Summary
우리는 공기 액체 인터페이스 (ALI)에서 경작 된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공기 중 입자의 스크리닝 및 모니터링을위한 견고하고 양도 가능하며 예측 가능한 체외 노출 시스템을 제시합니다.
Abstract
여기에서, 우리는 ALI에서 재배된 인간 폐 세포의 균질한 노출을 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예: 담배 연기)에 균질하게 노출할 수 있도록 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템을 제시하여 현실적인 생리학적 인 생리학적 을 제공합니다. 공기에 인간 폐포 영역의 정점 표면의 노출. 선형 에어로졸 가이던스가 있는 순차적 노광 모델과 는 달리, 방사형 유량 계통의 모듈식 설계는 테스트 분위기의 연속 생성 및 세포 수송, 균질한 분포 및 증착에 대한 모든 요구 사항을 충족합니다. 입자와 대기의 지속적인 제거. 이 노출 방법은 주로 공기 중 입자에 세포의 노출을 위해 설계, 하지만 에어로졸 생성 방법 및 노출 모듈의 재료에 따라 액체 에어로졸 및 매우 독성및 공격적인 가스의 노출에 적응 될 수있다 .
최근 완료된 검증 연구의 틀 안에서, 이 노출 시스템은 공기 중 입자의 급성 폐 세포 독성의 질적 평가를 위한 양도 가능, 재현 가능 및 예측 스크리닝 방법으로 입증되었으며, 이에 따라 잠재적으로 감소 또는 일반적으로이 독성 평가를 제공 하는 동물 실험을 대체.
Introduction
유독한 공기 중 입자의 흡입은 공중 위생 관심사, 전 세계적으로 건강 위험의 다수로 이끌어 내고 죽음의 많은 수백만 매년1,2. 기후변화, 지속적인 산업발전, 에너지, 농산물 및 소비재에 대한 수요 증가는 지난 몇 년간폐질환의증가에 기여해 왔으며3, 4,5,6. 그들의 급성 흡입 독성에 관한 흡입 성 물질의 지식과 평가는 위험 평가 및 위험 관리의 기초를 제공하지만,이 정보는 여전히 이러한 물질의 넓은 범위에 대한 부족7,8. 2006년부터 EU 화학 법규 REACH(화학물질등록, 평가, 승인 및 제한)는 기존 및 새로 도입된 제품이 시장에 출시되기 전에 흡입 경로를 포함한 독성 특성화를 거쳐야 합니다. 따라서 REACH는 대체 및 동물 없는 방법, "3R" 원리의 구현(동물 실험의 대체, 정제 및 감소) 및 적절한 시험관 내 모델의 사용에 초점을 맞추고9. 최근 몇 년 동안, 많은 상이하고 적절한 비동물 흡입 독성 시험 모델(예를 들어, 시험관 내 세포 배양, 폐온칩 모델, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS))은 공기 중 입자의 급성 흡입 독성을 평가하기 위해 개발되어5,7,10,11. 시험관 내 세포 배양 모델의 관점에서, 경작된 세포는 침수된 조건 하에서 또는 ALI에서 노출될 수있다(도 1). 그러나, 침수 된 노출 연구의 타당성은 공기 중 화합물 특히 입자의 독성평가에 관하여 제한된다. 침수 된 노출 기술은 생체 내 인간 상황에 부합하지 않습니다; 세포를 덮는 세포 배양 배지는 물리-화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험물질(12,13)의독성 성질을 갖는다. ALI 체외 흡입 모델은 시험 입자와 세포 배양 배지의 간섭없이 시험 물질에 세포의 직접 노출을 허용, 따라서, 침수 노출보다 더 높은 생리적 및 생물학적 유사성을 가진 인간의 노출을 모방12,14.
REACH와 같은 규제 프로세스의 경우, 급성 흡입 독성학 분야에서 동물 모델만 사용할 수 있으며, 시험관 내 대안이 충분히 검증되지 않았고 지금까지14. 이를 위해, 시험 모델은 시험 타당성에 대한 유럽 연합 참조 연구소의 동물 실험 대안(EURL-ECVAM) 원칙에 따라 검증되어야 합니다15.
이전 사전 검증 연구 및 최근 완료 된 검증 연구는 성공적으로 CULTEX RFS 노출 시스템의 적용 영역과 그 전송성, 안정성 및 재현성13을입증했다. 이러한 노출 시스템은 그 방사형 에어로졸 분포 개념 및 시험 에어로졸의 전도로 인해 ALI에서 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예를 들어, 담배 연기)에 세포의 균질한 노출을 가능하게 하는 시험관내 세포 기반 노출시스템(16)을통해 연속적인 흐름으로. 이 방사형 유량 시스템의 기본 모듈은 인렛 어댑터, 방사형 에어로졸 분포가 있는 에어로졸 가이딩 모듈, 샘플링 및 소켓 모듈, 핸드 휠이 있는 잠금 모듈로구성됩니다(그림 2). 생성된 입자는 인렛 어댑터 및 에어로졸 가이딩 모듈을 통해 세포에 도달하고 샘플링 모듈의 3개의 방사형 배치된 노출 챔버에 위치한 세포 배양 인서트상에 증착된다. 에어로졸 가이딩 모듈과 샘플링 모듈은 외부수조(17)에연결하여 가열할 수 있다.
