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Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Published: February 23, 2020 doi: 10.3791/60572
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 5, 3,4, 2, 2, 1, 3,4, 1,2
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Summary

Presentiamo un sistema di esposizione in vitro robusto, trasferibile e predittivo per lo screening e il monitoraggio delle particelle trasportate dall'aria sulla loro citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI).

Abstract

Qui presentiamo un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione omogenea delle cellule polmonari umane coltivate all'ALI a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta), fornendo così un realistico l'esposizione della superficie apicale della regione alveolare umana all'aria. A differenza dei modelli di esposizione sequenziale con guida aerosol lineare, la progettazione modulare del sistema a flusso radiale soddisfa tutti i requisiti per la generazione continua e il trasporto dell'atmosfera di prova alle cellule, una distribuzione omogenea e la deposizione di le particelle e la continua rimozione dell'atmosfera. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l'esposizione delle cellule alle particelle trasportate dall'aria, ma può essere adattato all'esposizione di aerosol liquidi e gas altamente tossici e aggressivi a seconda del metodo di generazione degli aerosol e del materiale dei moduli di esposizione .

Nell'ambito di uno studio di convalida recentemente completato, questo sistema di esposizione si è dimostrato un metodo di screening trasferibile, riproducibile e predittivo per la valutazione qualitativa della citotossicità polmonare acuta delle particelle trasportate dall'aria, potenzialmente riducendo o sostituendo esperimenti sugli animali che normalmente fornirebbeno questa valutazione tossicologica.

Introduction

L'inalazione di particelle atmosferiche tossiche è un problema di salute pubblica, che porta a una moltitudine di rischi per la salute in tutto il mondo e molti milioni di morti ogni anno1,2. Il cambiamento climatico, lo sviluppo industriale in corso e la crescente domanda di energia, prodotti agricoli e di consumo hanno contribuito all'aumento delle malattie polmonari negli ultimi anni3,4,5,6. La conoscenza e la valutazione delle sostanze inalabili per quanto riguarda la loro tossicità acuta per l'inalazione forniscono la base per la valutazione del rischio e la gestione del rischio, ma queste informazioni sono ancora carenti per un'ampia gamma di queste sostanze7,8. Dal 2006, la legislazione chimica dell'UE REACH (Registrazione, Valutazione, Autorizzazione e Restrizione delle sostanze chimiche) richiede che i prodotti già esistenti e di nuova introduzione siano sottoposti a una caratterizzazione tossicologica, compresa la via di inalazione prima di essere immessi sul mercato. Pertanto, REACH si concentra su metodi alternativi e privi di animali, sull'attuazione del principio "3R" (sostituzione, perfezionamento e riduzione degli esperimenti sugli animali) e sull'uso di adeguati modelli in vitro9. Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli diversi e adeguati di test di tossicità per l'inalazione non animale (ad esempio, colture in vitro cellule, modelli polmonari su un chip, fette polmonari tagliate di precisione (PCLS)) al fine di valutare la tossicità acuta dell'inalazione delle particelle trasportate dall'aria5,7,10,11. In termini di modelli di coltura cellulare in vitro, le cellule coltivate possono essere esposte in condizioni sommerse o all'ALI (Figura 1). Tuttavia, la validità degli studi sull'esposizione sommersa è limitata per quanto riguarda la valutazione della tossicità dei composti trasportati dall'aria, in particolare delle particelle. Le tecniche di esposizione sommerse non corrispondono alla situazione umana in vivo; il mezzo di coltura cellulare che copre le cellule può influenzare le proprietà fisico-chimiche e, quindi, le proprietà tossiche di una sostanza di prova12,13. I modelli di inalazione alI in vitro consentono l'esposizione diretta delle cellule alle sostanze di prova senza interferenze del mezzo di coltura cellulare con particelle di prova, imitando così l'esposizione umana con una maggiore somiglianza fisiologica e biologica rispetto alle esposizioni sommerse12,14.

Per i processi normativi come REACH, tuttavia, sono disponibili solo modelli animali nel campo della tossicologia acuta dell'inalazione, in quanto nessun metodo alternativo in vitro è stato sufficientemente convalidato e ufficialmente accettato finora14. A tale scopo, i modelli di prova devono essere convalidati in base ai requisiti del Laboratorio di riferimento dell'Unione europea per le alternative ai test sugli animali (EURL-ECVAM) sulla validità dei test15.

Un ex studio di pre-convalida e uno studio di convalida recentemente completato hanno dimostrato con successo l'area di applicazione del sistema di esposizione CULTEX RFS e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità13. Questo sistema di esposizione è un sistema di esposizione in vitro basato sulle cellule che consente l'esposizione omogenea delle cellule a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta) all'ALI a causa del suo concetto di distribuzione radiale degli aerosol e della conduzione dell'aerosol di prova in un flusso continuo sulle cellule16. Il modulo di base di questo sistema di flusso radiale è costituito dall'adattatore di ingresso, dal modulo di guida dell'aerosol con distribuzione radiale degli aerosol, dal modulo di campionamento e socket e da un modulo di bloccaggio con una ruota a mano (Figura 2). Le particelle generate raggiungono le cellule tramite l'adattatore di ingresso e il modulo di guida dell'aerosol e si depositano sugli inserti di coltura cellulare, che si trovano nelle tre camere di esposizione disposte radialmente del modulo di campionamento. Il modulo di guida dell'aerosol e il modulo di campionamento possono essere riscaldati collegandosi a un bagno d'acqua esterno17.

