Generering av transgene rotter ved hjelp av en lentiviral vektor tilnærming
Summary
Denne artikkelen tar sikte på å gi metodikken for lentiviral transgenesis i rotteembryoer ved hjelp av flere injeksjoner av en virussuspensjon i zygote perivitelline rommet. Hunnrotter som er parret med en fruktbar mannlig stamme med en annen dominerende pelsfarge, brukes til å generere pseudogravide fostermødre.
Abstract
Transgene dyremodeller er fundamentalt viktige for moderne biomedisinsk forskning. Inkorporering av fremmede gener i tidlig mus eller rotteembryoer er et uvurderlig verktøy for genfunksjonsanalyse i levende organismer. Standard transgenesemetoden er basert på mikroinjeksjon av utenlandske DNA-fragmenter til en pronucleus av en befruktet oocyte. Denne teknikken er mye brukt i mus, men forblir relativt ineffektiv og teknisk krevende i andre dyrearter. Transgene kan også innføres i encellede embryoer via lentiviral infeksjon, noe som gir et effektivt alternativ til standard pronukleære injeksjoner, spesielt i arter eller stammer med en mer utfordrende embryostruktur. I denne tilnærmingen injiseres en suspensjon som inneholder lentivirale vektorer i perivitelline-rommet til et befruktet rotteembryo, som teknisk sett er mindre krevende og har en høyere suksessrate. Lentivirale vektorer ble vist å effektivt innlemme transgene i genomet for å bestemme generering av stabile transgene linjer. Til tross for noen begrensninger (f.eks. biosikkerhetsnivå 2 krav, DNA fragment størrelsesgrenser), lentiviral transgenesis er en rask og effektiv transgenesis metode. I tillegg, ved hjelp av hunnrotter som er parret med en fruktbar mannlig stamme med en annen dominerende pelsfarge presenteres som et alternativ til å generere pseudopregnant fostermødre.
Introduction
I mange år har laboratoriegnagere, som rotter og mus, blitt brukt til å modellere menneskelige fysiologiske og patologiske forhold. Dyreforskning har ført til funn som var uoppnåelige på andre måter. I utgangspunktet fokuserte genetiske studier på analyse av spontant forekommende lidelser og fenotyper som anses å etterligne den menneskelige tilstanden1. Utviklingen av gentekniske metoder tillot innføring eller sletting av spesifikke gener for å oppnå en ønsket fenotype. Derfor er genereringen av transgene dyr anerkjent som en grunnleggende teknikk i moderne forskning som tillater studier av genfunksjon i levende organismer.
Transgen dyreteknologi har blitt mulig gjennom en kombinasjon av prestasjoner i eksperimentell embryologi og molekylærbiologi. På 1960-tallet publiserte den polske embryologen A. K. Tarkowski det første arbeidet med museembryomanipulasjon i de tidlige stadiene av utvikling2. I tillegg utviklet molekylærbiologer teknikker for å generere DNA-vektorer (dvs. bærere) for blant annet innføring av utenlandsk DNA i dyrets genom. Disse vektorene tillater forplantning av utvalgte gener og deres passende modifikasjon, avhengig av hvilken type forskning som utføres. Begrepet “transgen dyr” ble introdusert av Gordon og Ruddle3.
Den første allment aksepterte arten som ble brukt i nevrobiologi, fysiologi, farmakologi, toksikologi og mange andre områder av biologisk e- og medisinsk vitenskap var den norske rotten, Rattus norvegicus4. Men på grunn av vanskeligheten med å manipulere rotteembryoer, har husetmusmuskulaculus blitt de dominerende dyreartene i genetisk forskning5. En annen grunn til musens forrang i slik forskning var tilgjengeligheten av embryonisk stamcelleteknologi for å generere knockout-dyr for denne arten. Den mest brukte teknikken for transgenese (2–10% av transgene avkom i forhold til alle fødte dyr) er mikroinjeksjon av DNA-fragmenter til en pronucleus av en befruktet oocyte. I 1990 ble denne tilnærmingen, som først ble introdusert hos mus, tilpasset rotter6,7. Rottetransgenese ved pronukleær injeksjon er preget av lavere effektivitet8 sammenlignet med mus, som er strengt relatert til tilstedeværelsen av elastisk plasma og pronukleære membraner9. Selv om overlevelsen av embryoer etter manipulasjon er 40–50% lavere enn hos mus, regnes denne teknikken som en standard i generering av genmodifiserte rotter10. Alternative tilnærminger som kan garantere effektiv transgene inkorporering og høyere overlevelse av injisertzygotes har blitt undersøkt.
