Summary
Denne protokol giver en nem at håndtere metode til kultur tarmcellerne fra havet agurk Apostichopus japonicus og er kompatibel med en række bredt tilgængelige vævsprøver fra marine organismer, herunder ECHINODERMATA, Mollusca, og krebsdyr.
Abstract
Primær dyrkede celler anvendes i en række videnskabelige discipliner som usædvanligt vigtige værktøjer til funktionel evaluering af biologiske stoffer eller karakterisering af specifikke biologiske aktiviteter. Men på grund af manglen på universelt anvendelig cellekultur medier og protokoller, velbeskrevne cellekultur metoder til marine organismer er stadig begrænset. I mellemtiden hindrer den almindeligt forekommende mikrobielle kontaminering og polytrope egenskaber af marine hvirvelløse celler yderligere etableringen af en effektiv cellekultur strategi for hvirvelløse havdyr. Her beskriver vi en nem at håndtere metode til dyrkning af tarmceller fra havagurk Apostichopus japonicus; Derudover giver vi et eksempel på in vitro apoptose induktion og detektion i primære dyrkede tarmceller. Desuden giver dette eksperiment oplysninger om den relevante dyrkningsmedium og celle indsamlingsmetode. Den beskrevne protokol er kompatibel med en række bredt tilgængelige vævsprøver fra marine organismer, herunder ECHINODERMATA, Mollusca, og krebsdyr, og det kan give tilstrækkelige celler til flere in vitro eksperimentelle applikationer. Denne teknik vil gøre det muligt for forskerne effektivt at manipulere primær cellekulturer fra hvirvelløse havdyr og at lette den funktionelle evaluering af målrettede biologiske materialer på celler.
Introduction
Dyrkning af celler under kunstigt kontrollerede forhold, og ikke i deres naturlige miljø, giver ensartede eksperimentelle materialer til biologiske undersøgelser, især for arter, der ikke let kan dyrkes i et laboratoriemiljø. Marine hvirvelløse dyr tegner sig for mere end 30% af alle dyrearter1, og de leverer talrige biologiske materialer til forskning i reguleringsmekanismerne for specifikke biologiske processer, såsom regenerering2,3, stress respons4, og miljøtilpasning5,6.
Havet agurk, Apostichopus japonicus, er en af de mest studerede echinoderm arter, der lever tempererede farvande langs den nordlige Stillehav kyst. Det er velkendt som en kommercielt vigtig art og havdet i stor skala i Østasien, især i Kina7. Talrige videnskabelige spørgsmål vedrørende A. japonicus, herunder de regulerende mekanismer underliggende tarm regenerering efter udtagning8 og degeneration i aestivation9, metaboliske kontrol10,11, og immunrespons12,13 under termiske eller patogene belastninger, har tiltrukket sig opmærksomhed fra forskere. Men sammenlignet med velstuderet model dyr, grundforskning, især på cellulært niveau, er begrænset af tekniske flaskehalse, såsom manglen på avancerede cellekultur metoder.
Forskerne har viet en stor indsats for at etablere cellelinjer, men de har også stået over for mange udfordringer, og ingen cellelinje fra nogen Marine hvirvelløse er blevet etableret endnu14. Imidlertid har primære cellekulturer fra hvirvelløse havdyr fremskreden i de sidste årtier15,16, og de har givet mulighed for eksperimenter på cellulært niveau. For eksempel er den regenererende intesine fra A. japonicus blevet udnyttet som en kilde til celler for langsigtede cellekulturer, som leverede en praktisk metode til primær cellekultur af marine hvirvelløse dyr17. Denne protokol kombineret og optimeret hvirvelløse cellekultur tilgange og udviklet en bredt egnet primær kultur metode til havagurk eller andre marine hvirvelløse dyr.
Apoptose er en iboende celle selvmord program udløst af forskellige eksogene og endogene stimuli. Koordineret apoptose er afgørende for mange biologiske systemer18,19, og det har været impliceret i tarm regression af havagurk under aestivation9. For at undersøge den apoptotiske proces i interesse organismer er der blevet etableret en række metoder, herunder Hoechst-farvning og mikroskopi analyser, og20er blevet anvendt med succes. Her udførte vi apoptose induktion og detektion i primære dyrkede tarmceller af havagurk for at vurdere anvendeligheden af primære celler i biologiske undersøgelser af hvirvelløse havdyr. Dexamethason, en af de almindeligt anvendte syntetiske glukokortikosteroider21, blev brugt til at inducere apoptose i dyrkede tarmceller fra havagurk, og betydelige Hoechst 33258 signal blev med succes påvist i de farvede celler ved fluorescerende mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af cellekultur medium
-
Præparation af coelomic væske
- Coelomic væske samling: Under sterile forhold, dissekere en sund havagurk (våd vægt på 85-105 g), indsamle coelomic væske, og opbevar den i en steril glas kolbe.
