Summary

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Published: October 27, 2019
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Abstract

Dies ist ein Protokoll zur dualen Visualisierung von Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen im Gehirngewebe der Maus. TMEM119 (das Mikroglia selektiv kennzeichnet), in Kombination mit IBA1 (das eine außergewöhnliche Visualisierung ihrer Morphologie bietet) ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen in Dichte, Verteilung und Morphologie. Die Quantifizierung dieser Parameter ist wichtig, um Einblicke in die Rolle zu geben, die von Mikroglia, den ansässigen Makrophagen des Gehirns, ausgeübt wird. Unter normalen physiologischen Bedingungen werden Mikroglia regelmäßig in einem mosaikartigen Muster verteilt und stellen ein kleines Soma mit verzweigten Prozessen dar. Als Reaktion auf Umweltfaktoren (z. B. Trauma, Infektion, Krankheit oder Verletzung) werden mikrogliaale Dichte, Verteilung und Morphologie je nach Beleidigung auf unterschiedliche Weise verändert. Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Doppelfärbungsmethode die Visualisierung von infiltrierenden Makrophagen im Gehirn basierend auf ihrer Expression von IBA1 und ohne Kolokalisierung mit TMEM119. Dieser Ansatz ermöglicht somit die Diskriminierung zwischen Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen, die erforderlich ist, um funktionelle Einblicke in ihre ausgeprägte Beteiligung an der Homöostase des Gehirns in verschiedenen Kontexten von Gesundheit und Krankheit zu geben. Dieses Protokoll integriert die neuesten Erkenntnisse in der Neuroimmunologie, die sich auf die Identifizierung selektiver Marker beziehen. Es dient auch als nützliches Werkzeug für erfahrene Neuroimmunologen und Forscher, die Neuroimmunologie in Projekte integrieren möchten.

Introduction

Ob akut oder chronisch, Neuroinflammation wird stark durch Mikroglia beeinflusst, die ansässigen Makrophagen des Gehirns. Die Visualisierung von Mikroglia durch Immunfärbung ist wertvoll für die Untersuchung von Neuroinflammation mit dem Einsatz der Lichtmikroskopie, einer hochzugänglichen Technik. Bei homeostatischen Bedingungen werden Mikroglia in der Regel in einem nicht überlappenden, mosaikartigen Muster verteilt. Sie zeigen kleine Somas, die verzweigte Prozesse erweitern1, die manchmal miteinander in Kontakt treten2. Mikrogliale verzweigte Prozesse vermessen dynamisch das Blutparenchym und interagieren mit Neuronen, anderen Gliazellen und Blutgefäßen während normaler physiologischer Bedingungen3. Microglia sind mit einem Arsenal von Rezeptoren ausgestattet, die es ihnen ermöglichen, immunologische Aufgaben auszuführen und auf Veränderungen im Gehirnmilieu, auf Zelltod oder Gewebeschäden zu reagieren. Darüber hinaus üben sie wichtige physiologische Funktionen aus, insbesondere in der synaptischen Bildung, Wartung und Elimination4,5.

Unter den verfügbaren Markern, die zur Untersuchung von Mikroglia verwendet werden, ist das ionisierte Calciumbindungsadaptermolekül 1 (IBA1) eines der am häufigsten verwendeten. IBA1 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das eine außergewöhnliche Visualisierung der mikroglialen Morphologie, einschließlich feiner distaler Prozesse, bietet, wie durch Elektronenmikroskopie6bestätigt wird. Dieses Tool war maßgeblich an der Charakterisierung der mikrogliaalen Transformation, früher als “Aktivierung” bezeichnet, in einer Vielzahl von Tierseuchenmodellen7,8,9. In Gegenwart von Neuroinflammation, die mikrogliaale Reaktion umfasst: Mikrogliase, die als eine Erhöhung der Zelldichte definiert ist, Veränderungen in der Verteilung, die manchmal zu Clustering führen, Vergrößerung des Zellkörpers, sowie Verdickung und Verkürzung der Prozesse, die mit mehr Ameboidformen verbunden sind10,11,12,13.

Die Immunfärbung wird durch die Verfügbarkeit von Antikörpern begrenzt, die gegen bestimmte Marker gerichtet sind. Wichtig ist, dass IBA1 durch Mikroglia, aber auch durch periphere Makrophagen ausgedrückt wird, die das Gehirn infiltrieren14. Während die Beobachtung von IBA1-positiven Zellen im Gehirn zu einem Marker von Mikroglia in diesem Forschungsgebiet geworden ist, wurde die periphere Makrophageninfiltration unter verschiedenen Bedingungen berichtet, sogar geringfügig im gesunden Gehirn15,16 ,17,18. Folglich erlaubt die Verwendung von IBA1 allein keine selektive Visualisierung von Mikroglia. Darüber hinaus übernehmen Makrophagen molekulare und morphologische Merkmale der ansässigen Mikroglia, sobald sie das Gehirn infiltriert haben, wodurch die Differenzierung behindert wird19. Dies stellt eine Herausforderung bei der Untersuchung der Funktion sowohl der Mikroglia als auch der Infiltrierung von Makrophagen dar.

