Summary
Denne artikkelen tar sikte på å gi metodikken for lentiviral transgenesis i rotteembryoer ved hjelp av flere injeksjoner av en virussuspensjon i zygote perivitelline rommet. Hunnrotter som er parret med en fruktbar mannlig stamme med en annen dominerende pelsfarge, brukes til å generere pseudogravide fostermødre.
Abstract
Transgene dyremodeller er fundamentalt viktige for moderne biomedisinsk forskning. Inkorporering av fremmede gener i tidlig mus eller rotteembryoer er et uvurderlig verktøy for genfunksjonsanalyse i levende organismer. Standard transgenesemetoden er basert på mikroinjeksjon av utenlandske DNA-fragmenter til en pronucleus av en befruktet oocyte. Denne teknikken er mye brukt i mus, men forblir relativt ineffektiv og teknisk krevende i andre dyrearter. Transgene kan også innføres i encellede embryoer via lentiviral infeksjon, noe som gir et effektivt alternativ til standard pronukleære injeksjoner, spesielt i arter eller stammer med en mer utfordrende embryostruktur. I denne tilnærmingen injiseres en suspensjon som inneholder lentivirale vektorer i perivitelline-rommet til et befruktet rotteembryo, som teknisk sett er mindre krevende og har en høyere suksessrate. Lentivirale vektorer ble vist å effektivt innlemme transgene i genomet for å bestemme generering av stabile transgene linjer. Til tross for noen begrensninger (f.eks. biosikkerhetsnivå 2 krav, DNA fragment størrelsesgrenser), lentiviral transgenesis er en rask og effektiv transgenesis metode. I tillegg, ved hjelp av hunnrotter som er parret med en fruktbar mannlig stamme med en annen dominerende pelsfarge presenteres som et alternativ til å generere pseudopregnant fostermødre.
Introduction
I mange år har laboratoriegnagere, som rotter og mus, blitt brukt til å modellere menneskelige fysiologiske og patologiske forhold. Dyreforskning har ført til funn som var uoppnåelige på andre måter. I utgangspunktet fokuserte genetiske studier på analyse av spontant forekommende lidelser og fenotyper som anses å etterligne den menneskelige tilstanden1. Utviklingen av gentekniske metoder tillot innføring eller sletting av spesifikke gener for å oppnå en ønsket fenotype. Derfor er genereringen av transgene dyr anerkjent som en grunnleggende teknikk i moderne forskning som tillater studier av genfunksjon i levende organismer.
Transgen dyreteknologi har blitt mulig gjennom en kombinasjon av prestasjoner i eksperimentell embryologi og molekylærbiologi. På 1960-tallet publiserte den polske embryologen A. K. Tarkowski det første arbeidet med museembryomanipulasjon i de tidlige stadiene av utvikling2. I tillegg utviklet molekylærbiologer teknikker for å generere DNA-vektorer (dvs. bærere) for blant annet innføring av utenlandsk DNA i dyrets genom. Disse vektorene tillater forplantning av utvalgte gener og deres passende modifikasjon, avhengig av hvilken type forskning som utføres. Begrepet "transgen dyr" ble introdusert av Gordon og Ruddle3.
Den første allment aksepterte arten som ble brukt i nevrobiologi, fysiologi, farmakologi, toksikologi og mange andre områder av biologisk e- og medisinsk vitenskap var den norske rotten, Rattus norvegicus4. Men på grunn av vanskeligheten med å manipulere rotteembryoer, har husetmusmuskulaculus blitt de dominerende dyreartene i genetisk forskning5. En annen grunn til musens forrang i slik forskning var tilgjengeligheten av embryonisk stamcelleteknologi for å generere knockout-dyr for denne arten. Den mest brukte teknikken for transgenese (2–10% av transgene avkom i forhold til alle fødte dyr) er mikroinjeksjon av DNA-fragmenter til en pronucleus av en befruktet oocyte. I 1990 ble denne tilnærmingen, som først ble introdusert hos mus, tilpasset rotter6,7. Rottetransgenese ved pronukleær injeksjon er preget av lavere effektivitet8 sammenlignet med mus, som er strengt relatert til tilstedeværelsen av elastisk plasma og pronukleære membraner9. Selv om overlevelsen av embryoer etter manipulasjon er 40–50% lavere enn hos mus, regnes denne teknikken som en standard i generering av genmodifiserte rotter10. Alternative tilnærminger som kan garantere effektiv transgene inkorporering og høyere overlevelse av injisertzygotes har blitt undersøkt.
