Summary

Generation af transgene rotter ved hjælp af en lentiviral Vector Approach

Published: May 17, 2020
doi:

Summary

Denne artikel har til formål at give metoden for lentiviral transgenese i rotte embryoner ved hjælp af flere injektioner af en virus suspension i zygote perivitelline rummet. Kvindelige rotter, der er parret med en frugtbar mandlig stamme med en anden dominerende pels farve bruges til at generere pseudopregnant plejemødre.

Abstract

Transgene dyremodeller er grundlæggende vigtige for moderne biomedicinsk forskning. Inkorporeringen af fremmede gener i tidlige muse- eller rotteembryoner er et uvurderligt redskab til analyse af genfunktionen i levende organismer. Standardtransgenesemetoden er baseret på mikroindsprøjtning af udenlandske DNA-fragmenter i en pronucleus af en befrugtet oocyt. Denne teknik er meget udbredt i mus, men er stadig relativt ineffektiv og teknisk krævende hos andre dyrearter. Transgenet kan også indføres i et-trins embryoner via lentiviral infektion, hvilket giver et effektivt alternativ til standard pronuclear injektioner, især hos arter eller stammer med en mere udfordrende embryo struktur. I denne fremgangsmåde sprøjtes en suspension, der indeholder lentivirale vektorer, ind i perivitelline-rummet hos et befrugtet rottefoster, som er teknisk mindre krævende og har en højere succesrate. Lentivirale vektorer viste sig effektivt at indarbejde transgenet i genomet for at bestemme dannelsen af stabile transgene linjer. Trods visse begrænsninger (f.eks. biosikkerhedsniveau 2-krav, DNA-fragmentstørrelsesgrænser) er lentiviral transgenese en hurtig og effektiv transgenesemetode. Derudover, ved hjælp af kvindelige rotter, der er parret med en frugtbar mandlig stamme med en anden dominerende pels farve præsenteres som et alternativ til at generere pseudopregnant plejemødre.

Introduction

I mange år har laboratoriegnavere, såsom rotter og mus, været brugt til at modellere menneskelige fysiologiske og patologiske forhold. Dyreforsøg har ført til opdagelser, der var uopnåelige på nogen anden måde. I første omgang fokuserede genetiske undersøgelser på analyse af spontant forekommende lidelser og fænotyper, der anses for nøje at efterligne den menneskelige tilstand1. Udviklingen af genteknologiske metoder gjorde det muligt at indføre eller slette specifikke gener for at opnå en ønsket fænotype. Derfor er generation af transgene dyr anerkendt som en grundlæggende teknik i moderne forskning, der tillader undersøgelser af genfunktion i levende organismer.

Transgene dyreteknologi er blevet mulig gennem en kombination af resultater inden for eksperimentel embryologi og molekylærbiologi. I 1960’erne offentliggjorde den polske embryolog A. K. Tarkowski det første værk om museembryosmanipulation i de tidlige udviklingsstadier2. Derudover udviklede molekylærbiologer teknikker til at generere DNA-vektorer (dvs. bærere) til bl.a. Disse vektorer tillader udbredelse af udvalgte gener og deres passende modifikation, afhængigt af hvilken type forskning der udføres. Udtrykket “transgene dyr” blev indført af Gordon og Ruddle3.

Den første bredt accepterede arter, der blev brugt i neurobiologi, fysiologi, farmakologi, toksikologi, og mange andre områder af biologiske og medicinske videnskaber var Norge rotte, Rattus norvegicus4. Men på grund af vanskelighederne med at manipulere rotte embryoner, huset musen Mus muskulahar blevet den dominerende dyrearter i genetisk forskning5. En anden grund til musens forrang i en sådan forskning var tilgængeligheden af embryonal stamcelleteknologi til at generere knockout dyr til denne art. Den mest almindeligt anvendte teknik transgenese (2-10% af transgene afkom i forhold til alle fødte dyr) er mikroinjektion af DNA-fragmenter i en pronucleus af en befrugtet oocyt. I 1990 blev denne fremgangsmåde, som først blev indført i mus, tilpasset til rotter6,7. Rotte transgenese ved pronuclear injektion er karakteriseret ved lavere effektivitet8 sammenlignet med mus, som er strengt relateret til tilstedeværelsen af elastisk plasma og pronukleare membraner9. Selv om overlevelsen af embryoner efter manipulation er 40-50% lavere end hos mus, denne teknik betragtes som en standard i dannelsen af genetisk modificerede rotter10. Alternative tilgange, der kan garantere effektiv transgeniblanding og højere overlevelsesrater for injicerede zygoter, er blevet undersøgt.

Den vigtigste faktor for stabil transgene udtryk og overførsel til afkom er dens integration i værtscellegenomet. Lentivira (LVs) har det karakteristiske træk at være i stand til at inficere både dividere og ikke-dividere celler. Deres anvendelse som et redskab til inkorporering af heterologe gener i embryoner viste sig at være yderst effektiv11, og transgene individer er kendetegnet ved stabil teksion af det inkorporerede DNA-fragment. Effekten af lentivirale vektorer er blevet bekræftet til genetisk modifikation af mus12,13, rotter12,14og andre arter11. Ved denne metode injiceres LV-suspensionen under embryonets zona pellucida på stadiet af to pronuclei. Denne teknik væsentlige garanterer 100% overlevelse af embryoner, fordi oolemma forbliver upåvirket. Produktionen af forholdsvis koncentrerede LV-suspensioner af høj kvalitet er afgørende faktorer. Lavere koncentrationer af LV-suspensioner kan dog overvindes ved gentagne injektioner11, hvilket øger mængden af viruspartikler på ægoverfladen, mens det ikke påvirker membranintegrationen. Embryoner, der udsættes for gentagne injektioner i perivitellinrummet, udvikler sig yderligere, og transgene afkom kan overføre transgene gennem kønskiminen. Effektiviteten af transgene rotte generation af lentiviral transgenese kan være så højt som 80%12.