두 연구의 틀 내에서, A549 세포는 모든 노출 실험에 사용되었다. 상기 세포주 A549는 인간 불멸의 상피 세포주로서 매우 잘 특성화되어 수많은 독성 연구에서 II형 폐포 상피 세포에 대한 시험관내 모델로 사용되어 왔다. 상기 세포는 라멜라 체, 계면활성제 및 다수의 염증 관련인자(18)의생산을 특징으로 한다. 그(것)들은 또한 그들의 점액 생산19때문에 기관지 상피 세포의 속성을 보여줍니다. 또한 ALI에서 배양할 수 있습니다. 이러한 세포주들은 세포-세포 접촉을 구축하는데 결핍되어 있지만, 이들 세포의 배양은 훨씬 더 편리하고, 비용이 적게 들고, 이의 유래 된 결과는 1차세포(20)에비해 공여자-독립적이다.
A549 세포를 삽입당 3.0 x 105 세포의 밀도로 6웰 세포 배양 인서트(PET 멤브레인, 4.67 cm2,기공 크기 0.4 mm)에서 시드하고 24시간 동안 침수된 조건에서 배양하였다. 세포는 공기를 청소하기 위해 3 개의 독립적 인 실험실에서 노출된 후 ALI에서 20 개의 시험 물질 중 3 가지 노출 용량 (25, 50 및 100 μg / cm2)을노출했습니다. 노출 량은 각각 15, 30 또는 60 분 후에 세포에 25 μg/cm2,50 μg/cm2 및 100 μg/cm2의 일정한 입자 비율의 결과로 증착 시간과 상관됩니다. 증착된 입자는, 그러나, 증착 후에 떨어져 세척되지 않았습니다, 그러나 24 시간 동안 세포에 남아 있었습니다. 입자의 증착 시간은 따라서 15, 30 및 60 분이었지만 세포의 노출은 총 24 시간 동안 지속되었습니다. 시험 물질의 증착 속도는 이전 방법17에따른 예비 실험에서 결정되었다.
세포 생존력의 지표로서 세포 생존력은 세포 생존성 분석기를 사용하여 입자 증착 후 24시간 평가되었다. 특히 청정 공기 제어의 품질, 노출 프로토콜의 최적화 및 개선, 실험실 내 재현성 및 예측 모델(PM)의 확립에 중점을 두였습니다. 세포 생존율 50% 이하(PM 50%) 감소를 초래한 물질 또는 75% (PM 75%) 3개의 노출 복용량 중 어느 에서든 급성 흡입 위험을 발휘하는 것으로 간주되었다. 그 후 생체내 데이터(OECD 테스트 가이드라인(TG) 403 또는 TG 43621,22에따른 최소 하나의 신뢰할 수 있는 연구결과에 기초하여, 83%의 특이성 및 88%의 민감도를 가진 85%의 전체 적인 일치로 이끌어 내는 결과를 비교하였다.
세포 생존가능성의 측정 외에, 사이토카인 방출과 같은 다른 종점, LDH 분석시험을 통한 세포 용해 또는 막 무결성의 검사는 평가될 수 있지만 유효성 검사 연구에는 필요하지 않았다. 따라서, 노광 시스템(예를 들어, CULTEX RFS)은 시험된 공수 입자의 급성 흡입 독성에 대한 질적 평가를 위한 예측 스크리닝 시스템으로서 입증되었으며, 동물 실험에 대한 유망한 대체 방법을 나타낸다. 다음 프로토콜은 이 노출 시스템을 사용하여 공중 입자에 대한 노출 실험에 권장됩니다.
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Protocol
참고: 한 노출 실험의 프로토콜은 3일의 기간을 다룹니다.
1일차
1. 세포의 일반적인 준비 및 재배
참고: 인간 폐 선암상피 세포주 A549를 노출 실험에 사용하였다. 세포는 멸균 조건하에서 처리되어야 합니다. ALI에서 의 재배에 적합한 다른 세포주를 사용할 수 있다.
- 성장 배지(덜베코의 최소 필수 배지(DMEM)를 준비하고, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 5 μg/mL 젠타마이신을 보충하고 노출 배지(DMEM, 5 μg/mL 젠타마이신 및 최종 HEPES 농도 100 mM)를 보충합니다.
- 배양 A549 세포는 37°C에서 성장 배지에서 5%CO2를함유하는 가습된 대기에서.
- 세포 배양 플라스크에서 세포를 75 cm2(T-75)의 성장 배지의 14 mL에서 80-90%의 합류전까지(매 2-3일마다) 및 35의 대강구를 배양한다.
- 현탁액 부피 및 필요한 수의 세포 배양 인서츠(깨끗한 공기 및 입자 노출을 위한 인큐베이터 제어 및 세포 배양 삽입물로서 3개의 세포 배양 삽입물) 및 세포 배양 플레이트를 계산합니다.
- 세포의 트립시니화 및 파종 전에, 6웰 플레이트의 각 웰에 2.5 mL의 강화 된 성장 배지를 추가하십시오. 세포 배양 삽입을 우물 내부에 조심스럽게 삽입하고 모든 세포 배양 삽입에 1 mL 성장 배지를 추가합니다. 인큐베이터에서 적어도 30분 동안 6웰 플레이트를 배양(37°C, 5%CO2).
2. 세포의 트립시니화
- 템퍼 인산염 완충식염수(PBS) 및 성장 배지(37°C 및 트립신/EDTA(0.05%/ 0.02%) 실온에서 용액을 제공합니다.
- 세포 배양 배지를 세포 배양 플라스크로부터 흡인하고 예열된 PBS의 8 mL로 세포를 조심스럽게 세척한다.
