Summary

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

Published: May 17, 2020
doi:

Summary

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

Abstract

מודלים בעלי חיים טרנסגניים חשובים ביסודם למחקר ביו-רפואי מודרני. השילוב של גנים זרים לתוך העכבר מוקדם או עוברי חולדה הוא כלי רב-ערך עבור ניתוח תפקודי גנים אורגניזמים חיים. שיטת הטרנסגנזה הסטנדרטית מבוססת על מיקרוהזרקת דנ א שברי זר לתוך כמובן של מופרית. טכניקה זו משמשת רבות בעכברים אך נותרת בלתי יעילה יחסית ותובענית מבחינה טכנית במינים אחרים של בעלי חיים. הטרנסגנים ניתן גם להציג לתוך העוברים בשלב תא אחד דרך זיהום ויראלי, מתן חלופה יעילה הזריקות ברור סטנדרטי, במיוחד מינים או זנים עם מבנה העובר מאתגרת יותר. בגישה זו, השעיה המכילה וקטורים מוזרקים מוזרק לתוך החלל הפריבינאי של עובר חולדה מופרית, שהוא מבחינה טכנית פחות תובענית ויש לו שיעור הצלחה גבוה יותר. וקטורים לנטינגיליים הוכחו ביעילות לשלב את הטרנסגנים לתוך הגנום כדי לקבוע את הדור של קווים טרנסגניים יציבים. למרות מספר מגבלות (לדוגמה, ביובטיחות ברמה 2 דרישות, מגבלות גודל קטע ה-DNA), הטרנסלונגילוגיה היא שיטת טרנסגנזה מהירה ויעילה. בנוסף, שימוש בעכברושים נשיים שהוזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה מוצג כחלופה להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

Introduction

במשך שנים רבות, מכרסמים מעבדה, כגון חולדות ועכברים, נעשה שימוש כדי לעצב את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים האנושיים. מחקר בעלי חיים הוביל לתגליות שאינן מהשגה בכל אמצעי אחר. בתחילה, מחקרים גנטיים התמקדו ניתוח של הפרעות התרחשות ספונטנית ופנוטיפים הנחשבים הדוק לחקות את המצב האנושי1. התפתחות שיטות גנטיות הנדסה אפשרה הקדמה או מחיקה של גנים ספציפיים כדי לקבל פנוטיפ הרצוי. לכן, הדור של בעלי חיים טרנסגניים מזוהה כטכניקה יסודית במחקר המודרני המאפשר מחקרים של תפקוד גנים באורגניזמים חיים.

טכנולוגיית החיות הטרנסגנית הפכה לאפשרית באמצעות שילוב של הישגים באמבריולוגיה ניסיוני ובביולוגיה מולקולרית. בשנות ה-60, הפולני embryologist א. טרקובסקי לפרסם את העבודה הראשונה על מניפולציה העובר העכבר בשלבים המוקדמים של פיתוח2. בנוסף, ביולוגים מולקולריים פיתחו טכניקות כדי ליצור וקטורים DNA (כלומר, נושאות) עבור הקדמה בין היתר של DNA זר לתוך הגנום של בעל החיים. וקטורים אלה מאפשרים את התפשטות הגנים הנבחרים ואת השינוי המתאים להם, בהתאם לסוג המחקר שנערך. המונח “חיה טרנסגניים” הוצג על ידי גורדון ורודל3.