- Coelomic celle fjernelse: Den coelomic væske centrifugeres i 50 mL centrifugeglas ved 1.700 x g i 5 min., og supernatanten overføres til en ny steril glas kolbe. Dernæst indsamle celle-fri coelomic væske af havet agurk.
- Komplementkomponenter inaktivering: Den sterile glas kolbe, der indeholder havagurkvæsken, inkuberes i et 40 – 50 °C vandbad i 20 – 40 minutter for at opnå komplementkomponenter – inaktiveret coelomic væske.
- Mikrobe fjernelse: Fjerne bakterier og klamydia ved filtrering gennem 0,22 μm membranfiltre. Fjern derefter Mycoplasma og andre fine partikler ved filtrering med 0,1 μm membranfiltre for at opnå coelomic væske forbehandlings opløsning.
- Justering af saltholdighed: Juster saltholdighed af den coelomic væske forbehandlings opløsning til 30‰ (målt ved salinometer) ved tilsætning af 20% høj koncentration præsteriliseret og filtreret NaCl opløsning (fortyndet af forbehandlet coelomic Fluid) eller DDW (dobbeltdestilleret vand). Overfør havagurken coelomic Fluid til en steril flaske, Forsegl flasken, og opbevar væsken ved 4 °C for yderligere eksperimenter.
-
Leibovitz s L-15 cellekulturmedium optimering
- Vejer 5,05 g NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g af CaCl2, 0,25 g af na2så4, 0,975 g mgcl2, 0,25 g glucose, og 6,25 mg taurin og fortynde dem i 40 ml af Leibovitz s L-15 medium i et 50 ml sterilt centrifugeglas. Rør røret på en shaker i 1 time for at sikre, at salte er opløst fuldstændigt.
- Tilsæt 2,5 mL L-glutamin (100 mg/mL) og 500 μL VE opløsning (1,75 mg/L) i tidligere forberedte Leibovitz s L-15 medium og yderligere filtrere mediet gennem 0,22 μm membranfiltre.
- Den totale mellem volumen justeres til 500 mL med frisk Leibovitz s L-15 medium og med 100 mL tidligere tilberedt coelomic væske; Juster derefter pH til 7,6 ved hjælp af NaOH-opløsning. Opbevar Operations processen i et sterilt miljø. Den sammensætnings ratio af coelomic Fluid kan være 10%-50%, og 20% er tilstrækkelig til en. japonicus tarmceller kultur.
2. klargøring af tarmceller
-
Havet agurk tarm forarbejdning
- Bedøvelse sunde havagurker i en isboks. Dissekere og indsamle de forreste tarme, derefter afsnit vævsprøverne lodret og fjerne det indre indhold.
- Vævsprøverne vaskes to gange i fosfat bufferet saltvand (PBS), og de desinficeres ved nedsænkning i en vandig ethanolopløsning (75% vol.) i højst 2 s.
- Vævsprøverne vaskes i PBS tre gange for at fjerne ethanol og overføre ca. 100 mg vævsprøve til et 2,0 mL sterilt mikrocentrifuge glas.
-
Celle samling
- Tilsæt 1,5 mL af det præ-optimerede kulturmedium til havet agurk tarm vævs blok og hakke blokken med steriliseret kirurgisk saks, indtil opløsningen er uklar.
Bemærk: for valgfri forenklet protokol tilsættes 0,5 mL foroptimeret kulturmedium til havagurk tarm vævs blokken og skæres blokken med steriliseret kirurgisk saks til 1 mm3. Direkte overføre prøverne til kultur retter efterfulgt af efterfølgende inkurering trin. - Tilsæt 400 μL trypsin (0,25%), bland opløsningen ved inversion, og Inkuber den i 5 minutter ved stuetemperatur; Filtrer derefter opløsningen ved hjælp af en 100 μm-cellefilter.
Bemærk: det er valgfrit at tilføje trypsin til celledispersion ved behandling af forskellige vævsprøver. Ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) bør være indeholdt i trypsin-opløsningen for at reducere den hæmmende aktivitet fra ca2 + og mg2 + i dyrkningsmediet. - Filtratet opsamles til et nyt sterilt 2,0 mL mikrocentrifuge glas, centrifugeres ved 1.700 x g i 3 min., kassér supernatanten, og derefter opslæmmes pellet i dyrkningsmediet (suppleret med antibiotika) og vaskes to gange.