Her beskriver vi produktionen af HIV-1-afledt rekombinant lentivirus, der blev pseudotyped med vesikulær stomatitisvirus (VSV) G kuvertprotein. Brugen af anden generations emballeringssystem VSV pseudotype bestemmer den brede infektivitet af viruspartikler og tillader produktion af meget stabile vektorer, der kan koncentreres ved ultracentrifugering og kryopræpareret. Efter titer verifikation, vektorerne er klar til at blive brugt som et køretøj til transgene levering i albino Wistar rotte zygotes. Efter en række injektioner, kan embryonerne dyrkes natten over og overføres på to-celle stadium til plejemødre. På dette tidspunkt kan en af to alternative tilgange overvejes. Standardproceduren udnytter pseudogravide hunner som embryomodtagere. Men når graviditetsraten er lav efter parring med vasektomerede hanner, kan embryonerne implanteres i gravide Wistar/Sprague-Dawley (SD) hunner, der er parret med frugtbare hanrotter med en mørk pelsfarve (f.eks. Farven på pelsen tillader sondringen af afkom fra naturlig graviditet fra afkom, der stammer fra de overførte manipulerede embryoner.

Protocol

Produktionen og anvendelsen af virale vektorer var i overensstemmelse med retningslinjerne for biosikkerhedsniveau 2 og blev godkendt af det polske miljøministerium. Alle forsøgsdyreprocedurer, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af det lokale etiske udvalg. Dyrene blev anbragt i individuelt ventilerede bure ved en stabil temperatur (21-23 °C) og fugtighed (50-60%) med ad libitum adgang til vand og mad under en 12 h/12 h lys / mørk cyklus. 1. Lentiviral vektorproduktion Tran…

Representative Results

Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet heri, blev der produceret udlånte vektorer, der bar Syn-TDP-43-eGFP-konstruktionen (fysisk LV-titer = 3,4 x 108/μL), og derefter kunne de anvendes til subzonale injektioner i ét celletrin. Kun embryoner med to synlige pronuclei er blevet underkastet proceduren. Antallet af injektioner af virale suspensioner blev bestemt eksperimentelt. Høj implantationseffektivitet og samtidig mangel på transgene afkom blev betragtet som indikatorer for et utilstrækkeligt anta…

Discussion

Fremskridt inden for transgene teknologier har gjort gnavere modeller et uvurderligt redskab i biomedicinsk forskning. De giver mulighed for at studere genotype-fænotype relationer in vivo. Her præsenterer vi et bredt tilgængeligt alternativ til konventionel transgenese ved pronuclear injektioner. Brugen af lentiviral gentransduktion omgår behovet for krævende mikroinjektioner, fordi virale vektorer kan injiceres under zona pellucida. Denne fremgangsmåde påvirker ikke embryonens integritet, som i det væsentlige g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af ANIMOD-projektet inden for Team Tech Core Facility Plus-programmet under Foundation for Polish Science, der samfinansieres af EU under Den Europæiske Fond for Regionaludvikling til WK.

Materials

7500 Real Time PCR System Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane) Baxter FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml Eurovet Animal Health BV N/A 0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) Bayer N/A 5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 Harvard Apparatus Limited 30-0039 injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml Advanz Pharma N/A 0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate) Orion Pharma N/A 1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm Greiner Bio-One 627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm Greiner Bio-One 628160
CellTram Oil Eppendorf 5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml cp-pharma N/A 0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin  Intervet N/A 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose Sigma Aldrich D6048
DNase, RNase-free A&A Biotechnology 1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil Sigma ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)  ADDGENE 14888
FemtoJet Eppendorf 4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin  Intervet N/A 125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells  ATCC ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis  Sigma H4272-30MG 0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope  Zeiss Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml Biowet Pulawy N/A 50 mg/kg
Liquid Paraffin Merck Millipore 8042-47-5
M16 medium EmbryoMax Sigma MR-016-D
M2 medium Sigma M7167
Magnesium Chloride 1M Sigma Aldrich 63069-100ML
Microforge Narishige MF-900
Mineral Oil Sigma M8410-500ML
NaCl 0.9% POLPHARMA OTC N/A sterile, 5ml ampules
Operation microscope  Inami Ophthalmic Instruments Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid) ADDGENE 12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), Polysciences, Inc 23966-1
Penicilin-streptomycin Sigma Aldrich P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma Aldrich 806552-500ML
Puller  Sutter Instrument Co. P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips World Precision Instruments 500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads B.Braun Surgical 1048029
Stereomicroscope Olympus SZX16
Surgical Sewing Thread B.Braun  C1048040
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystem 4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid) Vetoquinol N/A 2 mg/kg
TransferMan NK2 Eppendorf N/A
Trypsin EDTA solution Sigma Aldrich T3924-500ML
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP 
VacuTip Eppendorf 5175108.000 holders capillary
Vita-POS Ursapharm N/A eye ointment
Warming Plate Semic N/A
Watchmaker Forceps VWR 470018-868

References

  1. Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
  2. Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
  3. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  4. Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
  5. Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
  6. Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
  7. Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
  8. Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
  9. Tesson, L., et al. Transgenic modifications of the rat genome. Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).
  10. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  11. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  12. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  13. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
  14. Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).
  15. Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).
  16. Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
  17. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  18. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  19. Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
  20. Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
  21. Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
  22. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  23. Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).

Play Video

Cite This Article
Koza, P., Przybyś, J., Klejman, A., Olech-Kochańczyk, G., Konopka, W. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (159), e60570, doi:10.3791/60570 (2020).

View Video