Nell'ambito di entrambi gli studi, le cellule A549 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti di esposizione. La linea cellulare A549 è una linea cellulare epiteliale immortalata umana che è molto ben caratterizzata ed è stata utilizzata come modello in vitro per le cellule epiteliali alveolar di tipo II in numerosi studi tossicologici. Le cellule sono caratterizzate da corpi lamellari, la produzione di surfactant e una serie di fattori rilevanti per l'infiammazione18. Mostrano anche le proprietà delle cellule epiteliali bronchiali a causa della loro produzione di muco19. Inoltre, possono essere coltivati presso l'ALI. Anche se questa linea cellulare è carente nella costruzione di contatti cellulari, la coltivazione di queste cellule è molto più conveniente, meno costose e i risultati derivati da esse sono indipendenti dal donatore rispetto alle cellule primarie20.

Le cellule A549 sono state seminate in inserti a coltura cellulare a 6 pozzetti (membrana PET, 4,67 cm2, dimensione dei pori 0,4 mm) con una densità di 3,0 x 105 celle per inserto e coltivate per 24 h in condizioni sommerse. Le cellule sono state poi esposte in tre laboratori indipendenti per pulire l'aria e tre diverse dosi di esposizione (25, 50 e 100 g/cm2) di 20 sostanze di prova all'ALI. La dose di esposizione è correlata al tempo di deposizione, con un tasso costante di particelle di 25 g/cm2,50 g/cm2 e 100 g/cm2 sulle cellule dopo 15, 30 o 60 min, rispettivamente. Le particelle depositate, tuttavia, non sono state lavate via dopo la deposizione, ma sono rimaste sulle cellule per 24 ore. I tempi di deposizione delle particelle erano quindi 15, 30 e 60 min, ma l'esposizione delle cellule è durata per 24 h in totale. Il tasso di deposizione delle sostanze di prova è stato determinato negli esperimenti preliminari secondo i metodi precedenti17.

La vitalità cellulare come indicatore di tossicità è stata valutata 24 h dopo la deposizione di particelle utilizzando un saggio di fattibilità cellulare. Particolare attenzione è stata posta sulla qualità dei controlli dell'aria pulita, sull'ottimizzazione e perfezionamento del protocollo di esposizione, sulla riproducibilità intra e interlaboratorio e sulla creazione di un modello di previsione (PM). Sostanze che hanno portato a una diminuzione della vitalità cellulare al di sotto del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) in una delle tre dosi di esposizione è stato considerato un rischio di inalazione acuta. I risultati sono stati poi confrontati con i dati in vivo esistenti (sulla base di almeno uno studio affidabile secondo le linee guida dei test dell'OCSE (TG) 403 o TG 43621,22), che porta ad una concordanza complessiva dell'85%, con una specificità dell'83% e una sensibilità dell'88%23.

Oltre alla misurazione della vitalità cellulare, altri endpoint come il rilascio di citochine, l'esame dell'integrità del lisato cellulare o della membrana tramite l'analisi LDH possono essere valutati, ma non sono stati richiesti per lo studio di convalida. Pertanto, il sistema di esposizione (ad esempio, CULTEX RFS) si è dimostrato un sistema di screening predittivo per la valutazione qualitativa della tossicità acuta dell'inalazione delle particelle airotrasportate testate, rappresentando un promettente metodo alternativo alla sperimentazione animale. Il seguente protocollo è raccomandato per gli esperimenti di esposizione alle particelle trasportate dall'aria utilizzando questo sistema di esposizione.

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Protocol

NOTA: il protocollo di un esperimento di esposizione copre un periodo di tre giorni.

Giorno 1

1. Preparati generali e coltivazione di cellule

NOTA: La linea cellulare epiteliale polmonare umana A549 è stata utilizzata per esperimenti di esposizione. Le cellule devono essere maneggiate in condizioni sterili. Possono essere utilizzate altre linee cellulari adatte per la coltivazione all'ALI.

  1. Preparare il mezzo di crescita (Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e 5 g/mL di gentilcina) e il mezzo di esposizione (DMEM, integrato con 5 g/mL di genticina e una concentrazione finale di HEPES di 100 mM).
  2. Coltura A549 cellule in mezzo di crescita a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata contenente 5% CO2.
  3. Coltivare cellule in coltura cellulare fiaschetta di 75 cm2 (T-75) in 14 mL di mezzo di crescita fino a una confluenza di 80-90% prima di dividersi (ogni 2-3 giorni) e un passaggio di 35.
  4. Calcolare il volume delle sospensioni e il numero richiesto di inserti di coltura cellulare (tre inserti di coltura cellulare come controlli dell'incubatrice e inserti di coltura cellulare per l'esposizione all'aria pulita e delle particelle) e piastre di coltura cellulare.
  5. Prima della provadizzazione e semina delle cellule, aggiungere 2,5 mL di mezzo di crescita temperato a ogni pozzo di una piastra di 6 pozzetti. Posizionare gli inserti di coltura cellulare senza celle con attenzione all'interno dei pozzi e aggiungere 1 mL mezzo di crescita per ogni inserto di coltura cellulare. Incubare le lastre di 6 pozze per almeno 30 min nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).

2. Propsinizzazione delle cellule

  1. Temper fosfato buffered salina (PBS) e mezzo di crescita a 37 gradi centigradi e la trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) soluzione a temperatura ambiente.
  2. Aspirare il mezzo di coltura cellulare dal flacone di coltura cellulare e lavare le cellule con attenzione con 8 mL di PBS preriscaldato.
  3. Rimuovere il PBS, aggiungere 2 mL del trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) soluzione alle cellule e incubare per il massimo 6 min. nell'incubatrice a 37 gradi centigradi. Controllare il processo di distacco al microscopio.
  4. Neutralizzare l'attività della prova aggiungendo un mezzo di crescita preriscaldato da 8 mL, staccare le cellule toccando delicatamente lateralmente sul flacone e risospendere le cellule ripetendo la pipiposizione su e giù.
  5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL. Determinare il numero di cellulare per ulteriori procedure (ad esempio, seeding delle cellule, passaggio di cellule).