Bemærk: Forbered frisk præ-optimeret kulturmedium suppleret med 2% penicillin-streptomycin opløsning (10.000 U/mL penicillin og 10 mg/mL streptomycin) og 1% gentamicin (4 mg/mL) før begyndelsen af forsøget.
- Tilsæt 1,5 mL af det præ-optimerede kulturmedium til havet agurk tarm vævs blok og hakke blokken med steriliseret kirurgisk saks, indtil opløsningen er uklar.
3. cellekultur
-
Inkubator-forudindstilling: Preset inkubator for cellekultur og køre det på forhånd i mindst 24 h med temperatur på 18 °C og mættet fugtighed.
Bemærk: feed CO2 i inkubator afhængigt af cellekulturen medium egenskaber; ingen CO2 skal leveres, når du bruger det grundlæggende medium for Leibovitz s L-15. -
Første fase cellekultur
- For at hæmme væksten af mikrober og for at fremme spredningen i den indledende fase af cellekulturen tilsættes 10 mL penicillin-streptomycin-opløsning (10.000 U/mL penicillin og 10 mg/mL streptomycin) og 0,5 mL gentamicin (40 mg/mL) til hver 500 mL foroptimeret dyrkningsmedium. Desuden suppleres hvert 500 mL dyrkningsmedium med 0,6 mL insulin (10 mg/mL), 100 μL insulin-lignende vækstfaktor (0,1 μg/μL) og 25 μL fibroblast vækstfaktor (0,1 μg/μL).
- Cellerne opsamles i 1,5 mL rør, resuspenderes dem med 200 μL af det indikerede medium og pipet dem i φ 4 cm retter.
- Kultur cellerne i en inkubator og tilsæt 2,0 ml af indikeret medium til celledyrkning retter efter 6 h. Skift halvdelen af mediet hver 12 h, indtil du når næste trin.
Bemærk: Håndtér medium ændringen forsigtigt, fordi cellerne ikke er fastgjort til skålene stramt. Poly-D-lysin-belagte retter kan bruges til løst knyttet til parabol cellerne.
-
Anden fase cellekultur
- For at reducere de skadelige virkninger af antibiotika til de dyrkede celler, reducere koncentrationen af indikerede antibiotika (penicillin, streptomycin, og gentamicin) i kulturmediet til halvdelen.
Bemærk: brugen af insulin og vækstfaktorer afhænger af celle dyrkningsforholdene og er valgfri. - Udskift cellekultur mediet; Udfør medium ændringer hver to til tre dage afhængigt af celletætheden.
Bemærk: observere de dyrkede celler dagligt under et mikroskop og registrere vækstbetingelserne.
- For at reducere de skadelige virkninger af antibiotika til de dyrkede celler, reducere koncentrationen af indikerede antibiotika (penicillin, streptomycin, og gentamicin) i kulturmediet til halvdelen.
-
Celle passaging
Bemærk: passage og subkultur cellerne, når den primære celletæthed når 60%.- Vask de dyrkede celler to gange ved hjælp af PBS ved stuetemperatur. Tilsæt 200 μL trypsin-opløsning (0,25%) til hver skål og manuelt agitere skålen sikre hele bunden er dækket. Trypsin-opløsningen kasseres, og cellerne inkubates i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Cellerne vaskes med 1,0 mL frisk dyrkningsmedium ved pipettering og opsuspension af cellerne. 0,5 mL cellesuspension overføres til en ny skål, tilsættes 1,5 mL frisk medium, og cellerne inkubates ved 18 °C.
Bemærk: celle skrabere kan bruges til celle opsamling, når trypsin-opløsningen ikke fordøje og frigør celler fra skålene (nogle cellelinjer er for klæbende). Du skal dog ikke udføre begge metoder samtidigt. - Ændre mediet efter 12 h og observere cellerne under et mikroskop for at evaluere betingelserne. Kultur cellerne for yderligere eksperimentelle assays.
4. apoptose induktion og detektion i en. japonicus tarmceller
-
Cellekultur og behandling med dexamethason
- Forbered tarmcellerne efter den tidligere indførte protokol og tilsæt cellerne dråbevis til en 12-brønd plade ved en celle volumen på 2 x 106 pr. brønd.
- Efter tre dage i kulturen, følge trinene i "første fase cellekultur", vaske cellerne tre gange med PBS og erstatte mediet med optimeret medium (uden antibiotika og vækstfaktorer).
- Fortyndet dexamethason (DXMS) i dyrkningsmediet for at tilberede friske 2 μM-og 200 μM DXMS-opløsninger, før eksperimenterne påbegyndes.
