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Cancer Research

ऐरेगए पुस्तकालयों की मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और ड्यूल-लूसिफ़ेरेज़-आधारित रिपोर्टर का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर नियामकों की पहचान

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए, हमने दोहरी-लुसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख का उपयोग करके सरणी लेंटिवायरल या रेट्रोवायरल आरएनएआई पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया। यह दृष्टिकोण एक ही प्रयोग में सैकड़ों उम्मीदवारों को स्क्रीन करने का एक त्वरित और अपेक्षाकृत सस्ता तरीका प्रदान करता है।

Abstract

ट्रांसक्रिप्शन कारक कई लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को बदल सकते हैं जो विभिन्न प्रकार की डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं जो उन्हें कैंसर विरोधी उपचारों के लिए अच्छे लक्ष्य बनाते हैं। हालांकि, सीधे ट्रांसक्रिप्शन कारकों को लक्षित करना अक्सर मुश्किल होता है और यदि एक या अधिक वयस्क ऊतकों में प्रतिलेखन कारक आवश्यक है तो प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा हो सकता है। अपस्ट्रीम नियामकों की पहचान करना जो कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों को सक्रिय करते हैं, एक अधिक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है, खासकर यदि ये प्रोटीन दवा के लिए आसान हैं। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए सरणी मध्यम पैमाने पर लेंटिवायरल पुस्तकालयों और दोहरी-लूसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शनरिपोर्टर परख को संयोजित करने के लिए किया जा सकता है। हमारा दृष्टिकोण एक ही प्रयोग में सैकड़ों जीन ों का परीक्षण करने का एक त्वरित, आसान और सस्ता तरीका प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक सरणी लेंटिवायरल आरएनएआई लाइब्रेरी की एक स्क्रीन का प्रदर्शन किया जिसमें यस-संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) के कई नियामक और पीडीजेड-बाइंडिंग आकृति (TAZ), दो ट्रांसक्रिप्शनियल सह-सक्रियक हैं जो हिप्पो मार्ग के डाउनस्ट्रीम प्रभावक हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण को वस्तुतः किसी भी प्रतिलेखन कारक या सह-कारक के नियामकों के लिए स्क्रीन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और इसका उपयोग CRISPR/CAS9, cDNA, या ORF पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए भी किया जा सकता है ।

Introduction

इस परख का उद्देश्य वायरल पुस्तकालयों का उपयोग करने के लिए एक अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ती तरीके से प्रतिलेखन कारकों के नियामकों की पहचान है । एबररेंट ट्रांसक्रिप्शनगतिविधि कैंसर और मेटाटैसिस1,,2,,3,,4,,5,,6से जुड़ी है, इसलिए कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों को लक्षित करना एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण है। हालांकि, प्रतिलेखन कारकों को अक्सर फार्माकोलॉजिकल रूप से7 को लक्षित करना मुश्किल होता है और वयस्क ऊतकों8,,9,,10में सामान्य सेलुलर कार्य के लिए कई की आवश्यकता होती है। कैंसर से जुड़े रास्तों को लक्षित करना जो रोग को चलाने के लिए प्रतिलेखन कारकों को सक्रिय करते हैं, कम गंभीर दुष्प्रभाव ों की क्षमता के साथ अधिक व्यवहार्य दृष्टिकोण है। सरणी लेंटिवायरल और रेट्रोवायरल आरएनएआई, CRISPR/CAS9, cDNA, या ORF पुस्तकालयों की वाणिज्यिक उपलब्धता शोधकर्ताओं को एक ही प्रयोग में कई जीन के महत्व का परीक्षण करने की अनुमति देता है । हालांकि, बदल प्रतिलेखन गतिविधि के लिए एक विश्वसनीय readout की आवश्यकता है ।