3. Determinazione del numero di cellulare

NOTA: la concentrazione cellulare è stata determinata utilizzando un contatore cellulare o camere di conteggio.

  1. Diluire 100 l delle sospensioni di coltura cellulare in una tazza riempita con 10 mL di soluzione isotonica. Inclinare lentamente la coppa senza agitare.
  2. Determinare il numero di cellule/mL vitali e la vitalità cellulare in base ai parametri di misurazione specifici delle cellule A549.

4. Seeding delle cellule su membrane micropororose negli inserti di coltura cellulare

NOTA: Il sistema di esposizione è dotato di adattatori speciali per consentire l'uso di inserti commerciali di diversi fornitori e di diverse dimensioni. Per questi esperimenti di esposizione, sono state utilizzate piastre a 6 pozze e gli inserti di coltura cellulare corrispondenti. Tutte le fasi di lavoro devono essere fatte in condizioni sterili.

  1. Fornire un mezzo di crescita preriscaldato in condizioni sterili di coltura cellulare (flusso laminare).
  2. Preparare un volume sufficientemente elevato della sospensione cellulare con una concentrazione cellulare di 3,0 x 105 cellule/mL.
  3. Dopo aver temperato le piastre per 30 min, aspirare il mezzo all'interno della coltura cellulare inserisce e semi1 mL di cellule A549 con una densità di 3,0 x 105 celle / mL in ogni inserto di coltura cellulare. Distribuire la sospensione cellulare a dondolo delicato.
  4. Incubare gli inserti di coltura cellulare con la sospensione cellulare per 24 h (37 e 5% di CO2).

5. Pressatura delle sostanze di prova

NOTA: le sostanze di prova sono state pressate in torte in polvere utilizzando una pressa idraulica completamente controllabile. Il pacchetto di stampa può applicare una forza massima di 18 kN, che viene visualizzata come la pressione corrente dell'olio (in barra) del pacchetto di stampa. Le condizioni di stampa (pressione prolungata, tempo di pressatura) di sostanze di prova sconosciute devono essere stabilite e caratterizzate nei test preliminari. A seconda delle proprietà di stampa di una sostanza, è possibile utilizzare diversi parametri di pressatura e tipi di stantuffo di pressione.

AVVISO: Indossare dispositivi di protezione quando si pressano sostanze tossiche o pericolose.

  1. Impostare il tempo di pressione tramite il controllo del tempo sul lato anteriore della pressa.
  2. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa alla valvola ad aria compressa. Impostare la pressione dell'aria compressa a circa 2 barre (indicata da un misuratore di pressione sul lato anteriore) utilizzando il regolatore di pressione sul lato anteriore della pressa o sulla valvola ad aria compressa dell'alimentazione dell'aria compressa. Estrarre il cassetto, premere il pulsante Press e leggere la pressione sul commutatore di pressione digitale.
    1. Leggere solo la pressione al regolatore di pressione se la pressione è troppo alta o troppo bassa.
  3. Assemblare il contenitore di sostanze e assicurarsi che il cilindro di vetro sia centrato correttamente (Figura supplementare 1). Riempire il contenitore di sostanze con una piccola quantità della sostanza di prova. Inserire lo stantuffo nel contenitore della sostanza e girarlo leggermente avanti e indietro per distribuire uniformemente la polvere nel contenitore.
  4. Posizionare il contenitore della sostanza con lo stantuffo nel cassetto e premere il pulsante Press. Il pistone idraulico della pressa si sposta sullo stantuffo ed esercita una pressione sulla sostanza di prova per il tempo di pressatura impostato. Aprire il cassetto e rimuovere lo stantuffo.
  5. Ripetere i passaggi 5.3 e 5.4 fino a quando il contenitore della sostanza è pieno almeno a metà.
  6. Dopo aver completato il lavoro di pressatura, rimuovere il contenitore di sostanze dal cassetto e capovolgerlo per rimuovere le particelle sciolte e depositate.
  7. Se il contenitore della sostanza non è necessario nello stesso giorno, chiudere il contenitore della sostanza con parafilm per evitare che la sostanza di prova si secchi o assorba l'umidità.

Giorno 2

6. Assemblaggio del sistema di esposizione e collegamento delle apparecchiature periferiche

NOTA: una visualizzazione più dettagliata è disponibile nella figura 3, Figura supplementare 2 e Figura supplementare 3. Assemblare entrambi i moduli e il generatore di aerosol secondo le istruzioni del produttore.

