Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale
Summary
Cet article vise à fournir la méthodologie pour la transgenèse lentivirale chez les embryons de rats à l’aide d’injections multiples d’une suspension de virus dans l’espace périvitelline zygote. Les rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est employée pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.
Abstract
Les modèles animaux transgéniques sont fondamentalement importants pour la recherche biomédicale moderne. L’incorporation de gènes étrangers dans les premiers embryons de souris ou de rats est un outil inestimable pour l’analyse de la fonction génique dans les organismes vivants. La méthode standard de transgenèse est basée sur le microinjectage de fragments d’ADN étrangers dans un pronucléus d’un ocrayte fécondé. Cette technique est largement utilisée chez la souris, mais reste relativement inefficace et techniquement exigeante chez d’autres espèces animales. Le transgène peut également être introduit dans des embryons à un étage par infection lentivirale, offrant une alternative efficace aux injections pronucléaires standard, en particulier chez les espèces ou les souches ayant une structure embryonnaire plus difficile. Dans cette approche, une suspension qui contient des vecteurs lentiviraux est injectée dans l’espace périvitelline d’un embryon de rat fécondé, qui est techniquement moins exigeant et a un taux de réussite plus élevé. Il a été démontré que les vecteurs lentiviraux intègrent efficacement le transgène dans le génome pour déterminer la génération de lignées transgéniques stables. Malgré certaines limitations (p. ex., les exigences de biosécurité de niveau 2, les limites de taille des fragments d’ADN), la transgenèse lentiviral est une méthode de transgenèse rapide et efficace. En outre, l’utilisation de rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est présentée comme une alternative pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.
Introduction
Depuis de nombreuses années, les rongeurs de laboratoire, comme les rats et les souris, ont été utilisés pour modéliser les conditions physiologiques et pathologiques humaines. La recherche sur les animaux a mené à des découvertes qui étaient inaccessibles par tous les autres moyens. Initialement, les études génétiques se sont concentrées sur l’analyse des désordres spontanément et phénotypes qui sont considérés pour imiter étroitement la condition humaine1. Le développement de méthodes de génie génétique a permis l’introduction ou la suppression de gènes spécifiques pour obtenir un phénotype désiré. Par conséquent, la génération d’animaux transgéniques est reconnue comme une technique fondamentale dans la recherche moderne qui permet des études de la fonction génique dans les organismes vivants.
La technologie animale transgénique est devenue possible grâce à une combinaison de réalisations en embryologie expérimentale et en biologie moléculaire. Dans les années 1960, l’embryologiste polonais A. K. Tarkowski a publié les premiers travaux sur la manipulation des embryons de souris au cours des premiers stades du développement2. En outre, les biologistes moléculaires ont développé des techniques pour générer des vecteurs d’ADN (c.-à-d., porteurs) pour l’introduction, entre autres, de l’ADN étranger dans le génome de l’animal. Ces vecteurs permettent la propagation de gènes sélectionnés et leur modification appropriée, selon le type de recherche qui est menée. Le terme « animal transgénique » a été introduit par Gordon et Ruddle3.
La première espèce largement acceptée qui a été utilisée dans la neurobiologie, la physiologie, la pharmacologie, la toxicologie, et beaucoup d’autres domaines des sciences biologiques et médicales était le rat de Norvège, Rattus norvegicus4. Cependant, en raison de la difficulté à manipuler les embryons de rats, la souris maison Mus musculus est devenue l’espèce animale dominante dans la recherche génétique5. Une autre raison de la primauté de la souris dans une telle recherche était la disponibilité de la technologie des cellules souches embryonnaires pour générer des animaux knock-out pour cette espèce. La technique la plus couramment utilisée de transgenèse (2 à 10 % de la progéniture transgénique par rapport à tous les animaux nés) est la microinjection de fragments d’ADN dans un pronucléus d’un oocyte fécondé. En 1990, cette approche, qui a été introduite pour la première fois chez la souris, a été adaptée pour les rats6,7. La transgenèse de rat par injection pronucléaire est caractérisée par une efficacité inférieure8 comparée aux souris, qui est strictement liée à la présence de plasma élastique et de membranes pronucléaires9. Bien que la survie des embryons après manipulation soit de 40 à 50 % inférieure à celle des souris, cette technique est considérée comme une norme dans la génération de rats génétiquement modifiés10. D’autres approches qui peuvent garantir une incorporation transgène efficace et des taux de survie plus élevés de zygotes injectés ont été étudiées.