- PBS를 제거하고 트립신/EDTA 2mL를 추가합니다(0.05%/ 0.02%) 37°C에서 인큐베이터에서 최대 6분 동안 세포를 용액및 배양한다. 현미경으로 분리 과정을 제어합니다.
- 트립신 활성을 중화 8 mL 예열 된 성장 매체를 추가 하 여, 부드럽게 플라스크에 옆으로 도청 하 여 세포를 분리 하 고 위아래로 반복 하 여 세포를 다시 중단.
- 셀 현탁액을 50 mL 튜브로 옮김. 추가 시술(예를 들어, 세포의 파종, 세포의 계통과)에 대한 세포 수를 결정한다.
3. 셀 번호의 결정
참고: 세포 농도는 세포 카운터 또는 계수 챔버를 사용하여 결정되었다.
- 100 μL의 세포 배양 현탁액을 10 mL의 원소 용액으로 채워진 컵에 희석한다. 흔들리지 않고 컵을 천천히 기울입니다.
- A549 셀의 세포 별 측정 매개 변수를 기반으로 실행 가능한 셀/mL 및 셀 생존 가능성을 결정합니다.
4. 세포 배양 삽입의 미세 다공성 멤브레인에 세포 파종
참고: 노광 시스템에는 특수 어댑터가 장착되어 있어 다양한 공급업체와 다양한 크기의 상업용 인서트를 사용할 수 있습니다. 이러한 노출 실험을 위해, 6웰 플레이트 및 상응하는 세포 배양 인서트를 사용하였다. 모든 작업 단계는 멸균 조건하에서 수행해야 합니다.
- 멸균 세포 배양 조건(층류)에서 예열된 성장 배지를 제공합니다.
- 3.0 x 10 5 세포/mL의 세포 농도로 충분히 높은 부피의 세포 현탁액을 준비합니다.
- 플레이트를 30분 동안 템퍼링한 후, 각 세포 배양 삽입물에서 3.0 x 105 세포/mL의 밀도를 가진 A549 세포의 세포 배양 삽입 및 종자 1 mL 내의 배지를 흡인한다. 부드러운 흔들림으로 셀 서스펜션을 분배합니다.
- 세포 배양 삽입을 24시간 동안 세포 현탁액으로 인큐베이션(37°C 및 5%CO2).
5. 시험 물질의 압착
참고: 테스트 물질을 완전히 제어 가능한 유압 프레스를 사용하여 분말 케이크에 압착했습니다. 프레스 패키지는 프레스 패키지의 현재 오일 압력(바)으로 표시되는 최대 18kN의 힘을 가할 수 있습니다. 미지근한 시험 물질의 프레스 조건(가압, 가압 시간)을 확립하고 예비 시험을 특징으로 해야 합니다. 물질의 프레스 특성에 따라 다양한 프레스 파라미터와 프레스 플런저를 사용할 수 있습니다.
주의: 독성 또는 위험한 물질을 누를 때는 보호 장비를 착용하십시오.
- 프레스 의 전면에 있는 시간 제어를 통해 누압 시간을 설정합니다.
- 압축 공기 밸브에서 압축 공기 공급을 엽니다. 압축 공기 압력을 프레스 전면또는 압축 공기 공급의 압축 공기 밸브의 압력 조절기를 사용하여 약 2bar(전면의 압력 게이지로 표시)로 설정합니다. 서랍을 당기고 버튼을 누르고 디지털 압력 스위치의 가압을 읽습니다.
- 압력이 너무 높거나 너무 낮은 경우 압력 조절기의 압력만 읽으십시오.
- 물질 용기를 조립하고 유리 실린더가 올바르게 중앙에 있는지 확인합니다(추가그림 1). 소량의 시험 물질로 물질 용기를 채웁니다. 플런저를 물질 용기에 넣고 약간 앞뒤로 돌려 용기에 분말을 고르게 분배합니다.
- 서랍에 플런저가 있는 물질 용기를 놓고 누르기 버튼을 누릅니다. 프레스의 유압 피스톤이 플런저로 이동하여 설정된 프레스 시간 동안 시험 물질에 압력을 가합니다. 서랍을 열고 플런저를 제거합니다.
- 5.3 단계와 5.4 단계를 반복하여 물질 용기가 절반 이상이 가득 차게 될 때까지 반복합니다.
- 가압 작업이 완료된 후 서랍에서 물질 용기를 제거하고 거꾸로 뒤집어 느슨하고 증착된 입자를 제거합니다.
- 같은 날에 물질 용기가 필요하지 않은 경우 시험 물질이 건조하거나 수분을 흡수하지 못하도록 파라필름으로 물질 용기를 닫습니다.
2일차
6. 노광 시스템의 조립 및 주변 장비 연결
참고: 보다 자세한 보기는 그림 3, 추가 그림 2 및 보충 그림 3에서제공됩니다. 제조업체의 지침에 따라 모듈과 에어로졸 발전기를 모두 조립합니다.
- 물 공급이 앞으로 향하게 하여 고체 및 고균 표면에 노출 시스템을 놓습니다. 질량 유량 컨트롤러를 에어로졸 발생기와 모듈에 연결된 3넥 병과 연결하여 공기에 깨끗한 공기 가전을 제공합니다.
- 유량 컨트롤러와 진공 펌프를 연결합니다. 에어로졸 가이딩 모듈의 부착물에서 튜브 커넥터와 유량 컨트롤러의 튜브를 연결합니다. 유량 컨트롤러의 반대편에 있는 튜브를 진공 펌프와 연결합니다. 흐름이 모듈에서 유량 컨트롤러를 거쳐 진공 펌프로 흘러가는지 확인합니다.