Nøkkelen determinant av stabiltransgene uttrykk og overføring til avkom er integrering i vertscellegenomet. Lentivirus (LVs) har det karakteristiske trekk ved å kunne infisere både skille- og ikke-delende celler. Deres bruk som et verktøy for inkorporering av heterologøse gener i embryoer viste seg å være svært effektiv11, og transgene individer er preget av stabilt uttrykk for det inkorporerte DNA-fragmentet. Effekten av lentivirale vektorer er bekreftet for genetisk modifisering av mus12,,13,rotter12,,14,og andre arter11. I denne metoden injiseres LV-suspensjonen under zona pellucida av embryoet på stadium av to pronuclei. Denne teknikken garanterer i hovedsak 100% overlevelse av embryoene fordi oolemmaforblir upåvirket. Produksjonen av høy kvalitet og relativt høyt konsentrerte LV suspensjoner er avgjørende faktorer. Lavere konsentrasjoner av LV-suspensjoner kan imidlertid overvinnes ved gjentatte injeksjoner11, noe som øker mengden viruspartikler på eggoverflaten mens de ikke påvirker membranintegrasjon. Embryoer som utsettes for gjentatte injeksjoner i perivitellinerommet utvikler seg videre, og transgene avkom kan overføre transgene gjennom germline. Effektiviteten av transgen rottegenerering ved lentiviral transgenese kan være så høy som 80%12.
Her beskriver vi produksjonen av HIV-1-avledet rekombinant lentivirus som ble pseudoskrevet med vesikulær stomatittvirus (VSV) G konvoluttprotein. Bruken av andre generasjons emballasjesystem VSV pseudotype bestemmer den brede infeksiviteten til viruspartikler og tillater produksjon av svært stabile vektorer som kan konsentreres ved ultracentrifugering og kryobevart. Etter titer verifisering er vektorene klare til bruk som et kjøretøy for transgenelevering til albino Wistar rottezygotes. Etter en rekke injeksjoner kan embryoene dyrkes over natten og overføres på tocellestadiet til fostermødre. På dette punktet kan en av to alternative tilnærminger vurderes. Standardprosedyren benytter pseudogravide kvinner som embryomottakere. Men når graviditetsraten er lav etter parring med vasectomized menn, kan embryoene implanteres til gravide Wistar / Sprague-Dawley (SD) hunner som er parret med fruktbare hannrotter med en mørk pelsfarge (f.eks Brown Norway [BN rotter]). Pelsens farge tillater skillet mellom avkom fra naturlig graviditet fra avkom som stammer fra de overførte manipulerte embryoene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Produksjon og anvendelse av virale vektorer var i samsvar med Biosafety Level 2 retningslinjer og ble godkjent av det polske miljøverndepartementet. Alle eksperimentelle dyreprosedyrer som er beskrevet nedenfor ble godkjent av den lokale etiske komité. Dyrene ble plassert i individuelt ventilerte merder ved stabil temperatur (21–23 °C) og fuktighet (50–60 %) med ad libitum tilgang til vann og mat under en 12 t / 12 timer lys / mørk syklus.
1. Lentiviral vektorproduksjon
- Transfection av HEK 293T celler
MERK: Protokollen som presenteres herer er designet for transfection av tjue Ø10 cm kulturretter som produserer ca 200 ml råolje vektor supernatant.- Kultur HEK 293T celler i DMEM medium som er supplert med føtal storfe serum (10%, v / v) i en fuktet CO2 inkubator ved 37 °C. For transfection, forberede tjue10 cm diameter plater, og frø 1,5–2 x 106 HEK 293T celler per tallerken.
- Når samløpet når ~ 70%, transfect cellene ved hjelp av polyetylenimin (PEI) reagens, pH 7.0, i et forhold på 3 μg PEI per 1 μg DNA.
- Forbered transfection blandingen for fem plater (forberede antall repetisjoner i henhold til det totale antall retter). Til 1 ml av Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; uten serum), tilsett blandingen av tre plasmids slik at de når en endelig mengde 25 μg VSVg plasmid, 50 μg delta R8.2 og 50 μg koding plasmid.
- Pipette opp og ned, og tilsett 125 μL PEI i en konsentrasjon på 3 μg/μL. Inkuber ved romtemperatur i 15 min, inverterer røret tre ganger under inkubasjon. Tilsett 200 μL av transfection blandingen per plate. Deretter inkuberplatene i en fuktet CO2 inkubator ved 37 °C.
- Konsentrasjon av lentivirale vektorer
- Førtiåtte timer etter transfection, høste mediet som inneholder LV partikler. Bruk 50 ml koniske rør.
MERK: Når du bruker en plasmid med en fluorescerende tag, kan celler visualiseres på dette punktet for å verifisere transfection effektivitet. En ny del av DMEM-mediet kan legges til, og celler kan inkuberes for ytterligere 24 timer. LV-avkastningen er sammenlignbar når den samles inn på 48 og 72 timer etter transfection. - Sentrifugerer mediet på 3000 x g i 5 min og romtemperatur for å fjerne frittliggende celler.
- Filtrer supernatanten (0,45 μm) og hell den i nye rør.
MERK: Dette trinnet kan utelates. - Tilsett DNase I (RNase-free, 1 μg/ml) og MgCl2 (1 mM), og inkuber i et vannbad ved 37 °C i 15 min.
- Overfør mediet til engangs polyetylenrør og ultracentrifuge i en svingende rotor ved 115 000 x g og 4 °C i 1,5 timer.
- Etter sentrifuging, forsiktig drenere veggene i rørene fra middels rester.
- Bløtlegg pelleten med steril fosfatbufret saltvann (PBS; 70–80 μL per rør).
- Inkuber i 2 timer ved 4–8 °C.
- Resuspender virusvektorene i PBS ved å skånne pipettering.
