Summary

Fusão célula-célula de linhas celulares editados do genoma para perturbação da estrutura celular e função

Published: December 07, 2019
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Summary

O objetivo deste protocolo é fundir dois tipos de células diferentes para criar células híbridas. A análise da microscopia da fluorescência de pilhas fundidas é usada para seguir a pilha da origem de organelas celulares. Este ensaio pode ser usado para explorar como a estrutura celular e função responder à perturbação por fusão celular.

Abstract

A vida é espacialmente divisória dentro das membranas lipídicas para permitir a formação isolada de estados moleculares distintos dentro de células e organelas. A fusão celular é a fusão de duas ou mais células para formar uma única célula. Aqui nós fornecemos um protocolo para a fusão celular de dois tipos de células diferentes. As células híbridas fundidas são enriquecidas pela classificação baseada em citometria de fluxo, seguida supérpia de fluorescência da estrutura e função das células híbridas. As proteínas fluorescentemente marcadas geradas pela edição do genoma são imagemdas dentro de células fundidas, permitindo que estruturas celulares sejam identificadas com base na emissão de fluorescência e referenciadas de volta ao tipo de origem celular. Este método robusto e geral pode ser aplicado a diferentes tipos de células ou organelas de interesse, para compreender a estrutura celular e função em uma série de questões biológicas fundamentais.

Introduction

A manutenção homeostática da estrutura celular é fundamental para a vida. As células têm morfologias características, números de organelasubcelulares e composição bioquímica interna. Compreender como essas propriedades fundamentais são geradas e como elas dão errado durante a doença requer ferramentas de laboratório para perturbá-las.

A fusão celular é a fusão de duas ou mais células separadas. A fusão celular pode ter sido fundamental para o surgimento da vida eucariótica1. No corpo humano, a fusão celular é relativamente rara, ocorrendo durante circunstâncias de desenvolvimento restritas e tipos de tecido, como durante a fertilização ou a formação de músculo, osso e a placenta2. Este protocolo descreve a indução da fusão celular-célula em linhas celulares da cultura do tecido com organelas diferencialmente rotuladas fluorescentemente, como uma ferramenta para entender os mecanismos que controlam a estrutura e a função celular.

A fusão celular induzida in vitro é central para a produção de anticorpos monoclonais3,uma ferramenta importante para pesquisa biológica e tratamento de doenças. A fusão celular também tem sido usada para fazer muitas perguntas biológicas de células fundamentais diferentes sobre a dominância do ciclo celular4,aneuploide5,6,reprogramação celular7,8,o reparo dos neurônios danificados9,proliferação viral10, apoptose11, tumorigênese12,dinâmica citosquelética13,e fusão de membrana14,15. Métodos baseados em laboratório para induzir a fusão celular-célula16,17,18,19 induzir a coalescência da membrana lipídica através da fusão física de dois bilayers em um. A fusão celular pode ser induzida pela eletricidade18,métodos baseados em virais17,aquecimento termoplósma20,expressão transgênica19,e produtos químicos, incluindo polietileno glicol (PEG)16,21,22.

Os centros são centros organizadores de microtúbulos que controlam a forma celular, a motilidade, a polarização e a divisão23. Raízes centrosomal são estruturas fibrosas que se estendem de centrossomes contendo a raiz de proteína24 (codificada pelo gene CROCC). Recentemente usamos a fusão celular-célula para entender como a posição e o número centrosome variam dentro dos heterokaryons em relação às células parentais24. A lógica por trás do uso deste método é rastrear a célula de origem das raízes dentro de um heterokaryon após a fusão de células parentais diferencialmente fluorescentes marcadas e, portanto, a fusão e fissão de organela de imagem. As proteínas fluorescentemente marcadas rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I são criados pela edição do genoma em linhas celulares separadas que são então fundidos pela fusão celular peg-mediada. Descrevemos o uso de corantes celulares(Tabela de Materiais)para identificar células fundidas por citometria de fluxo e subsequente identificação de microscopia de fluorescência da célula de origem e morfologia centrosome (Figura 1). Esta abordagem é um método robusto e único para estudar como as principais mudanças no estado celular, incluindo o número organela impinge sobre a homeostase celular.

Protocol

1. Rotulagem de células fluorescentes diferenciais Marcação de genes com CRISPR Cas9 Use crispr cas9 genoma edição para tag rootletin (ou outros genes de interesse) com as proteínas fluorescentes meGFP ou mScarlet-I em linhas de células cancerosas humanas.Nota: Protocolos detalhados para edição do genoma são cobertos em outros lugares24,25,26. Rotulagem de c…

Representative Results

Células devidamente rotuladas são visíveis durante a citometria de fluxo por sinal de fluorescência maior do que as células de controle não rotuladas (Figura 2A). As portas são ajustadas para a classificação de pilhas positivas dobro, enriquecendo esta população diretamente em pratos da imagem latente para umas análises microscópicas mais adicionais. As células fundidas são detectáveis como células distintas duplamente positi…

Discussion

Demonstramos um protocolo fácil e econômico para a fusão de células e a visualização da arquitetura subsequente de híbridos celulares com microscopia, levando aproximadamente dois dias do início ao fim. Partes críticas deste protocolo são o enriquecimento de células fundidas por classificação celular (seção 3 protocolar), e validação cuidadosa de células fundidas por microscopia (seção de protocolo 4). Estas seções garantem que as células fundidas são facilmente obtidas e são heterokaryons de boa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por um Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship para R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). O financiador não teve nenhum papel no projeto do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman e Paul French por conselhos críticos e orientações sobre o projeto. Agradecemos a Chiara Cossetti e Gabriela Grondys-Kotarba no Instituto de Pesquisa Médica de Cambridge Flow Citometria facilidade para um excelente apoio. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller e Gianmarco Contino pela revisão do manuscrito.

Materials

15 ml tube Sarstedt 62554502
37% formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope Carl Zeiss
8-well imaging dishes Ibidi 80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody Chromotek gba-488
BD Influx Cell Sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Cell Filters (70um) Biofil CSS010070
CellTrace Far Red ThermoFisher Scientific C34572
CellTrace Violet ThermoFisher Scientific C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate ThermoFisher Scientific 31966021
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody NanoTag Biotechnologies N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium Sigma-Aldrich 21083027
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich 15140122
Phenol red free DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 Sigma-Aldrich P7181
Polypropylene tubes BD Falcon 352063
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 nonionic surfactant
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Tween 20 Fisher BioReagents BP337 nonionic detergent

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Cite This Article
Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function. J. Vis. Exp. (154), e60550, doi:10.3791/60550 (2019).

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