- 수조를 난방 수로와 연결하십시오. 물 공급은 에어로졸 가이딩 모듈의 물 입구로 수조에서 가고 있다. 에어로졸 가이딩 모듈의 물 출구를 샘플링 모듈의 물 입구와 연결합니다. 샘플링 모듈의 물 출구에서 수조로 연결하여 원을 닫습니다.
- 노출 모듈에 가까운 용적물 화기를 포함한 에어로졸 발생기를 배치하고 용황기의 과잉 라인과 큰 마이크로 필터로 노출 및 깨끗한 공기 모듈을 연결하고, 작은 마이크로 필터로 노출 챔버의 흡입 (예를 들어, 일회용 필터). 용출로는 생성된 미립자 대기의 저장소 역할을 하며 약 7 μm보다 큰 입자를 유지하지만 더 작은 입자는 노출 모듈로 이송됩니다.
- USB 케이블과 전원 공급 장치를 통해 에어로졸 생성을 제어하는 데 사용되는 컴퓨터를 에어로졸 발전기 상단의 USB 포트에 연결합니다. 전원 공급 장치의 AC 전원 플러그를 소켓(220-240V)에 연결합니다.
- 두 개의 펌프로 중간 공급 및 제거를 위해 파이프를 연결합니다. 중간 공급용 펌프를 사용하는 대신 매체를 수동으로 채울 수도 있습니다.
7. 깨끗한 공기와 입자 노출을위한 준비
- 진공 펌프, 유량 제어기 및 수조(37°C)를 30분 이상의 예열 기간 동안 켭니다.
- 압축 공기 공급을 엽니다. 에어로졸 발전기에 공급 라인의 질량 흐름 컨트롤러를 8L/min으로 설정하고 공급 라인의 경우 3개의 목병으로 설정합니다. 질량 흐름 컨트롤러의 탭을 닫습니다.
참고: 이러한 값은 시험 물질의 특성에 따라 달라질 수 있습니다. - 컴퓨터를 통해 유량 컨트롤러를 조정하여 모듈 흐름(1.5L/min)과 챔버 흡입(30mL/min)을 조절합니다.
8. 방사형 유동 시스템의 누설 테스트
참고: 모듈이 제대로 재조립되었는지 확인하기 위해 진공 및 두 모듈(노광 및 클린 에어 모듈)에 대해 누설 검사를 수행해야 합니다.
- 에어로졸 가이딩 모듈에서 입구 어댑터와 응축수 반사경을 제거합니다. 더미 플랩이 있는 샘플링 모듈의 플러그와 중간 공급 연결이 있는 에어로졸 가이딩 모듈의 에어로졸 공급 보어 3개를 닫습니다.
- 에어로졸 가이딩 모듈의 튜브 커넥터와 필터 없이 진공 라인을 연결합니다. 핸드 휠을 사용하여 모듈을 닫고 흐름 컨트롤러의 값을 측정합니다. 값은 5 mL /min 미만으로 닫은 후 몇 분 정도 감소해야합니다.
- 불침투성 검사 후 모든 플러그와 더미 플랩을 제거하고 에어로졸 가이딩 모듈에 인렛 어댑터와 응축수 반사경을 삽입하고 파이프를 연결하여 중간 공급 및 제거를 위해 파이프를 연결합니다.
9. 에어로졸 생성
- 컴퓨터와 소프트웨어를시작합니다(추가 그림 4). 컴퓨터 바탕 화면의 에어로졸 발생기 시작 버튼을 두 번 클릭하여 에어로졸 발전기 소프트웨어를 시작합니다. 메시지 창이 나타나설정을 재설정해야 하는지 묻습니다. 소프트웨어가 해당 날 처음으로 시작된 경우 예를 클릭합니다. 슬라이드 위치 및 스크레이퍼 위치의 값을 기본값으로 설정합니다. 아니요를 클릭하여 슬라이드 위치 및 스크레이퍼 위치의 값을 유지하거나 슬라이드가 시작 위치에 있지 않습니다.
- 에어로졸 발전기 상단의 중앙 개구부에있는 파이프에 물질 스크레이퍼를 나사.
참고 : 프레스 특성에 따라 독특한 유형의 물질 스크레이퍼를 사용할 수 있습니다. - 물질 스크레이퍼가 가장 낮은 위치에 있지 않은 경우 버튼 호밍 모드를 사용합니다.
- 물질 스크레이퍼 위에 가압 된 테스트 재료가있는 물질 용기를 거꾸로 놓습니다. 물질 용기의 유리가 전면을 향하도록 합니다. 물질 용기의 두 구멍이 에어로졸 생성기 상단의 두 핀에 맞는지 확인하십시오. 잠금 플레이트를 실체 용기 위에 놓고 검은 나사를 조입니다.
- 피드 값(0.24 ~ 20mm/h) 및 회전(1 ~ 800회 회전/h)을 원하는 설정으로 변경합니다. 입자 농도는 이송 값 또는 담체 가스 유량을 증가 또는 감소시킴으로써 수정될 수 있다.
- 아래쪽 화살표를 사용하여 물질 스크레이퍼가 눌인 물질 근처에 다다붙을 때까지 물질 용기로 슬라이드를 아래로 밀어 넣습니다.