यहां, हम कैंसर कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों को विनियमित करने वाले प्रोटीन की पहचान करने के लिए दोहरी-लुसिफ़ेरेज़-आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख और सरणी लेंटिवायरल पुस्तकालयों के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस परख में, कैंसर से जुड़े जीन को लक्षित करने वाले shRNAs को मसूर के माध्यम से स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं को वितरित किया जाता है और कोशिकाओं को प्यूरोमाइसिन का उपयोग करके स्थिर एकीकरण के लिए चुना जाता है। कोशिकाओं को अगले एक रिपोर्टर निर्माण है कि अनुक्रिप्शन कारक है कि जांच की जा रही है और एक नियंत्रण निर्माण है कि एक संविलियन सक्रिय प्रमोटर है कि प्रतिलेखन कारक के लिए उत्तरदायी नहीं है की जांच की जा रही से रेनिला लूसिफ़ेरेज व्यक्त करने के लिए विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित जुगनू लूसिफ़ेरेज व्यक्त करता है के साथ ट्रांसफ्रेंस व्यक्त कर रहे हैं । हम YAP और TAZ के नियामकों के लिए एक सबूत की अवधारणा स्क्रीन के साथ इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन, हिप्पो मार्ग8,,10,,11के महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम प्रभावकों । वाईएपी और ताज़ की असामान्य गतिविधि मेटास्टैटिक झरना11 के कई चरणों को बढ़ावा देती है और कई कैंसर11,12,13में देखी जाती है ।13 हालांकि, कैसे YAP और TAZ कुछ कैंसर कोशिकाओं में aberrantly सक्रिय हो अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है । YAP और TAZ डीएनए बांध नहीं है, लेकिन इसके बजाय अंय प्रतिलेखन कारकों द्वारा प्रमोटरों के लिए भर्ती कर रहे हैं । टी डोमेन (टीईडी) प्रतिलेखन कारकों के परिवार के सदस्य वाईएपी और TAZ के लिए प्रमुख बाध्यकारी साझेदार हैं, और अधिकांश वाईएपी और TAZ-निर्भर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमारे रिपोर्टर ने वाईएपी/TAZ-TEAD-उत्तरदायी प्रमोटर से जुगनू लूसिफ़ेरेज़ व्यक्त किया है और पिछले अध्ययनों से यह दर्शाया है कि यह YAP-TEAD और TAZ-TEAD प्रतिलेखन गतिविधि2,,14,,15में परिवर्तन का ईमानदारी से पता लगाता है ।

हमारा दृष्टिकोण तेजी से, मध्यम थ्रूपुट है, और स्क्रीनिंग सुविधाओं, स्वचालित रोबोटों, या पूल किए गए पुस्तकालयों के गहरे अनुक्रमण की आवश्यकता नहीं है। लागत अपेक्षाकृत कम है और वहां कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालयों से चुनने के लिए कर रहे हैं । अधिकांश प्रयोगशालाओं में आवश्यक उपकरण और अभिकर्मक भी अपेक्षाकृत मानक हैं। यह वस्तुतः किसी भी प्रतिलेखन कारक के नियामकों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित रिपोर्टर मौजूद है या उत्पन्न होता है । हम कैंसर कोशिकाओं में shRNAs स्क्रीन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करें, लेकिन किसी भी सेल लाइन है कि उचित दक्षता से ट्रांससंक्रमित किया जा सकता है सरणी पुस्तकालय के किसी भी प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सारांश चित्रा 1में दिखाया गया है ।

1. लेंटिवायरल वेक्टर लाइब्रेरी तैयार करना

नोट: प्रदर्शन स्क्रीन एक सरणी shRNA पुस्तकालय ९६ में ग्लाइसेरोल स्टॉक के रूप में खरीदा अच्छी तरह से प्लेटों का इस्तेमाल किया, लेकिन पुस्तकालयों को भी मैन्युअल रूप से उम्मीदवारों की एक सूची के आधार पर इकट्ठा किया जा सकता है । उचित नियंत्रण ों पर विचार किया जाना चाहिए और किसी भी पुस्तकालय में शामिल किया जाना चाहिए। इसमें एक गैर-लक्षित नियंत्रण श्रना (एसएचएनटीसी), प्रतिलेखन कारक की जांच की जा रही एक नियंत्रण shRNA शामिल है, और यदि संभव हो तो, जुगनू लूसिफ़ेरेज़ को लक्षित करने वाला एक श्रना।

  1. लुरिया शोरबा (एलबी) (एलबी) (एलबी) (1% बैक्टो-ट्राइप्टन, 0.5% खमीर निकालने, 1% एनसीएल, पीएच 7.5) के 1.3 mL जोड़ें जिसमें 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μg/mL एम्पिसिलिन हो। ग्लाइसेरोल स्टॉक के 2 माइक्रोन के साथ प्रत्येक कुएं का टीका लगाया जाए और 225 आरपीएम पर लगातार आंदोलन के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस की दर से बढ़ें।
  2. प्रत्येक जीवाणु संस्कृति को 1.5 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मीटर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x ग्राम पर अपन्तिफेशन द्वारा बैक्टीरिया को गोली दें।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके बैक्टीरियल मिनी-प्रेप किट का उपयोग करके प्रत्येक वेक्टर को शुद्ध करें।
  4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक वेक्टर की एकाग्रता निर्धारित करें।
  5. प्लाज्मिड्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

2. सरणी लेंटिवायरल पुस्तकालय की पैकेजिंग

नोट: पैकेजिंग, संक्रमण, और संक्रमित कोशिकाओं की बाद में पुलिया सहित लेंटिवायरस से जुड़े सभी काम को संस्थागत जैव सुरक्षा नियमों और विनियमों का कड़ाई से पालन करना चाहिए।