FORSIKTIG: Unngå skumdannelse. - Overfør til et 1,5 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 7000 x g og 4 °C i 30 s. Overfør supernatanten til et nytt rør. Gjenta dette trinnet til ingen cellulær rusk pellet er synlig.
- Aliquot og fryse ved -80 °C. Unngå å fryse LV aliquot.
- Førtiåtte timer etter transfection, høste mediet som inneholder LV partikler. Bruk 50 ml koniske rør.
- Bestemmelse av virustiter ved hjelp av kvantitativ polymerasekjedereaksjon
MERK: Titrering av virale vektorer utføres ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR). Denne metoden er basert på å forsterke et dobbeltstrandet 84 bp langt DNA-fragment innenfor den lange terminalgjentatte regionen av det virale genomet15.- Forbered standardkurven ved å lage seriell fortynninger av LV-koding plasmid: 1:500, 1:1000, 1:5,000, 1:10,000, 1:100,000, og 1:1,000,000. Bestem antall kopier av plasmidsom brukes for standardkurven. Bruk følgende formel: antall kopier/μL = (konsentrasjon [g/μL] x 6,02 x 1023 [tall/mol]) / (660 [g/mol] x plasmid størrelse [bp]), der 6,02 x 1023 tall/mol er Avogadros tall, og 660 g/mol er bp-vekten.
MERK: Online kopi nummer kalkulatorer kan brukes. - Forbered fortynninger av lentiviral suspensjon: 1:100, 1:500 og 1:1000.
- Forbered reaksjonsblandingen (volumer per brønn): 10 μL qPCR Mastermix, 1 μL av 10 μM Fremoverprimer, 1 μL av 10 μM omvendt primer og 7 μL H2O. Pipette blandingen i brønnene på 96-brønnplater.
MERK: Forover primer: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA. Omvendt primer: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA. - Tilsett 1 μL av hver standard fortynning og lentiviral suspensjon i triplicate.
- Kjør qPCR i henhold til følgende parametere: 50 °C i 2 min, 96 °C i 5 min og 35 sykluser på 96 °C i 20 s, 60 °C i 40 s og 70 °C i 1 min, etterfulgt av smeltekurvetrinn: 95 °C i 1 min og 60 °C ved 30 s.
- Analyser resultatene ved å sammenligne antall molekyler som mottas for hver fortynning til standardkurven. Bestem konsentrasjonen av vektormolekyler som gjennomsnittet av tre replikater for hver fortynning.
MERK: Den presenterte kvantifiseringen gir den fysiske konsentrasjonen av viruspartiklene. Det bør ikke behandles som en funksjonell titer.
- Forbered standardkurven ved å lage seriell fortynninger av LV-koding plasmid: 1:500, 1:1000, 1:5,000, 1:10,000, 1:100,000, og 1:1,000,000. Bestem antall kopier av plasmidsom brukes for standardkurven. Bruk følgende formel: antall kopier/μL = (konsentrasjon [g/μL] x 6,02 x 1023 [tall/mol]) / (660 [g/mol] x plasmid størrelse [bp]), der 6,02 x 1023 tall/mol er Avogadros tall, og 660 g/mol er bp-vekten.
2. Generasjon av transgene rotter
- Superovulation og samling av befruktede embryoer
- Administrere gonadotropiner.
MERK: For å øke antall innsamlede embryoer (ca. 30 per kvinne), bruk umodne 5 uker gamle Wistar-kvinner til hormonell stimulering.- På dag 1 (12 PM-1 PM), intraperitonelt injisere gravid mare serum gonadotropin (PMSG; 25 IE per kvinne). Forbered 1 ml aliquots av arbeidsløsning ved en konsentrasjon på 125 IE /ml ved å oppløse hormonpulver i 0,9% NaCl. Oppbevares ved -20 °C i opptil 1 måned eller -80 °C i opptil 6 måneder.
- På dag 3 (12 PM-1 PM), intraperitonelt injisere humant choriongonadotrophin (hCG; 30 IE per kvinne). Forbered 1 ml aliquots av arbeidsløsning (150 IE / ml) ved å oppløse hormonpulver i 0,9% NaCl. Oppbevares ved -20 °C i opptil 1 måned eller -80 °C i opptil 6 måneder.
- Etter hCG administrasjon, mate kvinner 1:1 med seksuelt fruktbare menn (3-10 måneder gammel).
- Neste morgen (dag 4 kl 8-10), sjekk hunnene for tilstedeværelse av en vaginal plugg. Sjekk vaginal åpningen for tilstedeværelse av en hvitaktig parringsplugg, som for best visualisering bør kontrolleres tidlig om morgenen etter parring natt. For embryoinnsamling, bruk bare kvinner med en synlig plugg.
- Samle embryoer kl 10. Ofre dyrene for å avgiftsgjøre oviducts, og samle oviducts i en tallerken med pre-varmet M2 medium.
- Overfør ovidudene til en 35 mm tallerken som inneholder prevarmet M2 medium med hyaluronidase fra storfe testiklene med en konsentrasjon på 0,5 mg/ml.
- Åpne veggene i ovidukten ved hjelp av fine tang under et stereomikroskop og trykk på ampulla (dvs. den hovne delen av ovidukten som inneholder befruktede embryoer som er omgitt av cumulus celler) til embryoene er frigjort.