- 질량 흐름 컨트롤러를 탭하여 에어로졸 발전기에 압축 공기 공급을 열고 시작 버튼을 클릭하여 에어로졸 생성을 시작합니다. 긴 대기 시간을 피하기 위해 이송 속도를 15-20mm/h로 설정합니다.
- 작은 손전등(Elutriator의 유리 관 뒤에서 위치)으로 미세 먼지 구름을 관찰하여 올바른 입자 생성을 제어합니다. 첫 번째 에어로졸 증기가 Elutriator에 지속적으로 도달하면 피드 값을 원하는 설정으로 변경하고 중지 버튼을 클릭합니다.
10. 노출 실험
- 예열된 노출 매체로 중간 공급 장치를 시작하고 모듈이 열려 있는 동안 다운파이프가 덮일 때까지 샘플링 모듈을 채웁니다. 중간 펌프를 사용하거나 매체를 수동으로 채웁니다(개별 노출 챔버당 25 mL).
- 블라인드 셀 배양 삽입(셀 없이 삽입)을 노출 모듈에 삽입합니다. 하부 파이프가 매체로 덮여 있고 인서트가 매체와 접촉할 때까지 노출 매체를 아래로 펌프합니다.
- 에어로졸 발생기를 시작하고 노광 모듈을 닫고 노출 모듈을 에어로졸 발생기의 노광 모듈 출구에 연결합니다. 에어로졸 발생기의 안정적인 생성을 위해 노출이 시작되기 최소 20-30분의 리드 타임을 에어로졸 발생기에게 제공합니다.
- 리드 타임 동안 인큐베이터 대조군 및 노출된 세포 배양 삽입을 위한 포스트 인큐베이션 플레이트를 준비한다. 웰당 1.5 mL의 성장 배지를 추가하고 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다 (37 °C, 5 %CO2).
- 리드 타임 이후에 는 고무 플러그로 Elutriator의 노출 모듈 출구를 밀봉하고 블라인드 인서트를 제거합니다. 하부 파이프가 매체로 덮일 때까지 노출 매체(펌프 사용 또는 수동으로 사용)를 다시 채웁니다. 이제 질량 흐름 컨트롤러의 탭으로 깨끗한 공기 모듈에 압축 공기 공급 장치도 열수 있습니다(3L/min).
- 핀장의 도움으로 6 웰 플레이트에서 세포 배양 삽입을 제거하십시오. 세포 배양으로부터 성장 배지를 조심스럽게 붓고 인서트를 토플링하여 흡인하고 피펫을 사용하여 잔류 액체를 폐기한다. 두 모듈, 노광 및 깨끗한 공기 모듈의 노출 챔버에 인서트를 놓습니다.
- 모듈을 닫고 노광 모듈을 에어로졸 발생기의 노광 모듈 출구에 연결하고 청정 공기 모듈을 캐리어 가스 공급장치에 동시에 연결하여 노출 실험을 시작합니다.
참고: 입자 농도는 이송 값, 캐리어 가스 유량 또는 노출 시간을 증가/감소시켜 수정할 수 있습니다. - 실험이 완료된 후 노출 및 깨끗한 공기 모듈을 분리하고 노광 모듈 출구를 밀봉합니다.
- 정지 버튼을 클릭하여 압축 공기 공급 장치와 에어로졸 발생기를 중지합니다.
- 노출 및 깨끗한 공기 모듈을 열고 핀처를 사용하여 준비된 포스트 인큐베이션 플레이트로 세포 배양 삽입을 전달합니다. ALI에서 24 시간 (37 °C, 5 %CO2)에대한 6 웰 플레이트를 배양합니다.
참고: 추가 노출 실험이 계획된 경우 10.5 -10.10 단계를 반복합니다. - 노출된 세포 배양 인서트와 동일한 조건하에서 ALI에 인큐베이터 제어로 사용되는 세포 배양 인서트를 들어 올리고 이를 ALI에서 24시간(37°C, 5%CO2)동안배양한다.
- 버튼 호밍 모드를 사용하여 물질 용기를 제거합니다. 오른쪽 상단 모서리에 있는 X를 클릭하여 에어로졸 발생기 소프트웨어를 닫고 컴퓨터를 끕니다.
- 모든 노출 실험이 완료된 후 에어로졸 발생기와 노광 모듈을 모두 청소하십시오. 시험 물질이 다음 일 이내에 더 많이 사용되는 경우 파라 필름으로 물질 용기를 닫습니다.
3일차
11. 세포 생존력
참고: 세포 생존성은 WST-1 분석을 사용하여 미토콘드리아 활성을 측정하여 입자 증착 후 24시간 결정하였다. 분석은 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다. 세포 생존력은 또한 다른 세포 생존력 시험(예를 들어, XTT)을 사용하여 결정될 수 있다.
- 37°C에서 템퍼 성장 배지를 및 빛으로부터 보호된 WST-1 용액을 해동한다. 웰 당 2.5 mL 성장 배지와 새로운 6 웰 플레이트의 적절한 수를 준비하고 인큐베이터에서 플레이트를 인큐베이터에 인큐베이터.
- 성장 배지에서 충분한 양의 WST-1 1:7을 희석하여 WST-1 희석을 준비합니다.
- 세포 배양을 삽입한 후 24시간 노출 후 새로운 제조된 6-웰 플레이트에 삽입한다. 각 세포 배양 삽입에 신선하게 제조된 WST-1 용액의 1 mL를 첨가한다. 용액을 세포에 균일하게 분배하기 위해 플레이트를 조심스럽게 흔들어 주세요. 6웰 플레이트를 1시간 동안 세포 배양 인서트와 함께 배양(37°C, 5%CO2).
