Immunofluorescens farvning ved hjælp af IBA1 og TMEM119 til Mikroglial tæthed, morfologi og perifer myeloid celle infiltration analyse i muse hjernen
Summary
Denne protokol beskriver en trin-for-trin arbejdsgang for immunfluorescent cofarvning af IBA1 og TMEM119, foruden analyse af mikroglial tæthed, distribution, og morfologi, samt perifer myeloid celleinfiltration i mus hjernevæv.
Abstract
Dette er en protokol til dual visualisering af microglia og infiltrerende makrofager i mus hjernevæv. TMEM119 (som etiketter microglia selektivt), når det kombineres med IBA1 (som giver en usædvanlig visualisering af deres morfologi), tillader undersøgelse af ændringer i tæthed, fordeling, og morfologi. Det er vigtigt at kvantificere disse parametre for at give indsigt i de roller, der udøves af microglia, hjernens hjemmehørende makrofager. Under normale fysiologiske forhold distribueres microglia regelmæssigt i et mosaiklignende mønster og præsenterer en lille Soma med forgrenede processer. Ikke desto mindre, som en reaktion på miljømæssige faktorer (dvs., traumer, infektion, sygdom, eller skade), mikroglial tæthed, distribution, og morfologi er ændret i forskellige manerer, afhængigt af fornærmelse. Desuden giver den beskrevne dobbelt farvning metode visualisering af infiltrerende makrofager i hjernen baseret på deres udtryk for IBA1 og uden samlokalisering med TMEM119. Denne tilgang giver således mulighed for diskrimination mellem microglia og infiltrering af makrofager, som er nødvendig for at give funktionel indsigt i deres særskilte involvering i hjernens homøostase på tværs af forskellige sammenhænge af sundhed og sygdom. Denne protokol integrerer de seneste fund i Neuro immunologi, der vedrører identifikationen af selektive markører. Det fungerer også som et nyttigt redskab for både erfarne Neuro immunologer og forskere, der søger at integrere Neuro Immunologi i projekter.
Introduction
Uanset om akut eller kronisk, neuroinflammation er tæt påvirket af microglia, de residente makrofager i hjernen. Visualisering af microglia gennem immun farvning er værdifuldt for studiet af neuroinflammation med brug af let mikroskopi, en meget tilgængelig teknik. I homeostatiske forhold distribueres microglia typisk i et ikke-overlappende mosaiklignende mønster. De udviser små Somas, der udvider forgrenede processer1, som undertiden kontakter hinanden2. Microglial forgrenede processer dynamisk undersøgelse hjernen parenchyma, interagere med neuroner, andre gliale celler, og blodkar under normale fysiologiske betingelser3. Microglia er udstyret med et arsenal af receptorer, der giver dem mulighed for at udføre immunologiske opgaver og reagere på ændringer i hjernen Milieu, celledød, eller vævsskader. Desuden, de udøver vigtige fysiologiske funktioner, især i synaptisk dannelse, vedligeholdelse, og elimination4,5.
Blandt de tilgængelige markører, der anvendes til at studere microglia, er ioniseret calcium bindende adapter molekyle 1 (IBA1) en af de mest udbredte. IBA1 er et calcium bindende protein, der giver enestående visualisering af mikroglial morfologi, herunder fine distale processer, som bekræftet af elektronmikroskopi6. Dette værktøj har været medvirkende til at karakterisere mikroglial transformation, tidligere kaldet “aktivering”, i en bred vifte af dyresygdomme modeller7,8,9. I nærværelse af neuroinflammation, den mikrogliale respons omfatter: microgliose, der er defineret som en stigning i cellulær tæthed, ændringer i fordelingen, der undertiden resulterer i klyngedannelse, udvidelse af celle kroppen, samt fortykkelse og afkortning af processer forbundet med flere ameboid figurer10,11,12,13.