MERK: Hyaluronidase fordøyer cumulus celler, frigjør embryoer.
FORSIKTIG: Langvarig eksponering for hyaluronidase er skadelig for embryoer; Derfor bør dette trinnet vare ikke lenger enn 5 min. - For å lette frigjøringen av embryoer fra cumulus celler, pipette dem forsiktig opp og ned ved hjelp av en glassoverføringspipette som er koblet til et munndrevet aspiratorrør.
- For å produsere overføringspipetten, trekk en pasteurpipette i glass over en flamme for å produsere en rett ~ 5-10 cm spiss. Brekk pipetten og la en tupp på ~4 cm.
- Vask embryoene et par ganger i M2 medium for å fjerne hyaluronidase og cellulær rusk. Overfør embryoene til en 60 mm tallerken som inneholder (~ 50 μL) dråper forhåndsutskåret M16 medium, dekket av flytende parafin eller mineralolje, i en fuktet 37 °C inkubator med en 5% CO2 atmosfære.
- Administrere gonadotropiner.
- Mikroinjeksjon av lentivirale vektorer til encellede embryo under zona pellucida
MERK: Bruk encellede embryoer med to synlige pronuclei for mikroinjeksjon (figur 1).- Tin LV aliquot ved romtemperatur og sentrifuge på 10.000 x g og RT i 2 min for å pellet eventuelle gjenværende cellulære rusk.
- Oppsett av mikroinjeksjon
- Forbered glassholderpipetter (borosilikatglasskapillær) ved hjelp av en mikroforge. Trekk glasskapillæren over en flamme for å produsere en 5–10 cm spiss. Brekk pipetten og la en tupp på ~4 cm. Den utvendige diameteren skal være ~ 80-120 μm.
MERK: Kontroller at pipettespissen er helt rett og glatt. - Monter den medfølgende pipetten i et mikroforge med spissen foran varmefilamentet. Varm filamentet svært nær pipettespissen og la den krympe til en diameter på ~ 15 μm (ca. 20 % av embryostørrelsen). Plasser pipetten vinkelrett på varmefilamentet, 2–3 mm fra pipettespissen, og begynn å varme. Glasset vil myke. Varm opp til den når en 15° vinkel.
- Forbered mikroinjeksjonborosilikat glasskapillærer med en filament ved hjelp av en pipetteavtrekker. Sett kapillæren inn i trekkkammeret. Kjør en rampetest (for første gang for nytt glass og hver gang etter at filamentet er endret). Sett Heat til rampeverdien -10, Trekk til 100, Hastighet til 150 og Tid til 100.
MERK: Endre parametrene for å oppnå en optimal injeksjonkapillær. - Under en biosikkerhetslamminarstrømningshette laster du ca. 2 μL av virusoppløsningen inn i pipetten for mikroinjeksjon med en mikrolasterspiss.
- Forbered en mikroinjeksjonsfat (lokk på 60 mm Petriskål) med en 100 μL dråpe M2 medium (i midten), dekket av flytende parafin eller mineralolje.
- Monter holdepipetten og mikroinjeksjonskapillæren som er lastet med virusoppløsning på en mikromanipulator og mikroinjeksjonsfat under et omvendt mikroskop.
- Forbered glassholderpipetter (borosilikatglasskapillær) ved hjelp av en mikroforge. Trekk glasskapillæren over en flamme for å produsere en 5–10 cm spiss. Brekk pipetten og la en tupp på ~4 cm. Den utvendige diameteren skal være ~ 80-120 μm.
- Utfør mikroinjeksjonen.
- Overfør 15–20 encellede embryoer til M2-fallet på mikroinjeksjonsfatet. Hold embryoet ved hjelp av en holder pipette.
- Bruk 400x forstørrelse, injiser LV-løsningen under zona pellucida til perivitelline-rommet ved hjelp av glasskapillæren som er koblet til en automatisk injektor. Hold kapillæren under zona pellucida et øyeblikk.
MERK: Ved hjelp av mildt positivt trykk vil virusoppløsningen strømme kontinuerlig ut av injeksjonskapillæren, men volumet av suspensjonen som leveres, kan ikke kontrolleres. - Bruk en fin pipette til å returnere embryoene til kulturretten i inkubatoren ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Antall injeksjoner av en zygote kan variere og kan tilpasses basert på viral vektorkonsentrasjon.
MERK: De injiserte embryoene kan overføres til fostermødre på encellede stadium eller inkuberes O /N i M16 medium før de overføres på to-cellestadiet. Langvarig in vitro kultur av rotteembryoer bør unngås.
- Overføring av injiserte embryoer til fostermødre
- Forbered fostermødre ved å parre seksuelt modne SD-kvinner med fruktbare BN menn eller med vasectomized SD menn (vasektomi prosedyren er beskrevet i avsnitt 3 nedenfor) på dag 3 (for overføring av embryoer på encellede stadium) eller dag 4 (for overføring av embryoer på to-celle stadium).
MERK: For oviduct overføring, bruk 0,5 dager etter coitum (dpc) kvinner. - Neste morgen, sjekk SD kvinner for en vaginal plugg, og bruk bare de med en synlig plugg.