- 각 6웰에서 96웰 플레이트로 삼중상류물의 100 μL을 전송한다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 650 nm의 기준 파장으로 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.
12. 통계
- 개별 인큐베이터 컨트롤의 세포 생존력을 100%로 정상화합니다.
- 개별 인큐베이터 대조군과 관련하여 노출된 세포의 생존가능성을 표현한다. 시험 물질의 세포 독성은 각각의 인큐베이터 대조군과 비교하여 독성의 지표로서 사용하였다.
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Representative Results
CULTEX RFS는 ALI에서 세포의 직접적이고 균일한 노출을 가능하게 하는 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템입니다. 이전 사전 검증 연구 내에서, 이 노출 시스템의 일반적인 적용 가능성과 그 전이성, 안정성 및 재현성이 성공적으로 입증되었다. 독일 연방 교육 연구부의 지원을 받은 최근 연구 프로젝트에서 노출 시스템은 테스트된 화합물의 급성 흡입 위험에 대한 예측 모델(PM)으로 성공적으로 검증및 확립되었습니다. 사전 검증 연구 에서 청정 공기 제어의 품질이 중요한 매개 변수로 밝혀짐에 따라, 여러 프로토콜 및 방법 최적화 (예를 들어, 세포 배양 삽입물의 변화, HEPES 농도를 100 mM로 증가시킴으로써 노출 매체의 pH의 안정화)가 구현되어 검증 연구의 초기에 구현되어 매우 안정적이고 재현 가능한 결과및 3가지 청정 공기 비량성(4)을 통해 실질적인 개선으로 이어졌습니다. A549 세포는 3개의 독립적인 실험실에서 미리 선택되고 코딩된 시험 물질 20개중 3개의 상이한 노출 용량(25, 50 및 100 μg/cm2)에 ALI에서 노출된 후, 세포독성(독성의 지표로서 사용됨)을 각각의 인큐베이터 대조군과 비교하였다. 13개의 코딩된 물질은 삼중항, 7개의 코딩된 물질을 단일 실험으로 시험하였다. 시험 물질은 세포 생존이 50 % 이하로 감소 할 때 급성 흡입 위험을 발휘하는 것으로 간주되었다 (PM 50%) 또는 75%(PM 75%).
도 5에도시된 바와 같이, 상이한 시험 물질에 대한 A549 세포의 노출은 없음, 배지 또는 강한 독성을 나타내었다. 모든 실험이 3개의 실험실에서 독립적으로 수행되었기 때문에, 실험실 내 및 실험실 간의 재현성과 노광 시스템의 예측성에 관한 데이터를 분석하였다. 적용된 PM(PM 50% 또는 PM 75%)에 따라 실험실 내 및 실험실 간 재현성은 90-100%로 이 방법의 견고성과 전달성을 입증했습니다. 모든 시험된 물질이 생체 내 기준 데이터(OECD TG 403 또는 TG 436에 따라 기존의 LC50 프로토콜 및 농도 x 시간(C x t) 프로토콜을 이용한 적어도 하나의 신뢰할 수 있는 연구에 기초하여, 생체내 및 생체외 내 데이터는 83%(10/12)의 특이성과 85%(7/8)의 민감도를 가진 85%(17/20)의 전반적인 일치를나타냈다(표 1). 단지 두 물질은 거짓 긍정으로 분류하고 하나는 거짓 으로 부정적인 것으로 분류되었다.
요약하면, 검증 연구의 결과는 선택된 공기 중 입자의 급성 폐 세포 독성의 질적 평가를 위한 양도 가능, 재현 가능 및 예측 스크리닝 방법을 제시한다.
그림 1: ALI 또는 침수 된 조건에서 세포의 노출. A549 세포는 노출 시스템의 입구를 통해 ALI(왼쪽)에서 시험 물질(파란색 화살표 및 점)으로 노출되거나 노출 매체에서 희석된 시험 물질(파란색 점)으로 잠수 조건(오른쪽)을 생성할 수 있습니다. 빨간색 점선은 각각의 실험 설정에서 노출 매체의 채우기 수준(밝은 빨간색)을 나타냅니다. 이 수치는 Tsoutsoulopoulos 외24에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 노출 모듈입니다. 인렛 어댑터, 에어로졸 가이딩 모듈, 샘플링 및 소켓 모듈 및 핸드 휠이 있는 잠금 모듈로 구성된 방사형 유량 시스템의 기본 모듈에 대한 회로도 개요. 이 수치는 Aufderheide 외17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 노출 시스템의 개요입니다. 구성 요소는 깨끗한 공기와 입자 노출을위한 두 개의 노출 모듈, 용황체 및 해당 제어 장치를 포함한 에어로졸 발생기 및 중간 펌프입니다. 이 수치는 Aufderheide 외17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 테스트 방법을 최적화한 후 공기 생존 가능성 데이터를 깨끗하게 합니다. 깨끗한 공기에 세포의 노출은 시간이 지남에 따라 세포 생존능력의 감소로 이어졌으며, 사전 검증 연구에 비해 깨끗한 공기 생존 률 데이터가 크게 향상되었습니다. 모든 깨끗한 공기 제어는 각 실험실(실험실 1-3) 및 노출 시간(실험실당 n = 46및 시점)에 대해 풀화되었습니다. 데이터는 중앙선과 수염으로 표시된 범위가 있는 박스플롯으로 표시됩니다. 이 수치는 Tsoutsoulopoulos 외23에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: A549 세포를 다른 시험 물질에 노출. (a)텅스텐(IV) 초경에 A549 세포의 노출은 3개의 상이한 노출 복용량에 대한 세포 생존능력의 감소를 나타내지 않았으며 비독성(n=3 실험실 당 및 노출 용량)으로 나타났다. (B)테트라브로모프탈릭 무수화물에 대한 세포의 노출은 양호한 투여량 반응 곡선을 제시하는 중간 독성의 모든 실험실에 대한 결과(n=1 실험실 당 및 노출 투여량). (C)아연 디메틸디티오카르바메이트는 강한 독성을 나타내었으며, 이미 25 μg/cm2의 증착 투여 후 세포 생존가능성이 감소하였다(n=3 실험실 당 및 노출 용량). 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 수치는 Tsoutsoulopoulos 외23에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 생체 내 참조 결과 | 시험관내 결과 | |||||
