Generierung transgener Ratten mit einem Lentiviral Vector Ansatz
Summary
Dieser Artikel zielt darauf ab, die Methodik für die lentivirale Transgenese bei Rattenembryonen unter Verwendung mehrerer Injektionen einer Virussuspension in den zygoten Perivitelline-Raum bereitzustellen. Weibliche Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart werden, werden verwendet, um pseudoschwangere Pflegemütter zu erzeugen.
Abstract
Transgene Tiermodelle sind für die moderne biomedizinische Forschung von grundlegender Bedeutung. Die Einbindung fremder Gene in frühe Maus- oder Rattenembryonen ist ein unschätzbares Werkzeug für die Genfunktionsanalyse in lebenden Organismen. Die Standard-Transgenese-Methode basiert auf der Mikroinjektion fremder DNA-Fragmente in einen Pronukle einer befruchteten Oozyte. Diese Technik ist bei Mäusen weit verbreitet, bleibt aber bei anderen Tierarten relativ ineffizient und technisch anspruchsvoll. Das Transgen kann auch über eine Lentiviralinfektion in einzellige Embryonen eingebracht werden, was eine wirksame Alternative zu standardpronuklearen Injektionen darstellt, insbesondere bei Arten oder Stämmen mit einer anspruchsvolleren Embryostruktur. Bei diesem Ansatz wird eine Suspension, die lentivirale Vektoren enthält, in den Perivitelinraum eines befruchteten Rattenembryons injiziert, der technisch weniger anspruchsvoll ist und eine höhere Erfolgsrate hat. Es wurde gezeigt, dass Lentivirale Vektoren das Transgen effizient in das Genom integrieren, um die Erzeugung stabiler transgener Linien zu bestimmen. Trotz einiger Einschränkungen (z. B. Anforderungen an die Biosicherheitsstufe 2, Grenzwerte für die Größe von DNA-Fragmenten) ist die lentivirale Transgenese eine schnelle und effiziente Transgenesemethode. Zusätzlich wird die Verwendung weiblicher Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart sind, als Alternative zur Erzeugung pseudoschwangerer Pflegemütter dargestellt.
Introduction
Seit vielen Jahren werden Labornagetiere wie Ratten und Mäuse verwendet, um menschliche physiologische und pathologische Bedingungen zu modellieren. Tierforschung hat zu Entdeckungen geführt, die auf andere Weise unerreichbar waren. Zunächst konzentrierten sich genetische Studien auf die Analyse spontan auftretender Störungen und Phänotypen, die den menschlichenZustandeng nachahmen 1 . Die Entwicklung gentechnischer Methoden ermöglichte die Ein- oder Löschung bestimmter Gene, um einen gewünschten Phänotyp zu erhalten. Daher wird die Erzeugung transgener Tiere als eine grundlegende Technik in der modernen Forschung anerkannt, die Studien über die Genfunktion in lebenden Organismen ermöglicht.
Die transgene Tiertechnologie ist durch eine Kombination von Errungenschaften in der experimentellen Embryologie und Molekularbiologie möglich geworden. In den 1960er Jahren veröffentlichte der polnische Embryologe A. K. Tarkowski die ersten Arbeiten zur Manipulation von Mausembryonen in den frühen Stadien der Entwicklung2. Zusätzlich entwickelten Molekularbiologen Techniken zur Erzeugung von DNA-Vektoren (d.h. Trägern) für die Unterweise der Einschleppung fremder DNA in das Genom des Tieres. Diese Vektoren ermöglichen die Ausbreitung ausgewählter Gene und deren entsprechende Modifikation, abhängig von der Art der Forschung, die durchgeführt wird. Der Begriff “transgenes Tier” wurde von Gordon und Ruddle3eingeführt.
Die erste weithin akzeptierte Art, die in der Neurobiologie, Physiologie, Pharmakologie, Toxikologie und vielen anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften verwendet wurde, war die Norwegische Ratte, Rattus norvegicus4. Aufgrund der Schwierigkeit, Rattenembryonen zu manipulieren, ist die Hausmaus Mus musculus jedoch die dominierende Tierart in der Genforschung geworden5. Ein weiterer Grund für den Vorrang der Maus in solchen Forschungen war die Verfügbarkeit embryonaler Stammzelltechnologie, um Knockout-Tiere für diese Art zu erzeugen. Die am häufigsten verwendete Technik der Transgenese (2–10% der transgenen Nachkommen im Vergleich zu allen geborenen Tieren) ist die Mikroinjektion von DNA-Fragmenten in einen Pronukle einer befruchteten Oozyte. 1990 wurde dieser Ansatz, der erstmals bei Mäusen eingeführt wurde, für Ratten6,7angepasst. Rattentransgenese durch pronukleare Injektion ist durch eine geringere Effizienz8 im Vergleich zu Mäusen gekennzeichnet, die eng mit dem Vorhandensein von elastischem Plasma und pronukleären Membranen 9 zusammenhängt.9 Obwohl das Überleben von Embryonen nach Dermanipulation um 40–50 % niedriger ist als bei Mäusen, gilt diese Technik als Standard bei der Erzeugung genetisch veränderter Ratten10. Es wurden alternative Ansätze untersucht, die eine effiziente Transgenintegration und höhere Überlebensraten von injizierten Zygoten gewährleisten können.