- Tilføje DXMS-opløsninger i forskellige koncentrationer til dyrkede celler, som dyrkes med samme volumen af dyrkningsmediet sæt tre eksperimentelle grupper, herunder kontrol (CTL), 1 μM og 100 μM DXMS.
-
Hoechst undlod at stemme
- Cellerne vaskes med PBS tre gange efter inkubation med/uden DXMS for de angivne tidsperioder (0 h, 24 h og 48 h).
- Der tilsættes 300 μL Hoechst 33258 opløsning pr. brønd til en 12-brønd plade og Inkuber ved 18 °C i 30 min. forsigtigt omrystes pladen for at dække alle celler, der sikrer deres farvning.
- Fjern Hoechsts farvningsopløsning, og fastgør cellerne ved at tilsætte 300 μL af en 4% PARAFORMALDEHYD opløsning (i PBS) til hver brønd. Omrystes forsigtigt i 15 minutter.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er moderat giftigt ved hudkontakt eller indånding, og det er udpeget som et sandsynligt humant carcinogen. Der bør anvendes kemiske røgudemhætter, ventilerede balance kabinetter eller andre beskyttelsesforanstaltninger under vejning og håndtering af PARAFORMALDEHYD. - Vask de faste celler tre gange i PBS. PBS må ikke kasseres efter vask for at holde cellerne dækket.
-
Analyse af fluorescerende mikroskopi
- Tænd den fluorescerende mikroskop hardware, herunder kviksølv lampe strøm, fluorescerende lys magt, og PC. Log ind på operativsystemet konto, starte softwaren, og kontrollere dens konfiguration.
- Placer den forberedte plade på mikroskop stadiet. Placer prøven over objektivlinsen ved hjælp af Stage controlleren.
- Find de celler af interesse under lyset mikroskop, skifte til fluorescerende mikroskopi, og fange billederne ved tuning parametrene.
Bemærk: for at observere Hoechsts 33258-fluorescerende signal, der er bundet til kerner-DNA, skal Fluorescens mikroskopi udføres med excitation og emission ved henholdsvis ca. 352 nm og 461 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her etablerede vi primær tarm cellekultur af A. japonicus og urerne cellerne. Figur 1 viser runde celler i forskellige stadier af dyrkning. Og EdU-farvnings analyserne giver direkte dokumentation for at afsløre den proliferativ aktivitet af disse runde celler i senere fase (figur 2). Vi har også lidt justeret protokollen, dyrkning af hakket væv blokke i stedet for filtrerede celler; Desuden kunne en spindel celletype dyrkes med succes. Denne celletype opstod omkring tarm vævs blokkene og kunne observeres efter fire dages kultur; den blev dog ikke urerne (figur 3).
De dyrkede celler kan anvendes til forskellige biologiske eksperimentelle applikationer. Vi behandlede cellerne med DXMS i forskellige perioder, efterfulgt af Hoechst 33258 farvning for apoptotisk celle detektering. Figur 4 indikerer det inducerede apoptotiske signal fra havagurk tarmcellerne af Hoechst 33258 farvning og fluorescerende mikroskopi. Figur 5 viser de apoptotiske celle rater for indikerede tidsperioder under stimulation med dxms.
Figur 1: mikroskopi af dyrkede havagurk tarm runde celler på forskellige stadier. (A) celler, der er fastgjort til bunden af retterne på tredjedagen efter at være blevetseedet. (B) celle spredning på den syvende dag. (C) celler fastgjort til bunden af retter efter passaging. D) celler, der har mistet aktivitet og dør efter ti passager. "CM" indikerer cellemasse, som opstår under celle proliferation. "BT" indikerer det sorte spor, som blev efterladt af døde celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: celle spredning opdaget af EdU-farvnings assays. Celle sprednings analyser blev udført ved hjælp af sættet (tabel over materialer) i henhold til producentens protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mikroskopi af dyrkede havagurk tarm vævs blokke og celle spredning. (A) vævs BLOKKE (TB), der er fastgjort til parabol bunden på den første dag efter kulturen. B) vævs blokke og-celler, der er fastgjort til parabol bunden på den anden dag efter kulturen. C) vævs blokke og perifert opstået spindel celler (SC) den fjerde dag efter kulturen. D) prolifererede spindel celler på syvendedagen efter kulturen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fluorescerende mikroskopi af tarm runde celler med induceret apoptose. "NC" indikerer nuklear kondensation fluorescerende signal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: statistisk analyse af Hoechst-positive intestinale runde celler. Fordeling af procentdelen af kondensvand fluorescerende signal-positive celler blandt Hoechst farvede A. japonicus tarmceller sammen med dosis eller tidsforløb af forsøget (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattende forskningsindsats har været afsat til at etablere cellelinjer i de sidste årtier, men det er stadig vanskeligt at gøre en fremskridt på lang sigt kultur af celler fra marine hvirvelløse dyr14,22. Det er blevet rapporteret, at dyrkede celler fra regenererende holothurian væv var levedygtige i en lang periode, og høj aktivitet af spredning kan påvises i specifikke celler17,23. Men for de normale Marine hvirvelløse celler, er der endnu ingen praktisk cellekultur tilgang er blevet beskrevet. Den protokol, der præsenteres her, giver en effektiv og let fortoldning metode til dyrkning og passaging tarmceller fra de marine hvirvelløse arter A. japonicus. Metoden kan let tilpasses til primær cellekultur af mange forskellige Marine hvirvelløse organismer såsom blæksprutte og Krabbe.