  1. पूर्ण विकास मीडिया (डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) का उपयोग करके 293FT कोशिकाओं का विस्तार करें जिसमें 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन शामिल हैं, 4,500 मिलीग्राम/एल ग्लूकोज और सोडियम पायरुवेट, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), पेनिसिलिन की 100 इकाइयों/एमएल, 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक।
  2. चरण 1.4 से पुस्तकालय में प्रत्येक वेक्टर के लिए, बीज 1 x 105 293FT कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से एक 24।
    नोट: यह सिफारिश की जाती है कि नियंत्रण वायरल वेक्टर के कुछ अतिरिक्त कुओं को पैक किया जाए और 3 चरण बढ़ाने से पहले वायरस के टिटर का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाए (नीचे देखें)।
  3. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: पैकेजिंग लेंटिवायरस के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल जिसे पहले14 वर्णित किया गया था, को इस प्रोटोकॉल के लिए 24 कुओं तक पहुंचा दिया गया है। यह लेंटिवायरल पैकेजिंग के लिए psPAX2 और एक कोट प्रोटीन के रूप में VSVG का उपयोग करता है । यदि एक्ट्रोपिक वायरस वांछित है, तो वीएसवीजी के बजाय इको पहुंचाने वाले वेक्टर का उपयोग किया जा सकता है। यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि इस प्रोटोकॉल को एक वायरल टिटर प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाता है जो लक्ष्य कोशिकाओं की 30%-70% संक्रमण दक्षता के बीच देता है (चर्चा देखें)। उपयोग किए जाने वाले सभी वेक्टर की सूची के लिए पूरक तालिका 1 देखें।
  4. चरण 1.4 से प्रत्येक वायरल वेक्टर के लिए एक ट्रांसफेक्शन मिश्रण सेट करें जैसा कि नीचे वर्णित है। प्रत्येक ट्रांसफेक्शन में वायरल वेक्टर के 250 एनजी, पीएसपीएएक्स2 के 125 एनजी, वीएसवीजी के 125 एनजी, ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान के 1.25 माइक्रोन 1, और 23.75 माइक्रोन ऑफ बफरक्शन (सामग्री की तालिकादेखें) शामिल होना चाहिए।
    1. प्रत्येक लेंटिवायरल वेक्टर को न्यूकलीज-मुक्त पानी के साथ ५० एनजी/μL में पतला करें, और फिर 5 μL (२५० एनजी) को ९६-वेल पीसीआर प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें ।
    2. ट्रांसफेक्शन सुपर मिक्स को 1.25 माइक्रोन मिलाकर बनाएं * ट्रांसफेक्शन रिएजेंट 1 और 23.75 माइक्रोन का एक्स * एक्स ऑफ प्री-वार्म्ड ट्रांसफेक्शन बफर जहां "एक्स" ट्रांसफेक्शन की कुल संख्या है और पाइपटिंग के दौरान वॉल्यूम लॉस के लिए कई अतिरिक्त है।
    3. 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर ट्रांसफेक्शन सुपर मिक्स को इनक्यूबेट करें।
    4. 125 एनजी * psPAX2 के एक्स और 125 एनजी * वीएसवीजी के एक्स चरण 2.4.3 से ट्रांसफेक्शन सुपर मिक्स की ट्यूब में जोड़ें और धीरे-धीरे मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। तेजी से 2.4.5 कदम के लिए आगे बढ़ें।
    5. तुरंत एक पीसीआर पट्टी की प्रत्येक ट्यूब में चरण 2.4.4 से मिश्रण को बदल ें, और फिर 25 माइक्रोन मिश्रण को चरण 2.4.1 से वायरल वेक्टर वाले प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
    6. 20 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    7. चरण 2.4.6 से प्रत्येक 96-अच्छी तरह से चरण 2.3 से 293 फीट कोशिकाओं वाले कुएं में सभी 30 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
  5. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और फिर 24-अच्छी प्लेट के हर कुएं में मीडिया को ताजा पूर्ण विकास मीडिया के 500 माइक्रोन के साथ बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जिसमें 5% सीओ2 एक और 24 घंटे के लिए है।
  6. एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से वायरल supernatant इकट्ठा और २२० μL (चरण 3 में 1 संक्रमण के लिए पर्याप्त प्लस कुछ अतिरिक्त मात्रा) दो ९६-कुओं में प्रत्येक । ये सरणी वायरल अलौकिक प्लेटें हैं।
  7. सरणी वायरल अलौकिक प्लेटों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । यह भी अतिरिक्त नियंत्रण वायरस है कि पैक किया गया था (ऊपर देखें) कोशिकाओं पर पैक किया गया था के कुछ परीक्षण के लिए 3 कदम आगे बढ़ने से पहले संक्रमित होने की सिफारिश की है । यह सुनिश्चित करना है कि टिटर कम से कम 30% संक्रमण दक्षता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है।

3. स्क्रीन के लिए कोशिकाओं का संक्रमण

नोट: मानव मेलानोमा कोशिकाओं (A375) इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन इस विधि को किसी भी अनुयायी कोशिकाओं है कि लेंटिवायरस के साथ संक्रमित करने के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, सेल संस्कृति और चढ़ाना शर्तों प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए (चर्चा देखें) ।