המינים המקובלים הראשונים ששימשו לנוירוביולוגיה, פיזיולוגיה, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, ותחומים רבים אחרים של מדעים ביולוגיים ומדעי הרפואה היו החולדה הנורבגית, ראאוס נורבקוס4. עם זאת, בגלל הקושי לתמרן עוברי חולדה, עכבר הבית Mus מוסקולוס הפך להיות מינים דומיננטי בעלי חיים במחקר גנטי5. סיבה נוספת של העליונות של העכבר במחקר כזה היה הזמינות של הטכנולוגיה תא גזע מעובריים כדי ליצור חיות מהממת עבור מין זה. הטכניקה הנפוצה ביותר של טרנסגנזה (2 – 10% מהצאצאים הטרנסגניים ביחס לכל בעלי החיים הנולדים) היא המיקרו-הזרקה של שברי הדי. אנ. איי. ב-1990, גישה זו, שהוצגה לראשונה בעכברים, הותאמה לחולדות6,7. שינוי חולדה על ידי הזרקה ברורה מאופיין ביעילות נמוכה יותר8 לעומת עכברים, אשר קשורה בקפדנות לנוכחות של פלזמה אלסטי וממברנות9. למרות ההישרדות של העוברים לאחר מניפולציה היא 40-50% נמוך יותר בעכברים, טכניקה זו נחשבת תקן בדור של חולדות מהונדסים גנטית10. גישות חלופיות שיכולות להבטיח התאגדות העברה יעילה של טרנסגנים ושיעורי הישרדות גבוהים יותר של הזיטים מוזרק נחקרו.

דטרמיננטת המפתח של ביטוי הטרנסגנים יציב ושידור צאצאים הוא השילוב שלה לתוך הגנום התא המארח. לאנטי וירוסים (LVs) יש את התכונה הייחודית של להיות מסוגל להדביק את שני התאים חלוקה ושאינם מפרידים. השימוש שלהם ככלי לשילוב של גנים הטרוולוגיים לעוברים הוכחו להיות יעילים מאוד11, ואנשים הטרנסגניים מאופיינים ביטוי יציב של מקטע ה-DNA משולב. היעילות של וקטורים לונגיליים אושרה עבור השינוי הגנטי של עכברים12,13, חולדות12,14, ומינים אחרים11. בשיטה זו, ההשעיה LV מוזרק תחת הסונה ולוצידה של העובר בשלב של שתי שיטות. טכניקה זו מבטיחה ביסודו של 100% את ההישרדות של העוברים משום שהלמת אינו מושפע. הייצור של שתלים LV באיכות גבוהה ומרוכזים יחסית הם גורמים חיוניים. עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר של השעיות LV ניתן להתגבר על ידי הזריקות חוזרות11, אשר מגדיל את כמות החלקיקים ויראלי על פני הביצה בעוד לא להשפיע על שילוב ממברנה. עוברים החשופים זריקות חוזרות לחלל perivitelline לפתח עוד, והצאצאים הטרנסגניים יכולים לשדר את הטרנסגנים דרך germline. היעילות של דור החולדה הטרנסגניים על ידי הטרנסגנזה של הנגיף יכולה להיות גבוהה כמו 80%12.

כאן, אנו מתארים את הייצור של HIV-1 נגזר רקומביננטי, וירוס שהיה פסבדו עם וירוס stomatitis vesicular (VSV) מעטפה G חלבון. השימוש של הדור השני מערכת אריזה VSV הסוג המדומה קובע את הנגועים הרחב של חלקיקים ויראלי ומאפשר ייצור של וקטורים יציבים מאוד כי ניתן להתרכז על ידי הקפאת המערכת הקריואופטית. לאחר אימות סיכוייו, הווקטורים מוכנים לשמש כרכב עבור המסירה טרנסגנטית ללבקן הזיטים חולדה וויסטאר. לאחר סדרת זריקות, העוברים יכולים להיות מתורבתים בן לילה ולהעביר בשלב שני-תאים לאמהות מאמצות. בשלב זה, ניתן לשקול אחת משתי גישות חלופיות. ההליך הסטנדרטי מנצל הנקבות pseudopregnant כנמעני העובר. עם זאת, כאשר שיעור ההריון נמוך לאחר ההזדווגות עם הזכרים עיקור העוברים יכולים להיות מושתל לתוך ההריון wistar/ספראג-דאולי (SD) נקבות כי הם הזדווג עם חולדות גברים פורה עם צבע פרווה כהה (למשל, בראון נורווגיה [BN] חולדות). הצבע של הפרווה מאפשר הבחנה של צאצאים מן ההריון הטבעי מן הצאצאים שמקורם העוברים מניפולציות הועברו.