| 물질 | OECD TG | CLP 규제 | 독성 | PM50% | PM75% | 생체 내/체외에 따라 |
| 텅스텐 (IV) 초경 | 403 | n. c | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 텅스텐 (IV) 초경 나노 | - | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| N,N'-에틸렌비스 (N-아세틸라세타미드) | EPA OPPTS 870.1300 | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 이산화규약 | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 디아모늄 수소화-인산염 | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 디소듐 플루오로포스페이트 | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 산화물 네오디뮴 | 436 | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 칼륨 수소 모노페르설페이트 | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | 예 |
| 사이클로헵타 펜티로스 | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0(2x) / 1(1x) | (예) |
| 바나듐 (III) 산화물 | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0(2x) / 1(1x) | (예) |
| 테트라포타슘 파이로포스페이트 | 403 | n. c. | 0 | 1 | 1 | 아니요 |
| 테트라 브로모프탈릭 무수화물 | 403(유사) | n. c. | 0 | 1 | 1 | 아니요 |
| 세틸피리디늄 염화물 | 403 | 급성 독소. 2 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| N-로로일사르코신 나트륨 염 | 403 | 급성 독소. 2 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| 아연 디메틸디티오 카르바메이트 | 403 | 급성 독소. 2 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| 구리 (II) 수산화물 | 403 | 급성 독소. 2 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| 아연 셀레네 | 436 | 급성 독소. 3 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| 나트륨 메타바나데이트 | 403 | 급성 독소. 4 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| 디바나디움 펜타옥사이드 | 403 | 급성 독소. 4 | 1 | 1 | 1 | 예 |
| 카드뮴 텔루라이드 | 403 | 급성 독소. 4 (n. c.) | 1 | 0 | 0 | 아니요 |
| n. c. = 분류되지 않음; 0 = 무독성; 1 = 독성; CLP = 분류, 라벨링 및 포장 | ||||||
표 1: 생체 내 및 시험관 내 결과 사이에 따른다. 20개 물질 중 10개 물질이 올바르게 음성으로 분류되었고 7가지 물질이 양성으로 올바르게 분류되어 85%(17/20)의 일치를 초래했습니다. 이 표는 Tsoutsoulopoulos 외23에서수정되었습니다. (시험 번호 403: 급성 흡입 독성, 시험 번호 436: 급성 흡입 독성 - 급성 독성 클래스 방법; 급성 독소. 2 = 치명적인 급성 독소. 3 = 독성, 급성 독소. 4 = 유해).
보조 그림 1: 물질 용기의 조립체. 컬렉스 DG (먼지 발생기) 사용자 설명서에서 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 2: 노출 시스템의 에어로졸 가이딩 모듈. A) 에어로졸 가이딩 모듈의 상단 뷰 및 B) 아래쪽 도면. CULTEX RFS (방사형 흐름 시스템) 사용자 설명서에서 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 3: 에어로졸 발생기. A) 에어로졸 발전기 상부와 Elutriator로 구성된 에어로졸 발전기의 회로도 개요. B) 에어로졸 발전기 상부 및 C) Elutriator의 상세 뷰. 컬렉스 DG (먼지 발생기) 사용자 설명서에서 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 4: 에어로졸 발생기 제어 소프트웨어. 컬렉스 DG (먼지 발생기) 사용자 설명서에서 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
많은 비동물 흡입 독성 시험 모델은 흡입 가능한 입자의 급성 흡입 위험에 대한 정보를 얻고 3R 원리25에따라 동물 실험을 감소 및 대체하기 위해 최근에 개발되었다.
세포 배양 모델의 관점에서, 세포의 노출은 침수 된 조건 또는 ALI에서 수행 될 수있다. 침수 된 조건 하에서 세포를 노출하는 것은 물리 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험 물질(12)의독성 특성. 그러나 시험관 내 ALI 흡입 모델은 침수된 노출보다 생물학적 및 생리적 유사성이 높은 인간 노출 상황을 모방하므로 공기 중 입자의 급성 흡입 독성을 분석하는 데 더 적합합니다. 다른 기존 노출 모듈과 관련하여 CULTEX RFS의 중요성은 ALI 조건 하에서 세포의 노출뿐만 아니라 입자의 매우 균일한 분포 및 침착입니다. 선형 에어로졸 가이던스를 이용한 순차적 노광 모델과는 달리, 이러한 노광 방법의 모듈식 설계는 방사형 공급 라인을 가능하게 하여세포(17)에입자의 매우 균일한 침착을 가능하게 한다.
