Denne artikel har til formål at give metoden for lentiviral transgenese i rotte embryoner ved hjælp af flere injektioner af en virus suspension i zygote perivitelline rummet. Kvindelige rotter, der er parret med en frugtbar mandlig stamme med en anden dominerende pels farve bruges til at generere pseudopregnant plejemødre.
Transgene dyremodeller er grundlæggende vigtige for moderne biomedicinsk forskning. Inkorporeringen af fremmede gener i tidlige muse- eller rotteembryoner er et uvurderligt redskab til analyse af genfunktionen i levende organismer. Standardtransgenesemetoden er baseret på mikroindsprøjtning af udenlandske DNA-fragmenter i en pronucleus af en befrugtet oocyt. Denne teknik er meget udbredt i mus, men er stadig relativt ineffektiv og teknisk krævende hos andre dyrearter. Transgenet kan også indføres i et-trins embryoner via lentiviral infektion, hvilket giver et effektivt alternativ til standard pronuclear injektioner, især hos arter eller stammer med en mere udfordrende embryo struktur. I denne fremgangsmåde sprøjtes en suspension, der indeholder lentivirale vektorer, ind i perivitelline-rummet hos et befrugtet rottefoster, som er teknisk mindre krævende og har en højere succesrate. Lentivirale vektorer viste sig effektivt at indarbejde transgenet i genomet for at bestemme dannelsen af stabile transgene linjer. Trods visse begrænsninger (f.eks. biosikkerhedsniveau 2-krav, DNA-fragmentstørrelsesgrænser) er lentiviral transgenese en hurtig og effektiv transgenesemetode. Derudover, ved hjælp af kvindelige rotter, der er parret med en frugtbar mandlig stamme med en anden dominerende pels farve præsenteres som et alternativ til at generere pseudopregnant plejemødre.
I mange år har laboratoriegnavere, såsom rotter og mus, været brugt til at modellere menneskelige fysiologiske og patologiske forhold. Dyreforsøg har ført til opdagelser, der var uopnåelige på nogen anden måde. I første omgang fokuserede genetiske undersøgelser på analyse af spontant forekommende lidelser og fænotyper, der anses for nøje at efterligne den menneskelige tilstand1. Udviklingen af genteknologiske metoder gjorde det muligt at indføre eller slette specifikke gener for at opnå en ønsket fænotype. Derfor er generation af transgene dyr anerkendt som en grundlæggende teknik i moderne forskning, der tillader undersøgelser af genfunktion i levende organismer.
Transgene dyreteknologi er blevet mulig gennem en kombination af resultater inden for eksperimentel embryologi og molekylærbiologi. I 1960’erne offentliggjorde den polske embryolog A. K. Tarkowski det første værk om museembryosmanipulation i de tidlige udviklingsstadier2. Derudover udviklede molekylærbiologer teknikker til at generere DNA-vektorer (dvs. bærere) til bl.a. Disse vektorer tillader udbredelse af udvalgte gener og deres passende modifikation, afhængigt af hvilken type forskning der udføres. Udtrykket “transgene dyr” blev indført af Gordon og Ruddle3.
Den første bredt accepterede arter, der blev brugt i neurobiologi, fysiologi, farmakologi, toksikologi, og mange andre områder af biologiske og medicinske videnskaber var Norge rotte, Rattus norvegicus4. Men på grund af vanskelighederne med at manipulere rotte embryoner, huset musen Mus muskulahar blevet den dominerende dyrearter i genetisk forskning5. En anden grund til musens forrang i en sådan forskning var tilgængeligheden af embryonal stamcelleteknologi til at generere knockout dyr til denne art. Den mest almindeligt anvendte teknik transgenese (2-10% af transgene afkom i forhold til alle fødte dyr) er mikroinjektion af DNA-fragmenter i en pronucleus af en befrugtet oocyt. I 1990 blev denne fremgangsmåde, som først blev indført i mus, tilpasset til rotter6,7. Rotte transgenese ved pronuclear injektion er karakteriseret ved lavere effektivitet8 sammenlignet med mus, som er strengt relateret til tilstedeværelsen af elastisk plasma og pronukleare membraner9. Selv om overlevelsen af embryoner efter manipulation er 40-50% lavere end hos mus, denne teknik betragtes som en standard i dannelsen af genetisk modificerede rotter10. Alternative tilgange, der kan garantere effektiv transgeniblanding og højere overlevelsesrater for injicerede zygoter, er blevet undersøgt.
