخدامهما المجاهر والمجهر المحوري ، علي التوالي. وقد مول هذا العمل جزئيا بمنح دراسية من المجلس المكسيكي للعلم والتكنولوجيا (CONACYT ؛ إلى الاتحاد الأعصاب) ، ومؤسسه العائلة المختارة ومركز البحوث العلمية الخاصة (ك) ، وصندوق البحوث في كيبيك-سانتيه (إلى م.) ، معهد shastri الهندي الكندي (إلى K.B.) ، فضلا عن منحه ديسكفري من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا (NSERC) إلى M.E.T. M.E.T. يحمل كرسي البحوث الكندية (الطبقة الثانية) من اللدونة المناعية العصبية في الصحة والعلاج.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