- Utfør embryooverføring.
MERK: Utfør den kirurgiske prosedyren med sterile instrumenter under et stereomikroskop. Før operasjonsdagen, autoklavsaks, fine tang, nålholder og skalpellholder.- Bedøve en kvinne med i.p. administrering av ketamin (50 mg/kg) og medetomidin (0,5 mg/kg) oppløsning. Test for reflekser for å bekrefte anestesi før du starter kirurgisk prosedyre.
- Injiser dyret subkutant med tolefenaminsyre (2 mg/kg), butorphanoltart (1 mg/kg) og enrofloksacin (henholdsvis 5–10 mg/kg) for å forhindre betennelse, smerte og infeksjon.
- Påfør oftalmisk salvesmøring på begge øynene for å forhindre tørking av hornhinnen. Barber pelsen fra baksiden, og steriliser huden med kirurgisk skrubb etterfulgt av 70% alkohol ved hjelp av sterile ikke-adhering pads. La huden tørke.
- Injiser dyret subkutant med 100 μL på 0,25 % bupivakain (lokalbedøvelse) ved snittstedet. Overfør dyret i en utsatt posisjon til en ren overflate på en varmepute under målet om et kirurgisk mikroskop. Dekk rotten med en steril drapere med et lite hull kuttet over nedre rygg.
- Utfør et ca. 2 cm hudsnitt, parallelt med lumbale vertebral-kolonnen.
- Bruk skarp saks, gjør et kutt i bukveggen. Ta en ovariefettpute ved hjelp av tang, og trekk ut eggstokken og eggviukten og legg dem på gasbind som er fuktet med 0,9% NaCl.
- Aspirer M2 medium, tre bobler av luft, og embryoene inn i overføringskapillær. Anbefalt totalt antall embryoer som skal overføres (ensidig eller bilateral): gravid kvinne (≤ 15–16 embryoer), pseudogravid kvinne (≤ 30 embryoer).
- Lag et lite snitt i ovidukten (mellom infundibulum og ampulla) ved hjelp av mikrosaks, og sett overføringspipetten inn i ovidukten.
- Utvis forsiktig embryoer og luftbobler fra pipetten til ovidukten. Med stumpe tang, plasser reproduktive kanalen tilbake i bukhulen.
- Sutur bukveggen med polyglykolsyre absorberbare suturer og lukk hudsnittet med sårklemmer. Avhengig av antall embryoer som er tilgjengelige, gjenta denne prosedyren for den andre ovidukten.
- Injiser dyret intraperitonealt med atipamezole (0,5 mg/kg) for å reversere effekten av anestesi.
- Overfør dyret til et rent bur og hold det på en oppvarmingsplate for å komme seg helt fra anestesi. Levering hos rotter oppstår etter ~ 21 dager.
MERK: Når mannlige BN-rotter brukes til parring, er bare hvite valper potensielt transgene; brune valper er fra naturlig graviditet. - Samle vevfragmenter (helst fra øret) til genotype 3-ukers gamle valper.
- Forbered fostermødre ved å parre seksuelt modne SD-kvinner med fruktbare BN menn eller med vasectomized SD menn (vasektomi prosedyren er beskrevet i avsnitt 3 nedenfor) på dag 3 (for overføring av embryoer på encellede stadium) eller dag 4 (for overføring av embryoer på to-celle stadium).
3. Vasektomi
MERK: Før operasjonsdagen, autoklavsaks, fine tang og nåleholder.
- Bedøve en 5 uker gammel mannlig SD-rotte med i.p. administrering av ketamin (50 mg/kg) og medetomidin (0,5 mg/kg) oppløsning. Test for reflekser for å bekrefte anestesi før du starter kirurgisk prosedyre.
- Administrer tolfenaminsyre (2 mg/kg), butorphanoltarstrat (1 mg/kg) og enrofloksacin (henholdsvis 5–10 mg/kg) for å forhindre betennelse, smerte og infeksjon.
- Påfør oftalmisk salvesmøring på begge øynene for å forhindre tørking av hornhinnen. Plasser rottesupinen på en ren overflate på en varmepute, og steriliser huden på testiklene med kirurgisk skrubb etterfulgt av 70% alkohol ved hjelp av sterile ikke-adhering pads. La huden tørke. Dekk rotten med en steril drapere med et lite hull kuttet over testiklene. Trykk forsiktig på magen for å eksponere testiklene i pungen.
- Ved hjelp av kirurgisk saks, lage en ~ 0,5 cm snitt i midten av scrotal sac. Finn midtlinjeveggen (hvitaktig linje) mellom testiklene.
- Lag et snitt på 5 mm i testismembranen nær venstre side av midtlinjeveggen.
- Skyv forsiktig testis til venstre og finn vas deferens (mellom testis og midtlinje) som en hvit kanal med et enkelt blodkar.
- Trekk vasen forsiktig ut av pungen ved hjelp av urmakerens tang. Hold vas deferens med ett par tang, og kutt den med fin saks (eller cauterize med rødglødende tips av et andre par tang). Fjern et fragment på ~1 cm av kanalen.
