使用伦迪病毒载体方法生成转基因大鼠
Summary
本文旨在提供大鼠胚胎中扁病毒转生的方法，使用多次注射病毒悬浮液进入酶体肠。雌性大鼠与肥沃的雄性菌株交配，具有不同的显性毛皮颜色，用于产生伪怀孕的养母。
Abstract
转基因动物模型在现代生物医学研究中至关重要。将外来基因植入早期小鼠或大鼠胚胎是活生物体基因功能分析的宝贵工具。标准转基因方法基于将外来DNA片段微注入受精卵母细胞的异核。这项技术在小鼠中被广泛应用，但在其他动物物种中仍然相对低效和技术要求高。转基因还可以通过慢病毒感染引入单细胞阶段胚胎，为标准前列腺注射提供有效的替代，特别是在胚胎结构更具挑战性的物种或菌株中。在这种方法中，含有慢病毒载体的悬浮液被注射到受精大鼠胚胎的围网空间，从技术上讲，这种胚胎要求较低，成功率也更高。线病毒载体被证明有效地将转基因纳入基因组，以确定稳定的转基因系的产生。尽管存在一些局限性（例如，生物安全等级 2 要求、DNA 片段大小限制），但慢病毒转基因是一种快速而高效的转基因方法。此外，使用雌性大鼠与肥沃的男性菌株交配，具有不同的显性毛皮颜色，作为产生伪孕养母的替代品。
Introduction
多年来，实验室啮齿动物，如大鼠和老鼠，一直被用来模拟人类的生理和病理状况。动物研究已经导致发现，这是无法通过任何其他手段。最初，基因研究侧重于分析自发发生的疾病和表型，被认为是密切模仿人类的条件1。基因工程方法的发展允许引入或删除特定基因来获得所需的表型。因此，转基因动物的产生被认为是现代研究中的一项基本技术，它允许对生物体内基因功能的研究。
转基因动物技术通过在实验胚胎学和分子生物学方面取得的成绩而成为可能。20世纪60年代，波兰胚胎学家A.K.Tarkowski发表了关于小鼠胚胎在发育早期阶段操纵的第一个工作。此外，分子生物学家还开发了产生DNA载体（即载体）的技术，以便除其他外将外来DNA引入动物的基因组。这些载体允许传播选定的基因及其适当的修饰，这取决于所进行的研究类型。”转基因动物”一词是由戈登和陆克文3引入的。
第一个被广泛接受的物种，用于神经生物学，生理学，药理学，毒理学和许多其他领域的生物和医学是挪威大鼠，拉图斯诺维吉库斯4。然而，由于难以操纵大鼠胚胎，室内小鼠肌肉已成为基因研究中的主要动物物种。在这种研究中，老鼠占主导地位的另一个原因是，有胚胎干细胞技术可以为这种物种生产淘汰动物。最常见的转基因技术（相对于所有出生的动物，转基因后代的2-10%）是将DNA片段微入受精卵母细胞的亲核中。1990年，这种方法首次引入小鼠体内，适用于66、7只大鼠。与小鼠相比，前列腺注射的鼠转基因具有效率低8的特点，这与弹性等离子体和前列腺膜的存在密切相关。虽然操纵后的胚胎存活率比小鼠低40-50%，但这项技术被认为是转基因大鼠10代的一个标准。研究了能够保证有效转基因结合和提高注射酶的存活率的替代方法。
稳定转基因表达和传染给后代的关键决定因素是它与宿主细胞基因组的集成。伦迪病毒（LV）具有能够感染分裂细胞和非分裂细胞的显著特征。它们用作将异质基因纳入胚胎的工具被证明是高效的11，而转基因个体的特点是结合DNA片段的稳定表达。扁病毒载体的疗效已确认为小鼠12、13、13大鼠12、14,14等11种进行基因改造。12在这种方法中，LV悬浮液在两个原核的阶段被注射在胚胎的zona pellucida下。这种技术基本上保证了胚胎100%的存活率，因为奥莱玛仍然不受影响。生产高质量和相对集中的LV悬架是关键因素。然而，低浓度的LV悬浮液可以通过重复注射11来克服，这增加了蛋表面的病毒颗粒量，同时不影响膜的整合。接受反复注射到围场的胚胎进一步发育，转基因后代可以通过生殖系传播转基因。扁病毒转变转基因大鼠的生成效率高达80%12。
在这里，我们描述了HIV-1衍生的重组性扁病毒的产生，这种病毒是伪型的，带有光眼口腔炎病毒（VSV）G包络蛋白。使用第二代包装系统 VSV 伪型决定了病毒颗粒的广泛感染性，并允许生产高度稳定的载体，这些载体可以通过超离心和低温保存进行浓缩。滴定验证后，载体可作为将基因转化为白化病的威斯塔大鼠酶体的工具。经过一系列的注射后，胚胎可以培养过夜，并在双细胞阶段转移到寄养母亲。在这一点上，可以考虑两种替代方法之一。标准程序利用伪怀孕女性作为胚胎接受者。然而，当与输精管结扎的雄配后怀孕率较低时，胚胎可以植入怀孕的 Wistar / Sprague – Dawley （ SD ）雌性，这些雌性与具有深色毛皮颜色的肥沃雄性大鼠交配（例如，棕色挪威 [ BN ] 大鼠）。毛皮的颜色允许区分后代与自然怀孕的后代，这些后代来自转移的操纵胚胎。
Protocol
Representative Results
Discussion
转基因技术的进步使啮齿动物模型成为生物医学研究的宝贵工具。它们提供了研究体内基因型-表型关系的机会。在这里，我们提出了一种广泛可用的替代常规转基因通过前核注入。使用慢病毒基因转导绕过了要求苛刻的微注射的需要，因为病毒载体可以在zona pellucida下注射。这种方法不影响胚胎的完整性，这基本上保证了注射酶的100%存活率。通过慢病毒载体结合的转基因可稳稳地融入宿主基因组…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了ANIMOD项目的支持，该项目由波兰科学基金会团队技术核心设施加方案内支持，该项目由欧洲联盟在欧洲区域发展基金下共同资助。
Materials
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Atipam 5 mg/ml | Eurovet Animal Health BV | N/A | 0.5 mg/kg |
| Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) | Bayer | N/A | 5-10 mg/kg |
| Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | injection capillary |
| Bupivacaine 25 mg/ml | Advanz Pharma | N/A | 0.25% in 0.9% NaCl |
| Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml | cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
| Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl |
| DMEM low glucose | Sigma Aldrich | D6048 | |
| DNase, RNase-free | A&A Biotechnology | 1009-100 | |
| EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil | Sigma | ES-005-C | |
| Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) | ADDGENE | 14888 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 4i /5252 000.013 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
| Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin | Intervet | N/A | 125 IU/ml in .9% NaCl |
| HEK 293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
| Hyaluronidase from Bovine Testis | Sigma | H4272-30MG | 0.5 mg/ml in M2 medium |
| Inverted Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| Ketamine 100mg/ml | Biowet Pulawy | N/A | 50 mg/kg |
| Liquid Paraffin | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
| M16 medium EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Magnesium Chloride 1M | Sigma Aldrich | 63069-100ML | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-500ML | |
| NaCl 0.9% | POLPHARMA OTC | N/A | sterile, 5ml ampules |
| Operation microscope | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
| Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors (delta R8.2 plasmid) | ADDGENE | 12263 | |
| PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| Penicilin-streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Reflex Clip Applier/Reflex Clips | World Precision Instruments | 500345/500346 | |
| Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads | B.Braun Surgical | 1048029 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Surgical Sewing Thread | B.Braun | C1048040 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4334973 | |
| Tolfedine 4% (tolfenamic acid) | Vetoquinol | N/A | 2 mg/kg |
| TransferMan NK2 | Eppendorf | N/A | |
| Trypsin EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | holders capillary |
| Vita-POS | Ursapharm | N/A | eye ointment |
| Warming Plate | Semic | N/A | |
| Watchmaker Forceps | VWR | 470018-868 |
References
- Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
- Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
- Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
- Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
- Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
- Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
- Tesson, L., et al. Transgenic modifications of the rat genome. Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).
- Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
- Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).
- Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).
- Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
- Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
- Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
- Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
- van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
- Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).