Der Schlüsselfaktor für eine stabile Transgenexpression und Übertragung auf Nachkommen ist seine Integration in das Wirtszellgenom. Lentiviren (LVs) haben das Unterscheidungsmerkmal, dass sie sowohl teilende als auch nicht trennende Zellen infizieren können. Ihre Verwendung als Werkzeug für die Aufnahme heterologer Gene in Embryonen erwies sich als hocheffizient11, und transgene Individuen zeichnen sich durch eine stabile Expression des eingebauten DNA-Fragments aus. Die Wirksamkeit von lentiviralen Vektoren wurde für die genetische Veränderung von Mäusen12,13, Ratten12,14und anderen Arten11bestätigt. Bei dieser Methode wird die LV-Suspension im Stadium von zwei Vorkernen unter die Zona pellucida des Embryos injiziert. Diese Technik garantiert im Wesentlichen ein 100%-Überleben der Embryonen, da das Oolemma nicht betroffen bleibt. Entscheidend ist die Herstellung hochwertiger und relativ hochkonzentrierter LV-Aufhängungen. Niedrigere Konzentrationen von LV-Suspensionen können jedoch durch wiederholte Injektionen überwunden werden11, was die Menge an Viruspartikeln an der Eioberfläche erhöht, ohne die Membranintegration zu beeinträchtigen. Embryonen, die wiederholten Injektionen in den Perivitelline-Raum ausgesetzt sind, entwickeln sich weiter, und transgene Nachkommen können das Transgen durch die Keimbahn übertragen. Die Effizienz der transgenen Rattenerzeugung durch lentivirale Transgenese kann bis zu 80%12betragen.
Hier beschreiben wir die Produktion von HIV-1-abgeleitetem rekombinantem Lentivirus, das pseudotypisiert mit vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) G-Hüllprotein war. Der Einsatz des Verpackungssystems VSV-Pseudotyp der zweiten Generation bestimmt die große Infektiosität von Viruspartikeln und ermöglicht die Produktion hochstabiler Vektoren, die durch Ultrazentrifugation und Kryopreservede konzentriert werden können. Nach der Titer-Verifizierung sind die Vektoren bereit, als Vehikel für die Transgenabgabe in Albino Wistar Rattenzygoten verwendet zu werden. Nach einer Reihe von Injektionen können die Embryonen über Nacht kultiviert und im Zwei-Zellen-Stadium an Pflegemütter übertragen werden. An dieser Stelle kann einer von zwei alternativen Ansätzen in Betracht gezogen werden. Das Standardverfahren verwendet pseudoschwangere Weibchen als Embryo-Empfänger. Wenn die Schwangerschaftsrate nach der Paarung mit vasectomisierten Männchen niedrig ist, können die Embryonen jedoch in schwangere Wistar/Sprague-Dawley (SD) Weibchen implantiert werden, die mit fruchtbaren männlichen Ratten mit einer dunklen Fellfarbe gepaart sind (z. B. Brown Norway [BN] Ratten). Die Farbe des Fells ermöglicht die Unterscheidung von Nachkommen von natürlicher Schwangerschaft von Nachkommen, die aus den übertragenen manipulierten Embryonen stammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fortschritte in den transgenen Technologien haben Nagetiermodelle zu einem unschätzbaren Werkzeug in der biomedizinischen Forschung gemacht. Sie bieten die Möglichkeit, Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir eine weit verbreitete Alternative zur konventionellen Transgenese durch pronukleäre Injektionen vor. Die Verwendung von lentiviraler Gentransduktion umgeht die Notwendigkeit anspruchsvoller Mikroinjektionen, da virale Vektoren unter der Zona pellucida injiziert werden können. Diese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch das ANIMOD-Projekt im Rahmen des Team Tech Core Facility Plus-Programms der Stiftung für polnische Wissenschaft unterstützt, das von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung an die WK kofinanziert wurde.
Materials
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Atipam 5 mg/ml | Eurovet Animal Health BV | N/A | 0.5 mg/kg |
| Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) | Bayer | N/A | 5-10 mg/kg |
| Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | injection capillary |
| Bupivacaine 25 mg/ml | Advanz Pharma | N/A | 0.25% in 0.9% NaCl |
| Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml | cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
| Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl |
| DMEM low glucose | Sigma Aldrich | D6048 | |
| DNase, RNase-free | A&A Biotechnology | 1009-100 | |
| EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil | Sigma | ES-005-C | |
| Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) | ADDGENE | 14888 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 4i /5252 000.013 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
| Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin | Intervet | N/A | 125 IU/ml in .9% NaCl |
| HEK 293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
| Hyaluronidase from Bovine Testis | Sigma | H4272-30MG | 0.5 mg/ml in M2 medium |
| Inverted Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| Ketamine 100mg/ml | Biowet Pulawy | N/A | 50 mg/kg |
| Liquid Paraffin | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
| M16 medium EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Magnesium Chloride 1M | Sigma Aldrich | 63069-100ML | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-500ML | |
| NaCl 0.9% | POLPHARMA OTC | N/A | sterile, 5ml ampules |
| Operation microscope | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
| Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors (delta R8.2 plasmid) | ADDGENE | 12263 | |
| PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| Penicilin-streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Reflex Clip Applier/Reflex Clips | World Precision Instruments | 500345/500346 | |
| Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads | B.Braun Surgical | 1048029 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Surgical Sewing Thread | B.Braun | C1048040 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4334973 | |
| Tolfedine 4% (tolfenamic acid) | Vetoquinol | N/A | 2 mg/kg |
| TransferMan NK2 | Eppendorf | N/A | |
| Trypsin EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | holders capillary |
| Vita-POS | Ursapharm | N/A | eye ointment |
| Warming Plate | Semic | N/A | |
| Watchmaker Forceps | VWR | 470018-868 |
References
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