성공적인 노출 실험의 가장 중요한 점은 깨끗한 공기 제어의 안정적이고 합동적인 품질입니다. 특별한주의는 깨끗한 공기 제어의 생존이 시간이 지남에 영향을받지 않고 해당 인큐베이터 컨트롤에 비해 100 %에서 가능한 한 가까이 주의를 기울여야한다. 청정 공기 생존가능성에 관한 중요한 역할을 하는 요인은 적합한 세포 배양 인서트를 선택, 노출 배지의 pH 값 및 깨끗한 공기의 조성이다. 세포 배양 인서트의 관점에서, 좋은 품질과 모공의 높은 밀도가 보장되어야한다. 이것은 세포 배양 삽입 내부의 더 나은 배지 공급 및 더 높은 상대 습도를 보장하고,탈수(26)로부터세포를 보호한다. 측면 벽 개구부가 있는 세포 배양 인서트를 사용하면 노광 매체의 오염을 초래할 수 있는 측면 벽 개구부를 통해 테스트 입자가 누출되지 않도록 특수 인서트 슬리브를 사용해야 합니다. 8보다 높은 pH 값의 변화는 이미 세포에 독성 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 세포생존력(27)의손상을 초래한다. 이는 특히 깨끗한 공기가 5% 미만의CO2 를 함유하거나 노출 매체의 HEPES 농도가 너무 낮은 경우 장시간 입자 증착 시간(예를 들어, 60분)에서 발생하므로 피해야 합니다.
프로토콜의 중요한 문제는 시험 물질의 압박입니다. 시험 물질은 안정된 입자 노출을 가능하게 하기 위하여 물질 콘테이너 내의 분말 케이크에 충분히 압축되어야 합니다. 따라서, 물질은 그들의 프레스 특성에 관한 예비 실험을 특징으로하고 어떤 프레스 플런저에 대한 정보를 얻기 위해, 스크레이핑 블레이드 또는 공급 속도의 종류가 사용되어야한다.
그러나 유압 프레스의 최대 가압은 10kN이며, 이는 유리 실린더의 하중 한계를 동시에 나타내므로 가압 공정의 한계를 나타냅니다. 물질 용기는 10 kN 보다 높은 가압력을 견딜 수 없습니다. 더 높은 가압력은 결정성 물질의 가압을 제공할 수 있으므로 이 프레스의 적용 가능성을 확장하지만 더 강력한 물질 용기가 필요합니다.
더욱이, 주로 공기 중 입자 노출의 조사를 위해 설계된 이 노광 시스템은 에어로졸 생성 방법 및 노광 모듈의 재료에 따라 액체 에어로졸 및 매우 독성이 높고 공격적인 가스의 노출에 적응될 수 있다. 에어로졸 발생기를 멤브레인 분무기와 교환하고 스테인리스 스틸 노출 모듈을 사용하여 고독성 액체에어로졸(24)에세포의 노출을 가능하게 하였다.
또 다른 중요한 문제는 과부하 효과입니다. 세포 생존력은 시험 물질의 독성 특성뿐만 아니라 세포에 증착 된 물질의 양에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 노출 시스템은 인간 폐포 영역의 생리적 조건에 실제로 상당한 유사성을 나타내지만 입자를 제거하기 위한 어떠한 통관 메커니즘도 포함하지 않는다. 따라서 너무 많은 수의 입자로 인해 세포 생존능력이 손상되지 않는 것이 매우 중요합니다.
본 명세서의 프로토콜은 ALI에서 기양된 인간 폐 세포의 균일한 노출을 공기 중 입자에 대해 기술한다. 재현성, 견고성 및 전달성은 급성 흡입 독성에 관한 흡입 가능한 입자의 질적 평가를 위한 시험관 내 스크리닝 방법으로 현재 노출 시스템을 적용할 수 있게 합니다. 시험관 내 대안이 충분히 검증되지 않았기 때문에, 급성 폐 독성은 여전히 동물을 노출시킴으로써 평가되고 있다(예를 들어, 전신 챔버, 코 또는 입 전용 방법). 급성 흡입 독성에 대한 모든 일반적으로 인정되는 OECD 시험 지침(예를 들어, TG 403, TG 433 및 TG 436)은 현재21,22,28,29에서동물 모델을 기반으로 한다. 따라서 향후 한 가지 방향은 급성 흡입 독성에 대한 시험관내 시험 지침으로 받아들여지는 경제협력개발기구(OECD)에 적용하는 것입니다.
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Disclosures
저자 AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT 및 DS는 공개 할 것이 없습니다. 회사 컬렉스 기술 GmbH (이전 컬텍스 연구소 GmbH) 악기를 생산 (예를 들어, CULTEX RFS, CULTEX DG) 이 문서에서 사용되는. NM은 이 연구 기간 동안 컬텍스 연구소 GmbH의 직원이었습니다. OK는 컬텍스 테크놀로지 GmbH(구 컬텍스 연구소 GmbH)의 직원입니다. 장치에 대한 특허 PCT / EP2009 / 007054는 컬트 기술 GmbH 교수 울리히 모어 (이전 컬트 연구소 GmbH)의 설립자에 의해 개최된다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (분데스 장관 퓌르 빌둥 und Forschung, BMBF, 독일 (그랜트 031A581, 하위 프로젝트 A-D))와 독일 연구 재단 (도이치 포슈슈젤샤프트, DFG) 지원되었다, 연구 훈련 그룹 GRK 2338).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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