  1. Posizionare il sistema di esposizione su una superficie solida e uniforme, con l'approvvigionamento idrico rivolto in avanti. Collegare i controller di flusso di massa con il generatore di aerosol e una bottiglia a tre collo collegata al modulo per l'esposizione all'aria pulita.
  2. Collegare il regolatore di flusso e la pompa a vuoto. Collegare i tubi dai controller di flusso con il connettore a tubo sugli accessori del modulo di guida aerosol. Collegare i tubi sull'altro lato dei controller di flusso con la pompa a vuoto. Assicurarsi che il flusso stia passando dal modulo attraverso i controller di flusso alla pompa a vuoto.
  3. Collegare il bagno d'acqua con l'approvvigionamento di acqua di riscaldamento. L'approvvigionamento idrico va dal bagno d'acqua all'ingresso dell'acqua sul modulo di guida dell'aerosol. Collegare la presa d'acqua del modulo di guida dell'aerosol con l'ingresso dell'acqua del modulo di campionamento. Chiudere il cerchio con una connessione dalla presa d'acqua del modulo di campionamento al bagno d'acqua.
  4. Posizionare il generatore di aerosol, compreso l'elutriator vicino al modulo di esposizione, e collegare le linee in eccesso dell'elutriatore e del modulo di esposizione e aria pulita con grandi micro filtri, e l'aspirazione delle camere di esposizione con piccoli micro filtri (ad esempio, filtri usa e getta). L'elutriator funge da serbatoio per l'atmosfera di particolato generata e conserva particelle più grandi di circa 7 m, mentre le particelle più piccole vengono trasportate nel modulo di esposizione.
  5. Collegare il computer utilizzato per controllare la generazione di aerosol alla porta USB del piano generatore aerosol tramite un cavo USB e l'alimentazione alla porta di alimentazione. Collegare la presa di alimentazione CA dell'unità di alimentazione a una presa (220-240 V).
  6. Collegare i tubi per l'alimentazione media e la rimozione con due pompe. Invece di utilizzare una pompa per l'alimentazione media, il mezzo può anche essere riempito manualmente.

7. Preparazione per l'esposizione di aria pulita e particelle

  1. Accendere la pompa a vuoto, i controllori di flusso e il bagno d'acqua (37 gradi centigradi) per un periodo di riscaldamento di almeno 30 min.
  2. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa. Impostare i controller di flusso di massa a 8 L/min per la linea di alimentazione al generatore di aerosol e a 3 L/min per la linea di alimentazione alla bottiglia a tre colli. Chiudere le schede dei controller di flusso di massa.
    NOTA: Questi valori possono variare a seconda delle caratteristiche della sostanza di prova.
  3. Regolare i regolatori di flusso tramite il computer per regolare il flusso del modulo (1,5 L/min) e l'aspirazione della camera (30 mL/min).

8. Test di perdita del sistema di flusso radiale

NOTA: il controllo delle perdite deve essere eseguito sotto vuoto e per entrambi i moduli (modulo di esposizione e aria pulita) per garantire che il modulo sia stato riassemblato correttamente.

  1. Rimuovere l'adattatore di ingresso e il riflettore a condensa dal modulo di guida aerosol. Chiudere i tre fori di alimentazione dell'aerosol nel modulo di guida dell'aerosol con spine e le connessioni medie di alimentazione al modulo di campionamento con lembi fittizi.
  2. Collegare le linee a vuoto senza il filtro con il connettore a tubo del modulo di guida aerosol. Chiudere il modulo utilizzando la rotellina della mano e misurare il valore dei controller di flusso. I valori dovrebbero diminuire alcuni minuti dopo la chiusura al di sotto di 5 mL/min.
  3. Dopo il controllo di impermeabilità, rimuovere tutte le spine e le mbli fittizi, inserire l'adattatore di ingresso e il riflettore a condensa nel modulo di guida dell'aerosol e collegare i tubi per l'alimentazione media e la rimozione.

9. Generazione di aerosol

  1. Avviare il computer e il software (Supplementary Figura 4). Avviare il software generatore di aerosol facendo doppio clic sul pulsante di avvio del generatore di aerosol sul desktop del computer. Viene visualizzata una finestra di messaggio in cui viene chiesto se le impostazioni devono essere ripristinate o meno. Fare clic su Sì se il software viene avviato per la prima volta quel giorno. Impostare i valori per Posizione diapositiva e Posizione raccoglitore sui valori predefiniti. Fare clic su No per mantenere i valori per Posizione diapositiva e Posizione raccoglitore oppure la diapositiva non si trova nella posizione iniziale.
  2. Avvitare un raschietto di sostanze nel tubo, che si trova nell'apertura centrale del piano generatore di aerosol.
    NOTA: a seconda delle caratteristiche della pressa, è possibile utilizzare tipi distinti di raschiatore di sostanze.
  3. Utilizzare il pulsante Homing Mode se il raschietto di sostanza non si trova nella posizione più bassa.
  4. Posizionare il contenitore di sostanze con il materiale di prova premuto a testa in giù sopra il raschietto della sostanza. Assicurarsi che il vetro del contenitore di sostanze sia rivolto verso la parte anteriore. Assicurarsi che i due fori nel contenitore della sostanza si adattino ai due perni del piano del generatore di aerosol. Posizionare la piastra di bloccaggio nello slot sopra il contenitore della sostanza e stringere la vite nera.
  5. Modificare i valori per Avanzamento (da 0,24 a 20 mm/h) e Rotazione (da 1 a 800 giri/h) con le impostazioni desiderate. La concentrazione di particelle può essere modificata aumentando o diminuendo il valore di alimentazione o la velocità di flusso del gas del vettore.
  6. Utilizzare le frecce verso il basso per spingere verso il basso il vetrino con il contenitore di sostanza fino a quando il raschietto di sostanza è vicino alla sostanza premuta.
  7. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa al generatore di aerosol con un tocco del controller di flusso di massa e avviare la generazione di aerosol facendo clic sul pulsante Start. Impostare la velocità di avanzamento su 15-20 mm/h per evitare lunghi tempi di attesa.
  8. Controllare la corretta generazione di particelle osservando la nube di polvere fine con una piccola torcia elettrica (posizionata dal basso dietro il tubo di vetro dell'Elutriator). Modificare il valore di Feed back alle impostazioni desiderate quando il primo vapore aerosol raggiunge continuamente l'Elutriator e fare clic sul pulsante Stop.