Den vigtigste faktor for stabil transgene udtryk og overførsel til afkom er dens integration i værtscellegenomet. Lentivira (LVs) har det karakteristiske træk at være i stand til at inficere både dividere og ikke-dividere celler. Deres anvendelse som et redskab til inkorporering af heterologe gener i embryoner viste sig at være yderst effektiv11, og transgene individer er kendetegnet ved stabil teksion af det inkorporerede DNA-fragment. Effekten af lentivirale vektorer er blevet bekræftet til genetisk modifikation af mus12,13, rotter12,14og andre arter11. Ved denne metode injiceres LV-suspensionen under embryonets zona pellucida på stadiet af to pronuclei. Denne teknik væsentlige garanterer 100% overlevelse af embryoner, fordi oolemma forbliver upåvirket. Produktionen af forholdsvis koncentrerede LV-suspensioner af høj kvalitet er afgørende faktorer. Lavere koncentrationer af LV-suspensioner kan dog overvindes ved gentagne injektioner11, hvilket øger mængden af viruspartikler på ægoverfladen, mens det ikke påvirker membranintegrationen. Embryoner, der udsættes for gentagne injektioner i perivitellinrummet, udvikler sig yderligere, og transgene afkom kan overføre transgene gennem kønskiminen. Effektiviteten af transgene rotte generation af lentiviral transgenese kan være så højt som 80%12.
Her beskriver vi produktionen af HIV-1-afledt rekombinant lentivirus, der blev pseudotyped med vesikulær stomatitisvirus (VSV) G kuvertprotein. Brugen af anden generations emballeringssystem VSV pseudotype bestemmer den brede infektivitet af viruspartikler og tillader produktion af meget stabile vektorer, der kan koncentreres ved ultracentrifugering og kryopræpareret. Efter titer verifikation, vektorerne er klar til at blive brugt som et køretøj til transgene levering i albino Wistar rotte zygotes. Efter en række injektioner, kan embryonerne dyrkes natten over og overføres på to-celle stadium til plejemødre. På dette tidspunkt kan en af to alternative tilgange overvejes. Standardproceduren udnytter pseudogravide hunner som embryomodtagere. Men når graviditetsraten er lav efter parring med vasektomerede hanner, kan embryonerne implanteres i gravide Wistar/Sprague-Dawley (SD) hunner, der er parret med frugtbare hanrotter med en mørk pelsfarve (f.eks. Farven på pelsen tillader sondringen af afkom fra naturlig graviditet fra afkom, der stammer fra de overførte manipulerede embryoner.
Fremskridt inden for transgene teknologier har gjort gnavere modeller et uvurderligt redskab i biomedicinsk forskning. De giver mulighed for at studere genotype-fænotype relationer in vivo. Her præsenterer vi et bredt tilgængeligt alternativ til konventionel transgenese ved pronuclear injektioner. Brugen af lentiviral gentransduktion omgår behovet for krævende mikroinjektioner, fordi virale vektorer kan injiceres under zona pellucida. Denne fremgangsmåde påvirker ikke embryonens integritet, som i det væsentlige g…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af ANIMOD-projektet inden for Team Tech Core Facility Plus-programmet under Foundation for Polish Science, der samfinansieres af EU under Den Europæiske Fond for Regionaludvikling til WK.
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
Atipam 5 mg/ml | Eurovet Animal Health BV | N/A | 0.5 mg/kg |
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) | Bayer | N/A | 5-10 mg/kg |
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | injection capillary |
Bupivacaine 25 mg/ml | Advanz Pharma | N/A | 0.25% in 0.9% NaCl |
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm | Greiner Bio-One | 627160 | |
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml | cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl |
DMEM low glucose | Sigma Aldrich | D6048 | |
DNase, RNase-free | A&A Biotechnology | 1009-100 | |
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil | Sigma | ES-005-C | |
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) | ADDGENE | 14888 | |
FemtoJet | Eppendorf | 4i /5252 000.013 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin | Intervet | N/A | 125 IU/ml in .9% NaCl |
HEK 293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
Hyaluronidase from Bovine Testis | Sigma | H4272-30MG | 0.5 mg/ml in M2 medium |
Inverted Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
Ketamine 100mg/ml | Biowet Pulawy | N/A | 50 mg/kg |
Liquid Paraffin | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
M16 medium EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
M2 medium | Sigma | M7167 | |
Magnesium Chloride 1M | Sigma Aldrich | 63069-100ML | |
Microforge | Narishige | MF-900 | |
Mineral Oil | Sigma | M8410-500ML | |
NaCl 0.9% | POLPHARMA OTC | N/A | sterile, 5ml ampules |
Operation microscope | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors (delta R8.2 plasmid) | ADDGENE | 12263 | |
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
Penicilin-streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Reflex Clip Applier/Reflex Clips | World Precision Instruments | 500345/500346 | |
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads | B.Braun Surgical | 1048029 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Surgical Sewing Thread | B.Braun | C1048040 | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4334973 | |
Tolfedine 4% (tolfenamic acid) | Vetoquinol | N/A | 2 mg/kg |
TransferMan NK2 | Eppendorf | N/A | |
Trypsin EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | holders capillary |
Vita-POS | Ursapharm | N/A | eye ointment |
Warming Plate | Semic | N/A | |
Watchmaker Forceps | VWR | 470018-868 |