Während Mikroglia und periphere Makrophagen unterschiedliche Ursprünge haben (z. B. aus dem embryonalen Eigelbsack bzw.20,21), gibt es immer mehr Befunde, die darauf hindeuten, dass die beiden Zellpopulationen verschiedene Rollen im Gehirn19. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, Methoden zu verwenden, die zwischen diesen beiden Populationen ohne invasive Manipulationen (d. h. Knochenmarkchimeren oder Parabiose) unterscheiden, die ihre Dichte, Verteilung, Morphologie und Funktion modulieren können. TMEM119 hat sich als mikrogliaspezifischer Marker für Gesundheit und Krankheit sprägsiert22. In Kombination mit IBA1 wird dieser Marker nützlich, um diese Zellen von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden, die TMEM119-negativ und IBA1-positiv sind. Während es entwicklungsreguliert ist, wird TMEM119 bereits in den postnatalen Tagen 3 (P3) und 6 (P6) ausgedrückt und steigt stetig an, bis das Erwachsenenniveau zwischen P10 und P1422erreicht wird. IBA1 wird bereits am embryonalen Tag 10.5 (E10.5)23ausgedrückt. Das vorgeschlagene Doppelkennzeichnungsprotokoll ist daher nützlich, um diese beiden Populationen während des gesamten postnatalen Lebens zu untersuchen.

Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Immunstaining-Verfahren, das eine Diskriminierung zwischen Mikroglia und peripheren Makrophagen ermöglicht. Außerdem wird erläutert, wie eine quantitative Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie die Analyse der peripheren Makrophageninfiltration durchgeführt werden kann. Während die Untersuchung von Mikroglia und peripheren Makrophagen allein nützlich ist, ermöglicht dieses Protokoll weiterhin die Lokalisierung neuroinflammatorischer Foyers; Daher dient es auch als Plattform, um bestimmte zu untersuchende Regionen zu identifizieren, wobei ergänzende (noch zeit- und ressourcenverbrauchende) Techniken verwendet werden.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommissionen in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care und dem Animal Care Committee der Université Laval durchgeführt. 1. Immunostainierung Wählen Sie mit Hilfe eines Hirnatlas drei Maushirnabschnitte aus, die den Interessenbereich (ROI) (d. h. den Hippocampus) enthalten. Legen Sie die Abschnitte in eine Kunststoff-Multi-Well-Platte und bedecken Sie sie mi…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Co-Kennzeichnung von Mikroglia mit IBA1 und TMEM119 in einem koronalen Abschnitt des dorsalen Hippocampus, der mit 20x durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet ist. Eine erfolgreiche Färbung zeigt mikrogliaale Zellkörper und ihre feinen Prozesse (Abbildung 1A-C). Diese Färbung ermöglicht die Bestimmung der mikrogliaalen Dichte und Verteilung und Identifizierung von mikrogliaalen Clustern …

Discussion

Dieses Protokoll kann in zwei kritische Teile unterteilt werden: Qualität der Färbung und Analyse. Wenn die Färbung nicht optimal ist, wird sie mikrogliaale Zellen nicht angemessen darstellen, was die Dichte-, Verteilungs- und Morphologiemessungen beeinflusst. Darüber hinaus kann der Anteil der infiltrationsperipheren myeloischen Zellen unterschätzt werden. Dies ist eine optimierte Version des Färbeprotokolls, aber es gibt mehrere Faktoren, die zu suboptimalen Bildern führen können. Auch wenn die Durchblutung des…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Nathalie Vernoux für ihre Anleitung und Unterstützung bei den Experimenten. Wir danken auch Drs. Emmanuel Planel und Serge Rivest für den Einsatz ihrer Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien des Mexican Council of Science and Technology (CONACYT; to F.G.I), Fondation Famille-Choquette und Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec – Santé (zu M.B.) und Shastri Indo-Canadian Institute (zu K.B.) sowie ein Discovery-Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) an M.E.T. M.E.T. hält einen Canada Research Chair (Tier II) of Neuroimmune Plasticity in Health and Therapy.

Materials

Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

References

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Cite This Article
González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

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