MERK: Hvis cauterization utføres, holder du spissen for det andre paret med tang i flammen. - Gjenta fremgangsmåten ovenfor for de andre testis. Sutur huden med polyglykolsyre absorberbare suturer og injiser dyret intraperitonealt med atipamezole (0,5 mg/kg).
- Plasser rotten i et rent bur på en varmeplate til dyret gjenoppretter fra anestesi.
MERK: Hanner kan brukes i testparingene etter en ~ 2-ukers gjenopprettingsperiode. Etter sterilitet er bekreftet, kan de brukes til pseudograviditet induksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, ble lentivirale vektorer som bar Syn-TDP-43-eGFP-konstruksjonen produsert (fysisk LV titer = 3,4 x 108/μL) og deretter kunne brukes til encellede embryosubzonal injeksjoner. Bare embryoer med to synlige pronuclei ble utsatt for prosedyren. Antall injeksjoner av virussuspensjoner ble bestemt eksperimentelt. Høy implantasjonseffektivitet og samtidig mangel på transgene avkom ble ansett som indikatorer på et utilstrekkelig antall viruspartikler for vellykket transduksjon. I dette tilfellet ble antall injeksjoner økt. Den eneste administrasjonen av LV resulterte i fødselen av 20 F0-generasjons rotter, hvorav ingen var transgene. En økning i antall injeksjoner med en størrelsesorden resulterte ikke i fødselen av rotter, men 100% av embryoene utviklet seg til to-cellestadiet. I påfølgende eksperimenter ble antall injeksjoner økt med en sammenlignet med verdien som avkomene ble oppnådd for. For varianten av to injeksjoner ble åtte rotter født, hvorav tre ble bekreftet å bære transgene (oppsummert i tabell 1). En av grunnleggerne overførte ikke transgene til avkom. Antall embryoer som ble injisert og overført i hver eksperimentellvariant var 48 i varianter LV x1 og LV x2 og 45 i LV x10. Tre fosterkvinner ble brukt til hvert eksperimentelt oppsett. Den valgte tilnærmingen tillot generering av stabile transgene rottelinjer som uttrykte TDP-43-eGFP fusjonsprotein under kontroll av den nevronale Synapsin-1-arrangøren gjennom hele sentralnervesystemet (Figur 2A,B)14. Lentivirusbasert transgenese resulterte i en enkelt kopi innsetting av transgene som demonstrert av qPCR (figur 2C).
I det eksperimentelle oppsettet som er beskrevet ovenfor, var overlevelsesraten for de injiserte embryoene 95%. Lignende resultater ble oppnådd når samme metode ble brukt for andre lentivirale vektorer som oppsummert i tabell 2. Andelen embryoer som overlevde de pronukleære injeksjonene var signifikant lavere (29–45 %). Tabell 2 oppsummerer de representative resultatene av implantasjonseffektiviteten til manipulerte zygotes, med tanke på overføring av pseudogravide vs. gravide kvinner. Bruk av ikke-manipulerte embryoer sammen med injiserte embryoer ble tidligere rapportert16. Våre samlede resultater tyder på at gravide hunnrotter kan brukes som fostermødre med sammenlignbar effektivitet. Vi fikk en tilsvarende prosentandel av implantasjon av utenlandske embryoer hos gravide og pseudogravide rotter (samlet gjennomsnitt for flere eksperimentelle oppsett: 15% vs. 16%). Implantasjonsraten var imidlertid høyere når embryoene gjennomgikk mer subtil manipulasjon, noe som betyr en subzonal injeksjon (10% vs. 21%). Spesielt indikerte de numeriske dataene som ble analysert for individuelle runder med mikroinjeksjon at effektiviteten av implantasjon var avhengig av antall injeksjoner av ett embryo (tabell 1, siste kolonne) og indirekte avhengig av virusbelastning.
| Vektor | antall injeksjoner/embryo | antall embryoer injisert | antall valper | antall fostermødre | antall transgene grunnleggere | Implantasjonseffektivitet for hver variant |
| Syn-TDP-43WTLV | 1 | 48 | 20 | 3 | 0 | 42% |
| 10 | 45 | 0 | 3 | 0 | 0% | |
| 2 | 48 | 8 | 3 | 3 | 17% |
Tabell 1: Sammendrag av antall subzonale injeksjoner av zygotes med Syn-TDP-43WTlentivirale vektorer.
| Metoden | Vektor | Titer/ Konsentrasjon | Antall injiserte embryoer | Overlevde embryoer | Overlevelse | Antall fostermødre | Antall valper | Implantasjoneffektivitet | Graviditet (P) /Pseudopregnancy (PP) |
| Pni (andre) | TTYH1-Thy1-EGFP (TTYH1-Thy1-EGFP) | 1 ng/μL | 1083 | 424 | 39% | 16 | 54 | 13% | Pp |
| Pni (andre) | H3mCherry (andre er i dag) | 0,5-2 ng/μL | 2229 | 647 | 29% | 29 | 67 | 10% | Pp |
| Pni (andre) | Syn-TDP-43-A315T | 2 ng/μL | 1256 | 562 | 45% | 31 | 42 | 7% | Pp |
| Lv | Syn-TDP-43-A315T | 8,7 x 108 | 115 | 106 | 92% | 7 | 18 | 17% | P |
| Lv | Syn-TDP-43 WT | 3,4 x 108 | 152 | 141 | 93% | 9 | 28 | 20% | P |
| Lv | Lvh3mcherry (andre er i seg selv) | 1,3 x 107 | 504 | 450 | 89% | 13 | 115 | 26% | Pp |
Tabell 2: Embryooverlevelse og implantasjonseffektivitet, avhengig av injeksjonsmetoden som ble brukt og graviditet versus pseudograviditetinduksjon. PNI, pronukleær injeksjon; LV, lentiviral vektor subzonal injeksjon.