  1. पूर्ण विकास मीडिया में संक्रमित होने के लिए कोशिकाओं का विस्तार करें।
  2. बीज 24-अच्छी तरह से प्लेटें 1 x 105 कोशिकाओं के साथ 0.5 मिलीलीटर पूर्ण विकास मीडिया प्रति अच्छी तरह से। प्रत्येक वायरल वेक्टर के लिए एक अच्छी तरह से बीज का परीक्षण किया जाना है (नियंत्रण सहित) और एक अतिरिक्त अच्छी तरह से शामिल है कि संक्रमित नहीं किया जाएगा जो चरण ३.७ में दवा चयन के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम करेगा शामिल हैं ।
  3. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक कुएं को चरण 3.2 से जमे हुए सरणी लेंटिवायरल सुपरनेटेंट से एक अलग वायरल सुपरनेटेंट के साथ संक्रमित करें।
    1. पूर्ण विकास मीडिया तैयार करें जिसमें 20 μg/mL पॉलीब्रेन हो ।
    2. चरण 2.7 से कमरे के तापमान तक सरणी लेंटिवायरल लाइब्रेरी सुपरनेटेंट को पिघलाएं।
    3. चरण 3.2 से 24-अच्छी प्लेटों से विकास मीडिया को एस्पिरेट करें और तुरंत प्रत्येक अच्छी तरह से पॉलीब्रेन युक्त विकास मीडिया के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    4. एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करके, चरण 3.4.2 से चरण 3.4.3 से 24 कुओं में प्रत्येक 96-अच्छी तरह से वायरल सुपरनेटेंट के 200 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
  5. 24 - 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कुछ सेल लाइनों को shRNAs व्यक्त करने और प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी बनने के लिए 24 घंटे से अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है। यहां इस्तेमाल किया वायरल वेक्टर puroR के 3'UTR में एक miR30 आधारित श्रना के साथ एक टर्बो-GFP-IRES-puroR बचाता है(चित्रा 1)। पूर्णियासिन प्रतिरोध जीन और श्ना की संक्रमण दक्षता और अभिव्यक्ति की निगरानी हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा की गई थी।
  6. पूर्ण विकास मीडिया तैयार करें जिसमें 2.5 μg/mL puromycin हो।
    नोट: प्यूरोमाइसिन की चयन एकाग्रता कोशिका रेखाओं के बीच भिन्न होती है। यह सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक सेल लाइन को स्क्रीन से पहले परखे रखने के लिए एंटीबायोटिक किल वक्र किया जाए।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया Aspirate और प्यूरोमाइसिन युक्त पूर्ण विकास मीडिया के ५०० μL के साथ बदलें ।
    नोट: एक नियंत्रण गैर संक्रमित अच्छी तरह से है कि बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि puromycin चयन पूरा हो गया है सुनिश्चित करने के लिए puromycin जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें ।
  8. 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: 48 एच के लिए चयन करना सबसे अच्छा है, इसलिए चढ़ाना घनत्व और वायरल टिटर को अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाएं 48 घंटे से पहले अतिसंवर्तित न हों।
  9. सुनिश्चित करें कि संक्रमित कोशिकाएं फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे हरे रंग की हैं, और यह कि पूर्णासीन के साथ इलाज किए गए नियंत्रण पर कोशिकाएं चरण 4 पर आगे बढ़ने से पहले सभी मर चुकी हैं।

4. दोहरी-लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर के ट्रांसफेक्शन के लिए सीडिंग कोशिकाएं

नोट: प्रत्येक नई सेल लाइन के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व निर्धारित करने के लिए एक परीक्षण ट्रांसफेक्शन किया जाना चाहिए।