10. Esperimenti di esposizione

  1. Avviare l'alimentazione media con un supporto di esposizione preriscaldato e riempire i moduli di campionamento fino a quando i downpipes sono coperti mentre il modulo è aperto. Utilizzare la pompa media o riempire il mezzo manualmente (25 mL per singola camera di esposizione).
  2. Inserire inserti di coltura di celle cieche (inserisce senza celle) nel modulo di esposizione. Pompare il mezzo di esposizione verso il basso fino a quando i decanari sono coperti di mezzo e il lato inferiore degli inserti sono a contatto con il mezzo.
  3. Avviare il generatore di aerosol, chiudere il modulo di esposizione e collegare il modulo di esposizione alla presa del modulo di esposizione del generatore di aerosol. Dare al generatore di aerosol un tempo di piombo di almeno 20-30 min prima dell'inizio delle esposizioni al fine di consentire una generazione stabile di particelle.
  4. Preparare le piastre post-incubazione per i controlli dell'incubatrice e gli inserti della coltura cellulare esposta durante il lead time. Aggiungere 1,5 mL di mezzo di crescita per pozzo e incubare le piastre nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).
  5. Dopo il lead time, sigillare la presa del modulo di esposizione dell'Elutriator con un tappo di gomma e rimuovere gli inserti ciechi. Riempire il mezzo di esposizione (utilizzando la pompa o manualmente) fino a quando i decanatra sono coperti di mezzo. Ora, aprire anche l'alimentazione di aria compressa al modulo di aria pulita con il rubinetto del regolatore di flusso di massa (3 L/min)
  6. Rimuovere gli inserti di coltura cellulare dalle piastre 6-well con l'aiuto di una pinzetta. Versare il mezzo di crescita con attenzione dagli inserti di coltura cellulare rovesciando gli inserti e aspirare e scartare il liquido residuo utilizzando una pipetta. Posizionare gli inserti nelle camere di esposizione di entrambi i moduli, il modulo di esposizione e aria pulita.
  7. Chiudere i moduli e avviare contemporaneamente gli esperimenti di esposizione collegando il modulo di esposizione all'uscita del modulo di esposizione del generatore di aerosol e del modulo aria pulita alla rete di gas del vettore.
    NOTA:La concentrazione di particelle può essere modificata aumentando/diminuendo il valore di alimentazione, la portata del gas del vettore o il tempo di esposizione.
  8. Scollegare l'esposizione e i moduli d'aria pulita dopo il completamento dell'esperimento e sigillare la presa del modulo di esposizione.
  9. Arrestare l'alimentazione dell'aria compressa e il generatore di aerosol facendo clic sul pulsante Stop.
  10. Aprire il modulo di esposizione e aria pulita e trasferire gli inserti di coltura cellulare alle piastre post-incubazione preparate utilizzando una pinzetta. Incubare le lastre di 6 pozze per 24 h (37 gradi centigradi, 5% CO2)all'ALI.
    NOTA: ripetere i passaggi 10.5 -10.10 se sono previsti ulteriori esperimenti di esposizione.
  11. Sollevare gli inserti di coltura cellulare, che vengono utilizzati come controlli dell'incubatrice all'ALI nelle stesse condizioni degli inserti della coltura cellulare esposta e incubarli per 24 h (37 oC, 5% CO2) all'ALI.
  12. Utilizzare il pulsante Homing Mode per rimuovere il contenitore di sostanze. Chiudere il software generatore di aerosol facendo clic sulla X nell'angolo in alto a destra e spegnere il computer.
  13. Dopo il completamento di tutti gli esperimenti di esposizione, pulire il generatore di aerosol ed entrambi i moduli di esposizione. Chiudere il contenitore di sostanze con parafilm se la sostanza di prova verrà ulteriormente utilizzata nei prossimi giorni.

Giorno 3

11. Vitalità cellulare

NOTA: La fattibilità cellulare è stata determinata 24 h dopo la deposizione delle particelle misurando l'attività mitocondriale utilizzando il saggio WST-1. Il saggio è stato eseguito secondo il protocollo del produttore. La vitalità cellulare può essere determinata anche utilizzando altri test di fattibilità cellulare (ad esempio, XTT).

  1. Mezzo di crescita temperare a 37 gradi centigradi e scongelare la soluzione WST-1 protetta dalla luce. Preparare un numero adeguato di nuove piastre a 6 pozzetti con un mezzo di crescita di 2,5 ml per pozzo e incubare le piastre nell'incubatrice.
  2. Preparare la diluizione wsT-1 diluindo una quantità sufficiente di WST-1 1:7 nel mezzo di crescita
  3. Inserire gli inserti di coltura cellulare 24 h dopo l'esposizione nelle nuove piastre a 6 pozze preparate. Aggiungere 1 mL della soluzione WST-1 appena preparata a ogni inserto di coltura cellulare. Rocciare le piastre con attenzione al fine di distribuire la soluzione in modo omogeneo sulle cellule. Incubare le lastre a 6 pozze con la coltura cellulare inserti per 1 h (37 gradi centigradi, 5% CO2).
  4. Trasferire 100 l del supernatante in triplicati da ogni 6-po a una piastra di 96 pozze. Misurare l'assorbimento a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 650 nm utilizzando un lettore di microplacino.

12. Statistiche

  1. Normalizzare la vitalità cellulare dei singoli controlli dell'incubatrice al 100%.
  2. Esprimere la vitalità delle cellule esposte in relazione ai controlli individuali dell'incubatrice. La citotossicità delle sostanze di prova è stata confrontata con i rispettivi controlli dell'incubatrice e utilizzata come indicatore di tossicità.