Figur 1: Mikroskopisk fotografi av encellede rotteembryo som ble forberedt på subzonal lentiviral vektorinjeksjon. Embryoet ble immobilisert med en holdepipette. To pronuclei som inneholdt mors og faderlig genetisk materiale og polarkroppen er synlige. Skalabar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generering av stabile transgene rottelinjer som uttrykte TDP-43-eGFP fusjonsprotein under kontroll av den nevronale Synapsin-1-arrangøren gjennom hele sentralnervesystemet. (A) Synapsin-1 (Syn)-drevet hTDP-43-eGFP uttrykksmønster i en sagittal del av transgen rotte hjernen. Skala bar = 3 mm. (B) Koronal delen av ryggmargen av en transgen rotte der eGFP fluorescens, motfarget med DAPI, var begrenset til grå materie av ryggmargen. Skalabar = 250 μm. (C) Relativ uttrykk for GFP transgene transkripsjon sammenlignet med ubiquitin C referansetranskripsjon. n = 2 wildtype. n = 2 transgene. Tallet ble endret fra14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremskritt innen transgene teknologier har gjort gnagermodeller til et uvurderlig verktøy innen biomedisinsk forskning. De gir mulighet til å studere genotype-fenotype relasjoner i vivo. Her presenterer vi et allment tilgjengelig alternativ for konvensjonell transgenese ved pronukleære injeksjoner. Bruken av lentiviral gentransduksjon omgår behovet for krevende mikroinjeksjoner fordi virale vektorer kan injiseres under zona pellucida. Denne tilnærmingen påvirker ikke embryointegriteten, noe som i hovedsak garanterer en overlevelsesrate på 100 % for injiserte zygoter. Transgene som er innlemmet ved hjelp av lentivirale vektorer er stabilt integrert i vertsgenomet, slik at langsiktig uttrykk og germline overføring. I tillegg presenterer vi to alternative teknikker for modifisert embryooverføring til fostermødre. En teknikk benytter embryooverføring til pseudogravide kvinner som tidligere er utarbeidet ved parring med vasectomized infertile menn. Den andre teknikken er basert på bruk av naturlig gravide kvinner som er parret med fruktbare menn, men med en annen pelsfarge (dvs. BN rotter). Dette mer fysiologiske løpet av svangerskapet tillater riktig utvikling av embryoer som gjennomgår utfordrende genetiske modifikasjoner16.
De første vellykkede forsøkene på å generere transgene rotter ble rapportert i 19907. Men på grunn av vanskeligheter i rottetransgenese17, har et relativt lite antall transgene rottelinjer blitt generert de siste tiårene9. Flere hovedforskjeller observeres mellom mus og rottetransgenese ved hjelp av mikroinjeksjoner. For rotter brukes hovedsakelig avlede linjer (f.eks. Wistar og SD) til transgenese. For mus bruker forskere hovedsakelig F1-kryssavle de innavlede stammene på grunn av deres høyere fruktbarhet, bedre respons på hormonell superovulation og relativt enkel utvikling av embryoer in vitro fra encellede stadium til blastocyster18. Induksjonen av superovulation hos rotter er mye mindre effektiv enn hos mus som bruker standard PMSG/hCG hormonstimulering. Av denne grunn, forsøk har blitt gjort for å utvikle alternative protokoller for å administrere disse hormonene hos rotter som benytter kontinuerlig FSH infusjon i stedet for en enkelt PMSG administrasjon19. Superovulation som er forårsaket av PMSG/hCG eller FSH/hCG har imidlertid vist seg å ha sammenlignbar effektivitet20. Etter vår mening er den mest kritiske faktoren som påvirker effektiviteten av superovulation alderen til utvalgte kvinner. Likevel bør de eksakte parametrene testes for hver rottestamme, laboratorium, etc.
Prosedyren for å injisere DNA-løsning i pronucleus av et encellede embryo er lik for begge gnagerarter. Imidlertid har pronuclei av rottezygoter ikke slike vanlige former som hos mus og har en tendens til å være vanskeligere å definere i cellens cytoplasma. I tillegg er rottezygotecellemembranen og pronukleær membran mer elastisk og viskøs, og kompliserer dermed innsettingen av en glassmikropipette som er lastet med DNA-løsning. Disse faktorene fører til lavere overlevelse av rotteegg etter mikroinjeksjonen (31–65 % vs. 80 % hos mus) og forklarer den lavere transgenese effektiviteten hos rotter9. Videre kan intensiv, mekanisk manipulering av embryoet også påvirke implantasjonseffektiviteten, som i mange laboratorier, inkludert vår, når maksimalt 10%. Dette relativt lave utbyttet observeres selv etter implantasjon av et passende antall embryoer21.