  1. चरण 3.9 से प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रिप्सिनकरें और इस प्रकार के रूप में नए 24-अच्छी प्लेट पर इसी स्थिति में कुओं में लगभग 1 x 105 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल सैकड़ों श्रनस के साथ पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि संक्रमित कोशिकाओं की हर अच्छी तरह से गिनना संभव न हो। इसलिए, नीचे दिए गए चरणों का उपयोग प्रत्येक कुएं में सेल संख्या का अनुमान लगाने के लिए किया गया था ताकि मोटे तौर पर समान चढ़ाना घनत्व सुनिश्चित करने में मदद मिल सके।
    1. चरण 3.9 से कुओं को 3 - 4 समूहों में समूह ित करें जैसे कि समूह के सभी कुओं में समान सेल घनत्व हो।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.5 मीटर ईटीए और 0.1% ट्राइप्सिन के साथ पूरक 1x पीबीएस) के 200 माइक्रोन के साथ प्रत्येक समूह से 1 प्रतिनिधि अच्छी तरह से ट्राइप्सिनाइज करें। फिर पूर्ण विकास मीडिया युक्त प्यूरोमाइसिन के 400 माइक्रोन जोड़कर ट्राइप्सिन-ईटीए को बेअसर करें।
    3. प्रत्येक प्रतिनिधि को अच्छी तरह से गिनती कुल सेल संख्या निर्धारित करने के लिए और 2 x 105 कोशिकाओं/पूर्ण विकास मीडिया का उपयोग करने के mL करने के लिए प्रत्येक प्रतिनिधि से सेल निलंबन को कमजोर ।
    4. एक नए 24-अच्छी तरह की प्लेट पर चरण 4.1.3 से प्रत्येक कुएं की बीज 0.5 मिलील (1 x 105 कोशिकाएं) और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इस नए 24-अच्छी तरह की प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. चरण 4.1.1 से प्रत्येक समूह के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए ट्राइप्सिन-ईटीए की मात्रा की गणना करने के लिए चरण 4.1.3 में निर्धारित कुल सेल संख्या का उपयोग करें ताकि परिणामस्वरूप सेल निलंबन 1 x 106 कोशिकाओं/mL हो जाएगा।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से ट्राइप्सिन-ईडीटीए की उचित मात्रा जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: बड़ी स्क्रीन के लिए यह सिफारिश की जाती है कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए 24-अच्छी प्लेटों को एक बार में सभी के बजाय समूहों में स्ट्रेसिन किया जाए और उन्हें प्रत्यावर्तित किया जाए।
    7. उपरोक्त ऊष्मायन के दौरान, एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग एक नए 24-अच्छी तरह की प्लेट पर संबंधित कुओं में पूर्ण विकास मीडिया युक्त प्यूरोमाइसिन के 400 माइक्रोन जोड़ने के लिए करें।
    8. चरण 4.1.7 में तैयार नए 24-अच्छी तरह से प्लेटों पर संबंधित स्थिति के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन (लगभग 1 x 105 कोशिकाओं) के 100 μL स्थानांतरित करें।
    9. चरण 4.1.1 से समूहीकृत कुओं की सभी प्लेटों के लिए 4.1.8 के माध्यम से चरण 4.1.6 दोहराएं, एक समय में एक प्लेट।
  2. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

5. दोहरी-लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर का ट्रांसफेक्शन

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 4.2 से डुअल-ल्यूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर के साथ इस प्रकार का निर्माण करता है।
    नोट: डीएनए की कुल राशि और जुगनू लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर वेक्टर के इष्टतम अनुपात Renilla लूसिफ़ेरेज़ वेक्टर को नियंत्रित करने के लिए इस परख शुरू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । यहां, एक डीएनए मिश्रण है कि 20 भागों जुगनू लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर और 1 भाग नियंत्रण Renilla लूसिफेरेज़ शामिल के ४०० एनजी का इस्तेमाल किया गया था ।
    1. ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने वाले मिश्रण (ट्यूब ए) और रिपोर्टर कमजोर पड़ने का मिश्रण (ट्यूब बी) को प्रत्येक अभिकर्ता(तालिका 1)की इंगित मात्रा ओं को मिलाकर ट्रांसफेक्शन (प्लस कई अतिरिक्त) से गुणा करें।
      नोट: यह प्रोटोकॉल ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान 2 (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए अनुकूलित किया गया है। यदि एक अलग ट्रांसफेक्शन रिएजेंट का उपयोग किया जाता है, तो इस चरण से पहले ट्रांसफेक्शन को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    2. ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने वाले मिश्रण (ट्यूब ए) को रिपोर्टर कमजोर पड़ने वाले मिश्रण (ट्यूब बी) के साथ मिलाएं और ट्रांसफेक्शन मिश्रण का उत्पादन करने के लिए 15 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. उपरोक्त ऊष्मायन के दौरान, प्रत्येक 24-अच्छी तरह से चरण 4.2 से फॉस्फेट बफर लवण (पीबीएस) के 0.25 मिलील के साथ कुल्ला करें, और प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्ण विकास मीडिया के 447 माइक्रोन जोड़ें।
    4. 15 मिन ऊष्मायन के बाद, 24-अच्छी प्लेटों में से प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण के 53 माइक्रोन वितरित करने के लिए एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
  2. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