Immun farvning er begrænset af tilgængeligheden af antistoffer rettet mod specifikke markører. Det er vigtigt, at IBA1 udtrykkes af microglia, men også af perifere makrofager, der infiltrerer hjernen14. Mens observation af IBA1-positive celler inde i hjernen er blevet en markør for microglia i dette forskningsområde, perifer makrofag infiltration er blevet rapporteret under forskellige betingelser, selv marginalt i den raske hjerne15,16 ,17,18. Derfor tillader brugen af IBA1 alene ikke selektiv visualisering af microglia. Desuden, makrofager vedtage molekylære og morfologiske egenskaber af Resident microglia, når de har infiltreret hjernen, hvilket hindrer differentiering19. Dette udgør en udfordring, når man undersøger funktionen af både microglia og infiltrerer makrofager.
Mens microglia og perifere makrofager har forskellige oprindelser (f. eks. fra den embryonale blomme sæk og knoglemarv, henholdsvis20og21), er der et stigende antal fund, som indikerer, at de to cellepopulationer udøver forskellige roller i hjernen19. Det er derfor afgørende at anvende metoder, der diskriminerer mellem disse to populationer uden invasive manipulationer (dvs. knoglemarv kimærer eller parabioose), der kan moduere deres tæthed, fordeling, morfologi, og funktion. TMEM119 er dukket op som en microglia-specifik markør på tværs af sundheds-og sygdomsforhold22. Når det kombineres med IBA1, bliver denne markør nyttig til at differentiere disse celler fra infiltrering af makrofager, som er TMEM119-negative og IBA1-positive. Mens det er udviklingsmæssigt reguleret, TMEM119 udtrykkes så tidligt som postnatal dag 3 (P3) og 6 (P6), støt stigende indtil nå voksne niveauer mellem P10 og P1422. IBA1 udtrykkes så tidligt som embryonal dag 10,5 (E 10.5)23. Den foreslåede dobbelt mærkning protokol er derfor nyttigt at studere disse to populationer i hele postnatale liv.
Denne protokol giver en trin-for-trin immunofarvning procedure, der tillader diskrimination mellem microglia og perifere makrofager. Det forklarer også, hvordan man gennemfører en kvantitativ analyse af mikroglial tæthed, distribution og morfologi samt analyse af perifer makrofag infiltration. Mens undersøgelsen af microglia og perifere makrofager er nyttig på sin egen, denne protokol giver yderligere lokalisering af neuroinflammatoriske Foyers; det fungerer således også som en platform til at identificere specifikke regioner, der skal undersøge, med anvendelse af supplerende (endnu, mere tids-og ressourceforbrugende) teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol kan opdeles i to kritiske dele: kvaliteten af farvning og analyse. Hvis farvning ikke er optimal, vil det ikke repræsentere mikrogliale celler tilstrækkeligt, hvilket påvirker tætheden, fordelingen og morfologiske målinger. Desuden kan andelen af infiltration perifere myeloide celler undervurderes. Dette er en optimeret version af farvnings protokollen, men der er flere faktorer, der kan resultere i suboptimale billeder. Selv om perfusion af dyret ikke er inkluderet i denne protokol, hvis hjernen fiks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Nathalie Vernoux for hendes vejledning og hjælp til eksperimenterne. Vi vil også gerne takke DRs. Emmanuel Planel og Serge Rivest for brugen af deres fluorescens og confokale mikroskoper, hhv. Dette arbejde blev delvist finansieret af stipendier fra det mexicanske råd for videnskab og teknologi (CONACYT; til F. G. I), Fondation famille-Choquette og centre thématique de Recherche en Neuro Sciences (CTRN; to K.P.), fonds de Recherche du Québec-Santé (til M.B.), og Shastri Indo-Canadian Institute (til K.B.), samt en opdagelse tilskud fra Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada (NSERC) til M.E.T. M.E.T. besidder en Canada forskning stol (tier II) af Neuroimmune plasticitet i sundhed og terapi.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
- Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
- Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
- Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
- Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
- Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
- Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
- Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
- Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).