En metode som overvinner de nevnte vanskelighetene er infeksjonen av encellede embryoer med retrovirus. Retrovirus inneholder genetisk materiale i form av RNA, som ved inntreden i den infiserte cellen transkribert til DNA ved omvendt transkripsjon av viruset. DNA blir deretter transportert gjennom kjernefysiske porer til cellekjernen, hvor det integreres i genomet til cellen i form av et provirus. Lentivirale vektorer har blitt brukt til å generere transgene mus og rotter12,14,22. Encellede embryoer som mangler en zona pellucida kan inkuberes i en løsning med en lentiviral vektor, eller vektoren kan injiseres under zona pellucida i perivitelline rommet. Den største fordelen med denne metoden er dens ekstremt høye effektivitet, og når mer enn 80% av transgene avkom. Etter infeksjon med lentiviral vektor, mange kopier på forskjellige steder kan integrere i zygote genom, i motsetning til transgenesis metoden ved pronukleær mikroinjeksjon, der ett integreringssted er vanligvis observert12. I avkom av den transgene grunnleggeren som er laget ved hjelp av lentivirale vektorer, er individuelle kopier av transgene segregert, som kan manifesteres av forskjellige uttrykksprofiler av transgene i hvert av avkom. Dette kan imidlertid øke sjansen for å motta et emne med ønsket uttrykksprofil som er avledet fra transgene. Restriksjonene gjelder hovedsakelig for transgenes størrelse, som er begrenset til ca. 8 kb23.
En annen vanskelighet med rottetransgenese er generering av kvinner som tjener som surrogatmødre for genmodifiserte embryoer. I standardprosedyren krysses kvinner med sterile vasectomized menn for å indusere pseudograviditet. Hos rotter er pseudograviditetsvurderingsteknikken mye vanskeligere enn hos mus, så stimulering med gonadotropin frigjøring av hormonagonist brukes noen dager før parring med menn. Av disse grunnene, i den beskrevne protokollen gir vi to alternative tilnærminger for å skaffe fostermødre. Den generelle implantasjonseffektiviteten til manipulerte zygotes når gravide eller pseudogravide kvinner brukes, er lik. Imidlertid kan tilstedeværelsen av naturlige, ikke-manipulerte embryoer sammen med manipulerte de forbedre graviditetsfrekvensen16. Selv om den største forskjellen i implantasjonshastighet er manipulasjonsteknikken (dvs. PNI vs. LV, 10% vs. 20%; se tabell 2), kan bruk av pseudogravide kvinner som fostermødre være gunstig for noen eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren (W.K.) har rettigheter til patentet, "Metode for produksjon av et transgen dyr," fra patentkontoret i Republikken Polen (nr. P 355353; 21.03.2008).
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av ANIMOD-prosjektet i Team Tech Core Facility Plus-programmet til Foundation for Polish Science, co-finansiert av EU under European Regional Development Fund til WK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Atipam 5 mg/ml | Eurovet Animal Health BV | N/A | 0.5 mg/kg |
| Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) | Bayer | N/A | 5-10 mg/kg |
| Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | injection capillary |
| Bupivacaine 25 mg/ml | Advanz Pharma | N/A | 0.25% in 0.9% NaCl |
| Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml | cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
| Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl |
| DMEM low glucose | Sigma Aldrich | D6048 | |
| DNase, RNase-free | A&A Biotechnology | 1009-100 | |
| EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil | Sigma | ES-005-C | |
| Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) | ADDGENE | 14888 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 4i /5252 000.013 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
| Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin | Intervet | N/A | 125 IU/ml in .9% NaCl |
| HEK 293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
| Hyaluronidase from Bovine Testis | Sigma | H4272-30MG | 0.5 mg/ml in M2 medium |
| Inverted Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| Ketamine 100mg/ml | Biowet Pulawy | N/A | 50 mg/kg |
| Liquid Paraffin | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
| M16 medium EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Magnesium Chloride 1M | Sigma Aldrich | 63069-100ML | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-500ML | |
| NaCl 0.9% | POLPHARMA OTC | N/A | sterile, 5ml ampules |
| Operation microscope | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
| Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors (delta R8.2 plasmid) | ADDGENE | 12263 | |
| PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| Penicilin-streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Reflex Clip Applier/Reflex Clips | World Precision Instruments | 500345/500346 | |
| Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads | B.Braun Surgical | 1048029 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Surgical Sewing Thread | B.Braun | C1048040 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4334973 | |
| Tolfedine 4% (tolfenamic acid) | Vetoquinol | N/A | 2 mg/kg |
| TransferMan NK2 | Eppendorf | N/A | |
| Trypsin EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | holders capillary |
| Vita-POS | Ursapharm | N/A | eye ointment |
| Warming Plate | Semic | N/A | |
| Watchmaker Forceps | VWR | 470018-868 |
References
- Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
- Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
- Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
- Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
- Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
- Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
- Tesson, L., et al.
- Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
- Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).
- Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).
- Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
- Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
- Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
- Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
- van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
- Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).