6. दोहरी-लूसिफ़ेरेगतिविधि का परिमाणीकरण

  1. एक प्लेट रीडर और एक दोहरी लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख किट का उपयोग कर लूसिफ़ेरेगतिविधि गतिविधि उपाय के रूप में नीचे वर्णित है ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल संकेतित रिपोर्टर परख किट (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए अनुकूलित है और निर्माता के अनुशंसित प्रोटोकॉल का पालन करता है।
    1. सभी कुओं के लिए पर्याप्त 1x निष्क्रिय लिसिस बफर तैयार करें साथ ही 5x निष्क्रिय लिसिस बफर (किट में प्रदान की जाने वाली) 1 से 5 को डिओनाइज्ड पानी के साथ कमजोर करके कई अतिरिक्त (75 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से आवश्यक है) । इसके अलावा गल रिएजेंट ए और रिएजेंट बी बफर (किट में प्रदान की गई, प्रत्येक कुएं के लिए प्रत्येक के 100 माइक्रोन की आवश्यकता होती है)।
    2. चरण 5.2 से 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से मीडिया को एस्पिरेट करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 1x निष्क्रिय lysis बफर के 75 μL जोड़ें और कभी-कभी मिलाते हुए के साथ 30 मीटर के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. 50x रिएजेंट बी सब्सट्रेट (किट में प्रदान) 1:50 को पिघला हुआ रिएजेंट बी बफर के साथ कमजोर करके रिएजेंट बी तैयार करें।
    5. ब्लैंकिंग के लिए 4 कुओं में 1x निष्क्रिय लिसिस बफर के 30 माइक्रोन जोड़ें (पूरक तालिका 2देखें)।
    6. चरण 6.1.3 से 96-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे सफेद परख प्लेट के डुप्लिकेट कुओं में लिसैट के 30 μL स्थानांतरित करें।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से अभिएजेंट ए के 50 माइक्रोन जोड़ने के लिए एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें और प्लेट रीडर के साथ जुगनू लूसिफ़ेरेस सिग्नल पढ़ें।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से कदम 6.1.4 से रिएजेंट बी के 50 μL जोड़ने के लिए एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करें और एक प्लेट रीडर के साथ रेनिला लूसिफ़ेरेज सिग्नल पढ़ें।
  2. कच्चे डेटा को इस प्रकार संसाधित करें (विस्तृत विवरण के लिए, पूरक तालिका 2देखें)।
    1. बहुत कम रेनिला लूसिफेराज़ सिग्नल के साथ नमूनों को बाहर करें क्योंकि कम मूल्यों से संकेत मिलता है कि वायरल निर्माण विषाक्त था या बहुत कम ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं को परखे थे।
      नोट: जैसा कि चर्चा में समझाया गया है, काफी "कम" रेनिला ल्यूसिफेराज़ सिग्नल के परिणामस्वरूप असंगत परिणाम हो सकते हैं। यहां, जिन कुओं में रेनिला लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल मतलब से नीचे 1 मानक विचलन से अधिक था, उन्हें बाहर रखा गया था (पूरक तालिका 2देखें)। यह इन कोशिकाओं14में इस रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके किए गए पिछले अध्ययनों पर आधारित था, लेकिन अन्य सेल लाइनों में भिन्न हो सकता है।
    2. प्रत्येक कुएं के कच्चे जुगनू लूसिफ़ेरेज़ मूल्य को उसी कुएं के कच्चे रेनिला लूसिफ़ेरेज़ मूल्य को सामान्य करें ताकिजुगनू/रेनिला अनुपात प्राप्त किया जा सके।
    3. सभी दोहराने केजुगनू/रेनिला अनुपात का औसत नियंत्रण कुओं को दोहराने और फिर उस संख्या से हर दूसरे के जुगनू/रेनिला अनुपात को विभाजित करने के लिए एक गुना परिवर्तन प्राप्त करने के लिए ।Renilla
    4. नियंत्रण नमूना असाइन करें और इसकीजुगनू/रेनिला अनुपात मूल्य को 1 तक सेट करें ।
    5. मानक विचलन के साथ डुप्लिकेट कुओं और भूखंड केजुगनू/रेनिला अनुपात का औसत ।
      नोट: मानक विचलन सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रयोग नहीं किया जाता है, बल्कि इसके बजाय कुओं की पहचान करने के साधन के रूप में जहां प्रतिकृति काफी भिन्न होती है।

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Representative Results

हमारे YAP/TAZ-TEAD रिपोर्टर निर्माण (pGL3-5xMCAT (SV)-४९22,14,,15)एक ंयूनतम एसवी-४९ प्रमोटर विहित टीडी बाध्यकारी तत्व (MCAT)15 जुगनू लूसिफ़ेरेज जीन ड्राइविंग के 5 दोहराता के साथ शामिल है(चित्रा 1)। यह पीआरएल-टीके कंट्रोल वेक्टर (प्रोमेगा) के साथ कोशिकाओं में सह-ट्रांस-ट्रांस्रेट होता है, जो संविलियन रूप से सक्रिय एचएसवी टीके प्रमोटर(चित्रा 1)से रेनिला लूसिफ़ेरेस को व्यक्त करता है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वाईएपी/TAZ-TEAD रिपोर्टर निर्माण सेल लाइन (ओं) परीक्षण में अपेक्षित व्यवहार कर रहा है । इसलिए, हमने पहले पीआरएल-टीके और पीजीएल3-5एक्सएमसीटी (एसवी) -49 को A375 कोशिकाओं में सह-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांसकिया, जो या तो एक नियंत्रण वेक्टर, वाईएपी (वाईएपी2एसए)के एक अत्यधिक सक्रिय LATS-असंवेदनशील उत्परिवर्ती, या वाईएपी2एसए का उत्परिवर्ती टीडी (वाईएपी2एसए, S94A)को बांधने में असमर्थ है। जैसा कि उम्मीद थी, जुगनू लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि को वाईएपी2एसएद्वारा काफी बढ़ा दिया गया था, लेकिन नियंत्रण वेक्टर या वाईएपी2एसए, S94A (चित्रा 2ए)नहीं। इससे पता चलता है कि वाईएपी टीईडी-निर्भर तरीके से वाईएपी/TAZ-TEAD रिपोर्टर की गतिविधि को बढ़ाता है । महत्वपूर्ण बात, YAP2SA ने रेनिला लूसिफ़ेरेज़ के स्तर को काफी नहीं बदला। एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, हमने यह भी पुष्टि की कि वाईएपी2एसए न्यूनतम प्रमोटर निर्माण की गतिविधि में परिवर्तन नहीं करता है जिसमें एमसीएटी टीडी बाध्यकारी तत्वों(चित्रा 2बी)का अभाव है।