En række nøglefaktorer påvirker den vellykkede anvendelse af denne procedure. Forebyggelse af mikrobiel kontaminering er af største vigtighed under hele processen og især i den første uge af kulturen. Akvatiske dyr normalt kontakte talrige mikrober fra miljøet, som kolonisere deres væv, såsom Gill, tarm, fin, og hud. Således vil det være umuligt at sterilisere vævsprøverne før cellekulturen initiering. For at minimere risikoen for mikrobiel kontaminering under cellekulturen er 75% ethanol nedsænkning til vævsprøve sterilisering afgørende; dog bør behandlingstiden optimeres for forskellige vævstyper. Desuden spiller anvendelsen af høje antibiotika koncentrationer i de tidlige stadier af cellekulturen også en vigtig rolle i hæmning af mikrobiel vækst. Desuden er den medium formulering en vigtig faktor, der bestemmer spredning og levetid af dyrkede celler. Da de ernæringsmæssige behov i Marine hvirvelløse celler stadig er ukendte, er det nuværende celle dyrkningsmedium hovedsagelig konstrueret til hvirveldyr eller insekt cellelinjer14. For at levere tilstrækkelige ernæringsmæssige materialer, kan forbehandlet coelomic væske fra havagurker anvendes svarende til FBS i pattedyrscelle kultur. I mellemtiden kan flere pattedyr vækstfaktorer også anvendes i dyrkningsmediet for at lette celle spredningen. Da inkubations temperaturen er en faktor, der påvirker den marine hvirveldyrs celle kulturs succes, bør der tages hensyn til inkubeerings celler under den optimale vækst temperatur for målorganismen. For eksempel kan temperaturen for en. japonicus cellekultur indstilles til 18 °c, som er egnet til dens vækst24.
Vævs forbehandling kan påvirke de vellykkede dyrkede og prolifererende celletyper. Meget forskellige A. japonicus tarmceller, runde eller spindel, kan opnås fra såning filtrerede celler eller vævs blokke under nøjagtig samme dyrknings procedure (sammenlignelige data fra figur 1 og figur 3). Således, optimering af væv forbehandling metode til specifik cellekultur type bør også udføres i begyndelsen; den optimale fremgangsmåde bør afgøres efter det biologiske forsøgsdesign.
Her anvendte vi DXMS behandling for apoptose induktion i A. japonicus tarmceller efter tre dage i kultur, og vi udførte Hoechst farvning for apoptotisk signal detektion. Vellykket påvisning af Hoechsts positive celler, efter 48 h stimulation med 1 μM DXMS, gav et praktisk eksempel for et biologisk eksperiment baseret på de dyrkede celler.
Den beskrevne protokol er nem at håndtere og kan bruges til at etablere en marine hvirvelløse cellekultur. De dyrkede celler bør levere biologisk materiale med en konsistent genetisk baggrund til forskellige yderligere biologiske eksperimentelle anvendelser. Desuden kan let justerede protokol procedurer ændre de vellykkede prolifererende celletyper under kulturen og give forskellige celle materialer til biologiske eksperimenter. Så optimering af visse trin i protokollen vil være nødvendig, afhængigt af de målrettede dyrearter og de specifikke celletyper, der er nødvendige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Prof. Naiming Zhou fra Zhejiang University for hans tekniske rådgivning og for at gøre udstyret i hans laboratorium til rådighed til brug. Dette arbejde blev finansielt støttet af Kinas National Natural Science Foundation (tilskudsnummer 41876154, 41606150 og 41406137) og de grundlæggende forskningsfonde for Zhejiang Provincial universiteter og forskningsinstitutter [Grant Number 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