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Representative Results

Il CULTEX RFS è un sistema modulare di esposizione in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione diretta e omogenea delle cellule all'ALI. Nell'ambito di un precedente studio di pre-convalida, l'applicabilità generale di questo sistema di esposizione e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità sono state dimostrate con successo. In un recente progetto di ricerca finanziato dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca, il sistema di esposizione è stato convalidato con successo e stabilito come modello di previsione (PM) per i rischi di inalazione acuta dei composti testati. Poiché la qualità dei controlli dell'aria pulita si è rivelata un parametro critico durante lo studio di pre-convalida, diverse ottimizzazioni di protocollo e metodi (ad esempio, il cambiamento degli inserti di coltura cellulare, la stabilizzazione del pH del mezzo di esposizione aumentando la concentrazione di HEPES a 100 mM) sono state implementate all'inizio dello studio di convalida, portando a risultati altamente stabili e riproducibili e a un sostanziale miglioramento dei dati di fattibilità dell'aria pulita in tuttietre i laboratori . Le cellule A549 sono state poi esposte all'ALI a tre diverse dosi di esposizione (25, 50 e 100 g/cm2) di 20 sostanze di prova preselezionate e codificate nei tre laboratori indipendenti, e la citotossicità (utilizzata come indicatore di tossicità) è stata confrontata con i rispettivi controlli dell'incubazione. Tredici sostanze codificate sono state quindi testate in triplicati, sette sostanze codificate come singoli esperimenti. Si è ritenuto che le sostanze di prova esercitassero un rischio di inalazione acuta quando la vitalità cellulare è diminuita al di sotto del 50% (PM 50%) o il 75% (PM 75%).

Come mostrato come mostrato nella Figura 5, l'esposizione delle cellule A549 a diverse sostanze di prova non ha mostrato alcuna tossicità media o forte. Poiché tutti gli esperimenti sono stati condotti in modo indipendente in tre laboratori, sono stati analizzati dati sulla riproducibilità all'interno e tra i laboratori e sulla predittività del sistema di esposizione. A seconda del PM applicato (PM 50% o PM 75%), l'interno del laboratorio e la riproducibilità tra laboratorio variavano dal 90 al 100%, dimostrando la robustezza e la trasferibilità di questo metodo. Poiché tutte le sostanze testate avevano pertinenti dati di riferimento in vivo (basati su almeno uno studio affidabile secondo l'OCSE TG 403 o TG 436 utilizzando un protocollo LC50 tradizionale e un protocollo di tempo di concentrazione x (C x t), il confronto dei dati in vivo e in vitro hanno rivelato una concordanza complessiva dell'85% (17/20) con una specificità dell'83% (10/12) e una sensibilità dell'85% (7/8)(tabella 1). Solo due sostanze sono state classificate come falsamente positive e una falsamente negativa.

In sintesi, i risultati dello studio di convalida presentano un metodo di screening trasferibile, riproducibile e predittivo per la valutazione qualitativa della citotossicità polmonare acuta delle particelle trasportate dall'aria selezionate.

Figure 1
Figura 1: Esposizione di cellule all'ALI o in condizioni sommerse. Le cellule A549 possono essere esposte con una sostanza di prova (frecce blu e punti) all'ALI (a sinistra) attraverso un'insezione del sistema di esposizione o con la sostanza di prova diluita nel mezzo di esposizione (punti blu) creando condizioni sommerse (a destra). Le linee tratteggiate rosse rappresentano i livelli di riempimento del mezzo di esposizione (rosso brillante) nella rispettiva configurazione sperimentale. Questa cifra è stata modificata da Tsoutsoulopoulos etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Il modulo di esposizione. Panoramica schematica del modulo di base del sistema di flusso radiale costituito dall'adattatore di ingresso, dal modulo di guida dell'aerosol, dal modulo di campionamento e presa e da un modulo di bloccaggio con ruota a mano. Questa cifra è stata modificata da Aufderheide et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Panoramica del sistema di esposizione. I componenti sono i due moduli di esposizione per l'esposizione all'aria pulita e alle particelle, il generatore di aerosol, tra cui l'elutriator e l'unità di controllo corrispondente, e le pompe medie. Questa cifra è stata modificata da Aufderheide et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Dati di fattibilità dell'aria pulita dopo l'ottimizzazione del metodo di prova. L'esposizione delle cellule all'aria pulita non ha portato a nessuna diminuzione della vitalità cellulare nel tempo, portando ad un miglioramento sostanziale dei dati di vitalità dell'aria pulita rispetto allo studio di pre-convalida. Tutti i controlli dell'aria pulita sono stati raggruppati per ogni laboratorio (Lab 1-3) e il tempo di esposizione (n 46 per laboratorio e punto nel tempo). I dati vengono visualizzati come boxplot con una linea mediana e l'intervallo indicato dai baffi. Questa cifra è stata modificata da Tsoutsoulopoulos et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Esposizione di cellule A549 a diverse sostanze di prova. (A) L'esposizione delle cellule A549 al carbide di tungsteno(IV) non ha mostrato alcuna diminuzione della vitalità cellulare per le tre diverse dosi di esposizione e sembrava non tossica (n 3 per dose di laboratorio e di esposizione). (B) L'esposizione delle cellule all'idrato tetrabromofrelico ha portato a tutti i laboratori in una tossicità moderata che presenta una buona curva di risposta alla dose (n - 1 per dose di laboratorio e dose di esposizione). (C) Lo zinco dimentildithiocarbamate ha mostrato una forte tossicità, che ha portato a una diminuzione della vitalità cellulare già dopo una dose depositata di 25 g/cm2 (n 3 per dose di laboratorio ed esposizione). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. Questa cifra è stata modificata da Tsoutsoulopoulos et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati di riferimento in vivo Risultati in vitro
Sostanza OCSE TG Regolamento CLP Tossicità PM50% PM75% Conforme in vivo / in vitro
Tungsteno (IV) carburatore 403 n. c 0 0 0 Sì
Tungsteno(IV) carburatore nano - n. c. 0 0 0 Sì
N,N'-etilenebis (N-acetylacetamide) OPPTS EPA 870.1300 n. c. 0 0 0 Sì
Biossido di silicio 403 n. c. 0 0 0 Sì
Diammonium idrogenato-fosfato 403 n. c. 0 0 0 Sì
Fluorofosfato di disodio 403 n. c. 0 0 0 Sì
Ossido di Neodymium 436 n. c. 0 0 0 Sì
Monosolato a idrogeno di potassio 403 n. c. 0 0 0 Sì
Cicloepta-pentylose 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Sì)
Vanadium (III) ossido 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Sì)
Tetrapotassio pirofafato 403 n. c. 0 1 1 No
Aidrato tetra-bromophthalic 403 (simile) n. c. 0 1 1 No
Cloruro di cetilpyridinium 403 Tossa acuta. 2 1 1 1 Sì
N-Lauroylsarcosine sale di sodio 403 Tossa acuta. 2 1 1 1 Sì
Dimethyldithio-carbamate 403 Tossa acuta. 2 1 1 1 Sì
Idrossidio di rame (II) 403 Tossa acuta. 2 1 1 1 Sì
Selenite di zinco 436 Tossa acuta. 3 1 1 1 Sì
Metavanadate di sodio 403 Tossa acuta. 4 1 1 1 Sì
Pentaossido di divanadium 403 Tossa acuta. 4 1 1 1 Sì
Telluride Cadmium 403 Tossa acuta. 4 (n. c.) 1 0 0 No
n. c. - non classificato; 0 - non tossico; 1 - tossico; CLP : classificazione, etichettatura e imballaggio