एक दूसरा नियंत्रण प्रयोग भी किया गया जिसमें A375 कोशिकाएं वायरल निर्माण से संक्रमित थीं जो या तो एक गैर-लक्षित नियंत्रण श्रना (एसएनटीसी) या मिलकर वाईएपी और TAZ shRNAs के साथ एक निर्माण प्रदान करती हैं। स्थिर चयन के बाद, कोशिकाओं को पीआरएल-टीके निर्माण और या तो YAP/TAZ-TEAD रिपोर्टर निर्माण या ंयूनतम प्रमोटर निर्माण से सह-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांसकिया गया था । YAP/TAZ-TEAD रिपोर्टर निर्माण से संक्रमित कोशिकाओं में, YAP/TAZ shRNA काफी जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के स्तर को कम है, लेकिन नियंत्रण shNTC नहीं था(चित्रा 2सी)। जुगनू लूसिफ़ेरेज़ का स्तर या तो एसएचएनटीसी या वाईएपी/TAZ shRNA न्यूनतम प्रमोटर(चित्रा 2सी)से संक्रमित कोशिकाओं में नहीं बदला गया । ऊपर दिए गए परिणामों के अनुरूप, प्रत्येक कुएं में रेनिला सिग्नल को नियंत्रण एसएचएनटीसी या वाईएपी/टीजेड श्ना(चित्रा 2सी)द्वारा भी काफी परिवर्तन नहीं किया गया था, आगे यह दर्शाता है कि पीआरएल-टीके नियंत्रण निर्माण वाईएपी या TAZ के लिए उत्तरदायी नहीं है। सामूहिक रूप से, इन प्रयोगों से पता चलता है कि रिपोर्टर प्रणाली A375 कोशिकाओं में उम्मीद के अनुसार व्यवहार कर रही है, जो इन वेक्टर2,,14का उपयोग करके पिछले अध्ययनों के अनुरूप है।

अवधारणा प्रयोग के सबूत के रूप में, हमने A375 कोशिकाओं में एक छोटी लेंटिवायरल श्रना लाइब्रेरी की जांच की। हमारे परीक्षण पुस्तकालय में कई जीन है कि पहले अंय सेल प्रकार में YAP/TAZ समारोह को विनियमित करने के लिए दिखाया गया था लक्ष्यीकरण shRNAs निहित । हालांकि, मेलानोमा में YAP और TAZ के नियमन में इनमें से कई जीन की भूमिका अज्ञात है । हमारे पुस्तकालय में ऐसे जीन शामिल थे जो आरएपी/टीजेड गतिविधि के लिए आवश्यक हैं, जैसे कि RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, और CCNE216,,17,,18,,19,20,,21,,22,,23,,24,,25,,,26,,27,,28,,29,, 30,,31,,32,,33,,34,35,,36,,37,,38,और जीन ने वाईएपी/टैज गतिविधि को बाधित करने की भविष्यवाणी की, जैसे सीएसके, ईआरबी2, एटीएम, सीडीएच1, गेल्सोलिन (जीएसएन), पीएनई, एटीआर, और आरबी139,,40,,41,,42,,,43,,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. नियंत्रण के रूप में, हम एक मिलकर YAP/TAZ shRNA14,एक गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण shRNA (shNTC), और एक shRNA लक्ष्यीकरण एसआरसी, जो हम पहले दिखाया अधिकतम YAP/A375 कोशिकाओं14में TAZ गतिविधि के लिए आवश्यक था शामिल थे ।