Le déterminant clé de l’expression transgène stable et de la transmission à la progéniture est son intégration dans le génome des cellules hôtes. Les lentivirus (VBL) ont la particularité d’être en mesure d’infecter à la fois les cellules de division et de non-division. Leur utilisation comme outil pour l’incorporation de gènes hétérologues dans les embryons s’est avérée très efficace11, et les individus transgéniques sont caractérisés par l’expression stable du fragment d’ADN incorporé. L’efficacité des vecteurs lentiviraux a été confirmée pour la modification génétique des souris12,13, rats12,14, et d’autres espèces11. Dans cette méthode, la suspension LV est injectée sous la zona pellucida de l’embryon au stade de deux pronuclées. Cette technique garantit essentiellement la survie à 100% des embryons parce que l’olémma reste inchangée. La production de suspensions LV de haute qualité et relativement fortement concentrées sont des facteurs cruciaux. Cependant, des concentrations plus faibles de suspensions de VL peuvent être surmontées par des injections répétées11, ce qui augmente la quantité de particules virales à la surface de l’œuf tout en n’affectant pas l’intégration de membrane. Les embryons qui sont soumis à des injections répétées dans l’espace périvitelline se développent davantage, et la progéniture transgénique peut transmettre le transgène par la lignée germinale. L’efficacité de la production de rats transgéniques par transgenèse lentivirale peut atteindre 80 %12.
Ici, nous décrivons la production du lentivirus recombiné dérivé du VIH-1 qui a été pseudotypé avec la protéine d’enveloppe de virus de stomatite vésiculaire (VSV) G. L’utilisation du pseudotype VSV de deuxième génération détermine la grande infectiosité des particules virales et permet la production de vecteurs très stables qui peuvent être concentrés par ultracentrifugation et cryoconservé. Après vérification de titer, les vecteurs sont prêts à être utilisés comme véhicule pour la livraison transgène dans les zygotes de rat Wistar albinos. Après une série d’injections, les embryons peuvent être cultivés du jour au lendemain et transférés à l’étape des deux cellules pour favoriser les mères. À ce stade, l’une des deux approches alternatives peut être envisagée. La procédure standard utilise les femelles pseudo-enceintes comme receveurs d’embryons. Cependant, lorsque le taux de grossesse est faible après l’accouplement avec des mâles vasectomisés, les embryons peuvent être implantés dans les femelles Enceintes Wistar/Sprague-Dawley (SD) qui sont accouplées avec des rats mâles fertiles avec une couleur de fourrure foncée (par exemple, Brown Norway [BN] rats). La couleur de la fourrure permet la distinction de la progéniture de la grossesse naturelle de la progéniture qui proviennent des embryons manipulés transférés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès des technologies transgéniques ont fait des modèles de rongeurs un outil inestimable dans la recherche biomédicale. Ils offrent l’occasion d’étudier les relations génotype-phénotype in vivo. Ici, nous présentons une alternative largement disponible pour la transgenèse conventionnelle par des injections pronucléaires. L’utilisation de la transduction de gène lentiviral contourne la nécessité d’exiger des microinjections parce que des vecteurs viraux peuvent être injectés sous la zona pel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le projet ANIMOD dans le cadre du programme Team Tech Core Facility Plus de la Fondation pour la science polonaise, cofinancé par l’Union européenne dans le cadre du Fonds européen de développement régional à WK.
Materials
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Atipam 5 mg/ml | Eurovet Animal Health BV | N/A | 0.5 mg/kg |
| Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) | Bayer | N/A | 5-10 mg/kg |
| Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | injection capillary |
| Bupivacaine 25 mg/ml | Advanz Pharma | N/A | 0.25% in 0.9% NaCl |
| Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml | cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
| Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl |
| DMEM low glucose | Sigma Aldrich | D6048 | |
| DNase, RNase-free | A&A Biotechnology | 1009-100 | |
| EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil | Sigma | ES-005-C | |
| Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) | ADDGENE | 14888 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 4i /5252 000.013 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
| Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin | Intervet | N/A | 125 IU/ml in .9% NaCl |
| HEK 293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
| Hyaluronidase from Bovine Testis | Sigma | H4272-30MG | 0.5 mg/ml in M2 medium |
| Inverted Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| Ketamine 100mg/ml | Biowet Pulawy | N/A | 50 mg/kg |
| Liquid Paraffin | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
| M16 medium EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Magnesium Chloride 1M | Sigma Aldrich | 63069-100ML | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-500ML | |
| NaCl 0.9% | POLPHARMA OTC | N/A | sterile, 5ml ampules |
| Operation microscope | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
| Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors (delta R8.2 plasmid) | ADDGENE | 12263 | |
| PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| Penicilin-streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Reflex Clip Applier/Reflex Clips | World Precision Instruments | 500345/500346 | |
| Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads | B.Braun Surgical | 1048029 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Surgical Sewing Thread | B.Braun | C1048040 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4334973 | |
| Tolfedine 4% (tolfenamic acid) | Vetoquinol | N/A | 2 mg/kg |
| TransferMan NK2 | Eppendorf | N/A | |
| Trypsin EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | holders capillary |
| Vita-POS | Ursapharm | N/A | eye ointment |
| Warming Plate | Semic | N/A | |
| Watchmaker Forceps | VWR | 470018-868 |
References
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