Fusione cellulare di linee cellulari modificate per la perturbazione della struttura cellulare e della funzione
Summary
Lo scopo di questo protocollo è quello di fondere due diversi tipi di cellule per creare cellule ibride. L’analisi della microscopia a fluorescenza delle cellule fuse viene utilizzata per tracciare la cellula di origine degli organelli cellulari. Questo saggio può essere usato per esplorare come la struttura cellulare e la funzione rispondono alla perturbazione con la fusione cellulare.
Abstract
La vita è suddivisa spazialmente all’interno di membrane lipidiche per consentire la formazione isolata di stati molecolari distinti all’interno di cellule e organelli. La fusione cellulare è la fusione di due o più cellule per formare una singola cellula. Qui forniamo un protocollo per la fusione cellulare di due diversi tipi di cellule. Le cellule ibride fuse sono arricchite da uno smistamento a base di citometria di flusso, seguito dalla microscopia a fluorescenza della struttura e funzione delle cellule ibride. Le proteine fluorescenti etichettate generate dall’editing del genoma sono immagini all’interno delle cellule fuse, consentendo di identificare le strutture cellulari in base all’emissione di fluorescenza e di tornare al tipo di origine della cellula. Questo metodo robusto e generale può essere applicato a diversi tipi di cellule o organelli di interesse, per comprendere la struttura cellulare e la funzione in una serie di domande biologiche fondamentali.
Introduction
La manutenzione omeostatica della struttura cellulare è fondamentale per la vita. Le cellule hanno morfologie caratteristiche, numeri di orgelli subcellulari e composizione biochimica interna. Comprendere come vengono generate queste proprietà fondamentali e come vanno in stato di sfago durante la malattia richiede strumenti di laboratorio per perturbarli.
La fusione cellulare è la fusione di due o più celle separate. La fusione cellulare potrebbe essere stata fondamentale per l’emergere della vita eucarica1. Nel corpo umano, la fusione cellulare è relativamente rara, che si verifica durante circostanze di sviluppo e tipi di tessuto limitati, come durante la fecondazione o la formazione di muscoli, ossa e placenta2. Questo protocollo descrive l’induzione della fusione cellulare-cellula nelle linee cellulari di coltura dei tessuti con organelli etichettati in modo differenziale fluorescente, come strumento per comprendere i meccanismi che controllano la struttura e la funzione delle cellule.
La fusione cellulare-cellula indotta in vitro è fondamentale per la produzione di anticorpi monoclonali3,uno strumento importante per la ricerca biologica e il trattamento delle malattie. La fusione cellulare è stata utilizzata anche per porre molte diverse domande biologiche fondamentali delle cellule sulla dominanza del ciclo cellulare4, aneeuploidy5,6, riprogrammazione cellulare7,8, riparazione dei neuroni danneggiati9, proliferazione virale10, apoptosi11, tumorigenesi12, dinamiche citoscheletriche13e fusione della membrana14,15. Metodi basati su laboratorio per indurre la fusione cellulare-cellula16,17,18,19 indurre coalescenza della membrana lipidica attraverso la fusione fisica di due bistrati in uno. La fusione cellulare può essere indotta dall’elettricità18, dai metodi a base virale17, dal riscaldamento termoplascio20,dall’espressione transgenica19e da sostanze chimiche tra cui il glicole di polietilene (PEG)16,21,22.
I centrosori sono centri di organizzazione dei microtubuli che controllano la forma cellulare, la motilità, la polarizzazione e la divisione23. Le radici centrosomiche sono strutture fibrose che si estendono dai centrosomi contenenti la radice della proteina24 (codificata dal gene CROCC). Recentemente abbiamo usato la fusione cellulare-cellula per capire come la posizione e il numero del centrosome varialli all’interno degli etokaryon rispetto alle cellule parentali24. La logica alla base dell’uso di questo metodo è quella di tracciare la cellula di origine delle radici all’interno di un eterokaryon dopo la fusione di cellule parentali marcate in modo differenziale fluorescente, e quindi per immagini di fusione e fissione dell’organello. Le proteine fluorescenti etichettate rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I sono create dall’editing del genoma in linee cellulari separate che vengono poi fuse dalla fusione cellulare mediata da PEG. Descriviamo l’uso di coloranti cellulari (Tabella dei materiali) per identificare le cellule fuse per citometria di flusso e successiva identificazione della microscopia a fluorescenza della cellula centrosoria di origine e morfologia ( Figura1). Questo approccio è un metodo robusto e unico per studiare come i grandi cambiamenti nello stato cellulare, tra cui il numero di organelle, incidono sull’omeostasi cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dimostriamo un protocollo facile ed economico per fondere le cellule e visualizzare la successiva architettura di ibridi cellulari con microscopia, impiegando circa due giorni dall’inizio alla fine. Le parti critiche di questo protocollo sono l’arricchimento delle cellule fuse mediante l’ordinamento delle cellule (sezione protocollo 3) e un’attenta convalida delle cellule fuse mediante microscopia (sezione protocollo 4). Queste sezioni assicurano che le cellule fuse siano facilmente ottenute e siano eteoka fideeeoni. Le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numero 100090/12/ s). Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Ashok Venkitaraman e Paul French per la consulenza critica e la guida sul progetto. Ringraziamo Chiara Cossetti e Gabriela Grondys-Kotarba presso lo stabilimento Cytometry del Cambridge Institute for Medical Research Flow per un eccellente supporto. Ringraziamo Liam Cassiday, Thomas Miller e Gianmarco Contino per aver revisionato il manoscritto.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