Tabella 1: Conformità tra risultati in vivo e in vitro. Su 20 sostanze, 10 sostanze sono state classificate come correttamente negative e sette sostanze correttamente positive, portando ad una concordanza dell'85% (17/20). Questa tabella è stata modificata da Tsoutsoulopoulos et al.23. (Test n. 403: Tossicità acuta per inalazione, Test n. 436: Tossicità per inalazione acuta - Metodo di classe tossica acuta; Tossa acuta. 2 - fatale, Tossico acuto. 3 - tossico, tossico tossa. 4 - dannoso).

Supplementary Figure 1
Supplementare Figura 1: Assemblaggio del contenitore di sostanze. Immagine presa dal manuale dell'utente di CULTEX DG (Dust Generator). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 2
Figura supplementare Figura 2: Modulo di guida dell'aerosol del sistema di esposizione. A) Vista dall'alto e B) vista inferiore del modulo di guida aerosol. Immagine tratta dal manuale utente CULTEX RFS (Radial Flow System). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 3
Figura supplementare 3: Il generatore di aerosol. A) Panoramica schematica del generatore di aerosol, costituito dal piano generatore di aerosol e dall'Elutriator. Vista dettagliata di B) la parte superiore del generatore di aerosol e C) l'Elutriator. Immagine presa dal manuale dell'utente di CULTEX DG (Dust Generator). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 4
Figura 4 supplementare: Il software di controllo del generatore di aerosol. Immagine presa dal manuale dell'utente di CULTEX DG (Dust Generator). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli di test di tossicità per l'inalazione non animale al fine di ottenere informazioni sul rischio di inalazione acuta delle particelle inalabili e per ridurre e sostituire gli esperimenti sugli animali secondo il principio 3R25.

In termini di modelli di coltura cellulare, l'esposizione delle cellule può essere effettuata in condizioni sommerse o all'ALI. Esporre le cellule in condizioni sommerse può influenzare le proprietà fisico-chimiche e quindi le proprietà tossiche di una sostanza di prova12. I modelli di inalazione IN vitro ALI, tuttavia, imitano la situazione di esposizione umana con una maggiore somiglianza biologica e fisiologica rispetto all'esposizione sommersa e sono quindi più adatti per analizzare la tossicità acuta dell'inalazione delle particelle trasportate dall'aria. L'importanza della RFS CULTEX rispetto ad altri moduli di esposizione esistenti non è solo l'esposizione delle cellule in condizioni ALI, ma anche la distribuzione e deposizione molto omogenee delle particelle. A differenza dei modelli di esposizione sequenziale con guida aerosol lineare, la progettazione modulare di questo metodo di esposizione consente una linea di alimentazione radiale che conduce ad una deposizione molto omogenea di particelle sulle celle17.

Il punto più importante per il successo degli esperimenti di esposizione è la qualità stabile e congruente dei controlli dell'aria pulita. Occorre prestare particolare attenzione al fatto che la fattibilità dei controlli dell'aria pulita non venga influenzata nel tempo e il più vicino possibile al 100% rispetto ai corrispondenti controlli dell'incubatrice. I fattori che svolgono un ruolo importante per quanto riguarda la vitalità dell'aria pulita sono la scelta di inserti adatti per la coltura cellulare, il valore del pH del mezzo di esposizione e la composizione dell'aria pulita. In termini di coltura cellulare, deve essere garantita una buona qualità e un'alta densità di pori. Ciò garantisce un migliore approvvigionamento medio e una maggiore umidità relativa all'interno degli inserti di coltura cellulare, proteggendo le cellule dalla disidratazione26. Utilizzando inserti a coltura cellulare con aperture a parete laterale, è necessario utilizzare appositi manicotti per evitare perdite di particelle di prova attraverso le aperture della parete laterale che potrebbero portare a una possibile contaminazione del mezzo di esposizione. Uno spostamento del valore del pH superiore a 8 può già avere un effetto tossico sulle cellule e quindi portare a una compromissione della vitalità cellulare27. Ciò si verifica soprattutto nei tempi prolungati di deposizione delle particelle (ad esempio, 60 min) se l'aria pulita contiene meno del 5% di CO2 o la concentrazione HEPES del mezzo di esposizione è troppo bassa che deve essere evitata.