Nøkkelen determinant av stabiltransgene uttrykk og overføring til avkom er integrering i vertscellegenomet. Lentivirus (LVs) har det karakteristiske trekk ved å kunne infisere både skille- og ikke-delende celler. Deres bruk som et verktøy for inkorporering av heterologøse gener i embryoer viste seg å være svært effektiv11, og transgene individer er preget av stabilt uttrykk for det inkorporerte DNA-fragmentet. Effekten av lentivirale vektorer er bekreftet for genetisk modifisering av mus12,,13,rotter12,,14,og andre arter11. I denne metoden injiseres LV-suspensjonen under zona pellucida av embryoet på stadium av to pronuclei. Denne teknikken garanterer i hovedsak 100% overlevelse av embryoene fordi oolemmaforblir upåvirket. Produksjonen av høy kvalitet og relativt høyt konsentrerte LV suspensjoner er avgjørende faktorer. Lavere konsentrasjoner av LV-suspensjoner kan imidlertid overvinnes ved gjentatte injeksjoner11, noe som øker mengden viruspartikler på eggoverflaten mens de ikke påvirker membranintegrasjon. Embryoer som utsettes for gjentatte injeksjoner i perivitellinerommet utvikler seg videre, og transgene avkom kan overføre transgene gjennom germline. Effektiviteten av transgen rottegenerering ved lentiviral transgenese kan være så høy som 80%12.
Her beskriver vi produksjonen av HIV-1-avledet rekombinant lentivirus som ble pseudoskrevet med vesikulær stomatittvirus (VSV) G konvoluttprotein. Bruken av andre generasjons emballasjesystem VSV pseudotype bestemmer den brede infeksiviteten til viruspartikler og tillater produksjon av svært stabile vektorer som kan konsentreres ved ultracentrifugering og kryobevart. Etter titer verifisering er vektorene klare til bruk som et kjøretøy for transgenelevering til albino Wistar rottezygotes. Etter en rekke injeksjoner kan embryoene dyrkes over natten og overføres på tocellestadiet til fostermødre. På dette punktet kan en av to alternative tilnærminger vurderes. Standardprosedyren benytter pseudogravide kvinner som embryomottakere. Men når graviditetsraten er lav etter parring med vasectomized menn, kan embryoene implanteres til gravide Wistar / Sprague-Dawley (SD) hunner som er parret med fruktbare hannrotter med en mørk pelsfarge (f.eks Brown Norway [BN rotter]). Pelsens farge tillater skillet mellom avkom fra naturlig graviditet fra avkom som stammer fra de overførte manipulerte embryoene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremskritt innen transgene teknologier har gjort gnagermodeller til et uvurderlig verktøy innen biomedisinsk forskning. De gir mulighet til å studere genotype-fenotype relasjoner i vivo. Her presenterer vi et allment tilgjengelig alternativ for konvensjonell transgenese ved pronukleære injeksjoner. Bruken av lentiviral gentransduksjon omgår behovet for krevende mikroinjeksjoner fordi virale vektorer kan injiseres under zona pellucida. Denne tilnærmingen påvirker ikke embryointegriteten, noe som i hovedsak garantere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av ANIMOD-prosjektet i Team Tech Core Facility Plus-programmet til Foundation for Polish Science, co-finansiert av EU under European Regional Development Fund til WK.
Materials
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Atipam 5 mg/ml | Eurovet Animal Health BV | N/A | 0.5 mg/kg |
| Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin) | Bayer | N/A | 5-10 mg/kg |
| Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15 | Harvard Apparatus Limited | 30-0039 | injection capillary |
| Bupivacaine 25 mg/ml | Advanz Pharma | N/A | 0.25% in 0.9% NaCl |
| Butomidor 10 mg/ml (butorphanol tartrate) | Orion Pharma | N/A | 1 mg/kg |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml | cp-pharma | N/A | 0.5 mg/kg |
| Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin | Intervet | N/A | 150 IU/ ml ml 0.9% NaCl |
| DMEM low glucose | Sigma Aldrich | D6048 | |
| DNase, RNase-free | A&A Biotechnology | 1009-100 | |
| EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil | Sigma | ES-005-C | |
| Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) | ADDGENE | 14888 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 4i /5252 000.013 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
| Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin | Intervet | N/A | 125 IU/ml in .9% NaCl |
| HEK 293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
| Hyaluronidase from Bovine Testis | Sigma | H4272-30MG | 0.5 mg/ml in M2 medium |
| Inverted Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| Ketamine 100mg/ml | Biowet Pulawy | N/A | 50 mg/kg |
| Liquid Paraffin | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
| M16 medium EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Magnesium Chloride 1M | Sigma Aldrich | 63069-100ML | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-500ML | |
| NaCl 0.9% | POLPHARMA OTC | N/A | sterile, 5ml ampules |
| Operation microscope | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
| Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors (delta R8.2 plasmid) | ADDGENE | 12263 | |
| PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,), | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| Penicilin-streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Reflex Clip Applier/Reflex Clips | World Precision Instruments | 500345/500346 | |
| Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads | B.Braun Surgical | 1048029 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Surgical Sewing Thread | B.Braun | C1048040 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4334973 | |
| Tolfedine 4% (tolfenamic acid) | Vetoquinol | N/A | 2 mg/kg |
| TransferMan NK2 | Eppendorf | N/A | |
| Trypsin EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | holders capillary |
| Vita-POS | Ursapharm | N/A | eye ointment |
| Warming Plate | Semic | N/A | |
| Watchmaker Forceps | VWR | 470018-868 |
References
- Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
- Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
- Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
- Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
- Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
- Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
- Tesson, L., et al. Transgenic modifications of the rat genome. Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).
- Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
- Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).
- Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).
- Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
- Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
- Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
- Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
- van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
- Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).