Protocol

ההפקה והיישום של וקטורים ויראליים היו בהתאם להנחיות ברמת בטיחות ברמה 2 ואושרה על-ידי משרד הסביבה הפולני. כל הליכי החיות הניסיוניים המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. בעלי החיים שוכנו בכלובים מאווררים באופן אינדיבידואלי בטמפרטורה יציבה (21 – 23 ° c) ולחות (50 – 60%) עם גישה למים ומזו…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, וקטורים לונגיביים שנשאו את Syn-tdp-43-egfp המבנה יוצרו (הפיזי LV סיכוייו = 3.4 x 108/μl) ולאחר מכן יכול לשמש עבור העובר אחד-תאים בשלב השני זריקות subzonal. רק עוברים עם שני מראות. גלויים היו חשופים להליך מספר זריקות השעיות הנגיליות נקבעו כניסויים. יעילות השרשה גבוהה ומחס…

Discussion

ההתקדמות בטכנולוגיות הטרנסגניים הפכו דגמי מכרסמים כלי רב-ערך במחקר ביו-רפואי. הם מספקים את ההזדמנות ללמוד גנוטיפ-פנוטיפ יחסים ב vivo. כאן, אנו מציגים חלופה זמינה נרחב עבור הטרנסגנזה קונבנציונאלי על ידי באמצעות זריקות ברורות. השימוש של התמרה גנים לנטינגיזציה עוקפת את הצורך לדרוש הזרקות מיקר…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט ANIMOD בתוך תוכנית צוות טק ליבה מתקן פלוס של הקרן למדע הפולני, ממומן על ידי האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח האזורית למשרד שבוע.

Materials

7500 Real Time PCR System Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane) Baxter FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml Eurovet Animal Health BV N/A 0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) Bayer N/A 5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 Harvard Apparatus Limited 30-0039 injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml Advanz Pharma N/A 0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate) Orion Pharma N/A 1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm Greiner Bio-One 627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm Greiner Bio-One 628160
CellTram Oil Eppendorf 5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml cp-pharma N/A 0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin  Intervet N/A 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose Sigma Aldrich D6048
DNase, RNase-free A&A Biotechnology 1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil Sigma ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)  ADDGENE 14888
FemtoJet Eppendorf 4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin  Intervet N/A 125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells  ATCC ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis  Sigma H4272-30MG 0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope  Zeiss Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml Biowet Pulawy N/A 50 mg/kg
Liquid Paraffin Merck Millipore 8042-47-5
M16 medium EmbryoMax Sigma MR-016-D
M2 medium Sigma M7167
Magnesium Chloride 1M Sigma Aldrich 63069-100ML
Microforge Narishige MF-900
Mineral Oil Sigma M8410-500ML
NaCl 0.9% POLPHARMA OTC N/A sterile, 5ml ampules
Operation microscope  Inami Ophthalmic Instruments Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid) ADDGENE 12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), Polysciences, Inc 23966-1
Penicilin-streptomycin Sigma Aldrich P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma Aldrich 806552-500ML
Puller  Sutter Instrument Co. P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips World Precision Instruments 500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads B.Braun Surgical 1048029
Stereomicroscope Olympus SZX16
Surgical Sewing Thread B.Braun  C1048040
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystem 4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid) Vetoquinol N/A 2 mg/kg
TransferMan NK2 Eppendorf N/A
Trypsin EDTA solution Sigma Aldrich T3924-500ML
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP 
VacuTip Eppendorf 5175108.000 holders capillary
Vita-POS Ursapharm N/A eye ointment
Warming Plate Semic N/A
Watchmaker Forceps VWR 470018-868

References

  1. Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
  2. Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
  3. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  4. Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
  5. Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
  6. Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
  7. Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
  8. Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
  9. Tesson, L., et al. Transgenic modifications of the rat genome. Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).
  10. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  11. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  12. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  13. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
  14. Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).
  15. Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).
  16. Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
  17. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  18. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  19. Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
  20. Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
  21. Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
  22. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  23. Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).

Play Video

Cite This Article
Koza, P., Przybyś, J., Klejman, A., Olech-Kochańczyk, G., Konopka, W. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (159), e60570, doi:10.3791/60570 (2020).

View Video