Una questione critica del protocollo è la pressatura delle sostanze di prova. Le sostanze di prova devono essere sufficientemente compresse in una torta di polvere all'interno del contenitore di sostanze al fine di consentire un'esposizione stabile alle particelle. Pertanto, le sostanze devono essere caratterizzate in esperimenti preliminari riguardanti le loro proprietà di stampa e per ottenere informazioni su quale stantuffo stampa, tipo di lama di raschiatura o tassi di alimentazione devono essere utilizzati.

La pressione massima della pressa idraulica, tuttavia, è di 10 kN, che rappresenta allo stesso tempo il limite di carico per il cilindro di vetro e quindi una limitazione del processo di pressatura. Il contenitore di sostanze non può sopportare forze di pressione più elevate di 10 kN. Una maggiore pressione potrebbe offrire la pressatura di sostanze cristalline e, di conseguenza, estendere l'applicabilità di questa pressa, ma richiederebbe contenitori di sostanze più robusti.

Inoltre, questo sistema di esposizione, progettato principalmente per lo studio delle esposizioni di particelle trasportate dall'aria, può essere adattato all'esposizione di aerosol liquidi e gas altamente tossici e aggressivi a seconda del metodo di generazione degli aerosol e del materiale dei moduli di esposizione. Lo scambio del generatore di aerosol con un nebulizzatore a membrana e l'utilizzo di un modulo di esposizione in acciaio inossidabile ha permesso l'esposizione delle cellule a aerosol liquidi altamente tossici24.

Un altro problema critico è l'effetto di sovraccarico. La vitalità cellulare può essere influenzata non solo dalle proprietà tossicologiche di una sostanza di prova, ma anche dalla quantità di una sostanza depositata sulle cellule. Questo sistema di esposizione mostra infatti una sostanziale somiglianza con le condizioni fisiologiche nella regione alveolare umana, ma non contiene alcun meccanismo di clearance per la rimozione delle particelle. È quindi molto importante che la vitalità cellulare non sia compromessa a causa di un numero troppo elevato di particelle.

Il protocollo qui descritto descrive l'esposizione omogenea delle cellule polmonari umane coltivate all'ALI alle particelle trasportate dall'aria. La riproducibilità, la sua robustezza e trasferibilità rendono l'attuale sistema di esposizione applicabile come metodo di screening in vitro per la valutazione qualitativa delle particelle inalabili per quanto riguarda la loro tossicità acuta per inalazione. Poiché finora non sono stati sufficientemente convalidati metodi alternativi in vitro, la tossicità polmonare acuta è ancora in fase di valutazione esponendo gli animali (ad esempio, camere per tutto il corpo, naso o metodi solo bocca). Tutte le linee guida di test dell'OCSE comunemente accettate per la tossicità acuta dell'inalazione (ad esempio, TG 403, TG 433 e TG 436) si basano su modelli animali attualmente21,22,28,29. Una direzione futura sarà quindi quella di chiedere all'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) l'accettazione come linea guida in vitro per l'acuta tossicità dell'inalazione.

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Disclosures

Gli autori AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT e DS non hanno nulla da rivelare. L'azienda Cultex Technology GmbH (precedentemente Cultex Laboratories GmbH) produce strumenti (ad esempio, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilizzati in questo articolo. NM è stato un dipendente di Cultex Laboratories GmbH durante questo studio. OK è un dipendente di Cultex Technology GmbH (ex Cultex Laboratories GmbH). Il brevetto PCT/EP2009/007054 per il dispositivo è tenuto dal fondatore della Cultex Technology GmbH Prof.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Germania (Grant 031A581, sub-progetto A-D)) e dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Ricerca Training Group GRK 2338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
A549 ATCC CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM Biochrom, Berlin, Germany FG 0415 used as growth medium
DMEM Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany 22320 used as exposure medium
FBS superior Biochrom, Berlin, Germany S 0615
Gentamycin (10mg/mL) Biochrom, Berlin, Germany A 2710
HEPES 1M Th. Geyer, Renningen, Germany L 0180
PBS Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) Biochrom, Berlin, Germany L 2143
Cell culture material
CASY Cups Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651794
Cell culture plates Corning, Wiesbaden, Germany 3516 6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts Corning, Wiesbaden, Germany 3450 24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021) Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany 2290152
WST-1 Abcam, Cambridge, United Kingdom ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large) Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany LP-050 Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small) Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany 9933-05-DQ Balston disposable filter
Medium pump Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump KNF, Freiburg, Germany N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min TrigasFI GmbH Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline Staredition RE 104

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References

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

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Medicina Numero 156 Tossicità polmonare acuta in vitro sistema di esposizione interfaccia aria-liquido convalida citotossicità particelle trasportate dall'aria
Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida
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Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K., Möhle, N., Breit, A., Hoffmann, S., Krischenowski, O., Mückter, H., Gudermann, T., Thiermann, H., Aufderheide, M., Steinritz, D. Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface. J. Vis. Exp. (156), e60572, doi:10.3791/60572 (2020).

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