इस स्क्रीन के लिए कच्चे डेटा और विश्लेषण पूरक तालिका 2में दिखाया गया है । कई shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 और shMAPK8-2) काफी कम Renilla ल्यूसिफ़ेरेस सभी कुओं के लिए मतलब Renilla संकेत के सापेक्ष संकेत, सुझाव है कि इन shRNAs A375 कोशिकाओं में साइटोटॉक्सिकता पैदा कर रहे थे । वास्तव में इन कुओं परख के समय काफी कम कोशिकाओं था (नहीं दिखाया गया) । इससे उन उम्मीदवारों को अलग करना बहुत मुश्किल हो जाता है जो सेल सर्वाइवल के लिए जरूरी लोगों से वाईएपी/TAZ को विनियमित कर सकते हैं । इसलिए, इन नमूनों से परिणाम आगे डेटा विश्लेषण से बाहर रखा गया है । जैसा कि उम्मीद थी, YAP और TAZ या एसआरसी को लक्षित करने वाले shRNAs ने YAP/TAZ-TEAD गतिविधि(चित्रा 3)को काफी कम कर दिया । प्रकाशित काम के अनुरूप दिखा रहा है कि PIK3CA YAP और TAZ गतिविधि21,,26,,31को बढ़ावा देता है, हमने पाया कि PIK3CA को लक्षित shRNAs सामान्यीकृत जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के स्तर को कम कर दिया । एटीएम, सीडीएच 1, सीएसके, ईआरबीबी 2, जीएसएन को लक्षित करने वाले shRNAs प्रत्येक सामान्यीकृत जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के स्तर में वृद्धि हुई है, जो प्रकाशित अध्ययनों के अनुरूप है जिसमें यह दर्शाया गया है कि ये प्रोटीन वाईएपी को दबाते हैं और/या TAZ39,,41,,42,43,,45,,46,,47,,48,,50,,51,,53,,54 , . अन्य सेल प्रकारों में एटीआर, सीसीने2 और ईआरबीबी 4 के लिए स्थापित भूमिकाओं के बावजूद27,28,,35,,,36,,38,,49,इन जीनों को लक्षित करने वाले श्आरएनए ने A375 कोशिकाओं में सामान्यीकृत जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के स्तर को काफी नहीं बदला। ईएच2 और आरबी 1 को निशाना बनाने वाले श्आरएनएएस ने जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के स्तर पर प्रभाव दिखाया जो अन्य,सेलप्रकारों 32, 34 ,,40,3452में अध्ययनों के आधार पर अपेक्षित था । दोनों PTEN और RAF1 दो अलग shRNAs कि लूसिफ़ेरेगतिविधि पर विपरीत प्रभाव था द्वारा लक्षित किया गया । पिछले अध्ययनों के साथ असंगत परिणाम संकेत मिलता है कि YAP/TAZ-TEAD समारोह पर इन प्रोटीन का प्रभाव सेल प्रकार निर्भर है; हालांकि, यह कुछ श्र्नद्वारा खराब नॉकडाउन दक्षता या ऑफ-टारगेट प्रभावों के कारण भी हो सकता है। एक एन = 1 "अंधा" स्क्रीन के रूप में, कुछ झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक भी उम्मीद की जाएगी। जैसा कि चर्चा में अधिक विस्तार से चर्चा की गई है, अतिरिक्त सत्यापन प्रयोगों को अन्य रूपों जैसे जीन के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग करने की आवश्यकता होगी जो वाईएपी और ताज़ द्वारा विनियमित किए जाते हैं और पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों के लिए पश्चिमी धब्बों जो वाईएपी/TAZ फ़ंक्शन को प्रभावित करते हैं। इस सत्यापन में इस बात की पुष्टि भी शामिल होगी कि कौन सा shRNAs ने प्रभावी रूप से ब्याज के प्रोटीन को नीचे गिरा दिया। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चूंकि हमारा रिपोर्टर टीडी उत्तरदायी है, इसलिए हमारी स्क्रीन द्वारा पहचाने गए किसी भी जीन टीडी को प्रभावित कर सकते हैं लेकिन सीधे YAP और TAZ नहीं। अनुवर्ती यंत्रवादी अध्ययन ों के लिए निर्धारित है कि क्या यह YAP और/या TAZ या TEADs कि पहचान प्रोटीन विनियमन है की आवश्यकता होगी । हालांकि, YAP और TAZ TEAD-मध्यस्थता प्रतिलेखन के प्रमुख ड्राइवर हैं, तो यह संभावना है कि इन जीन के अधिकांश YAP और TAZ विनियमन कर रहे हैं । दरअसल, जैसा कि ऊपर कहा गया है, स्क्रीन लक्ष्य प्रोटीन है कि YAP और/

Figure 1
चित्र 1: कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध आरेख। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों को प्रोटोकॉल में संख्याओं के अनुरूप चरण संख्याओं के साथ संक्षेप में संक्षेप में बताया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: YAP/TAZ-TEAD दोहरी-लूसिफ़ेराज़ ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर सिस्टम का अनुकूलन । (A)A375 कोशिकाओं को स्थिर नियंत्रण वेक्टर (MSCV-IRES-Hygro), LATS-असंवेदनशील YAP (YAP2SA),या LATS-असंवेदनशील YAP टीईडी बांधने में असमर्थ व्यक्त (YAP2SA, S9 4A)पीआरएल-टीके(रेनिला)और pGL3-5xMCAT (एसवी)-४९ (YAP/TAZ-TEAD रिपोर्टर) के निर्माण और लूसिफेरेस सिग्नल से सह-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांसकिया गया था और लूसिफ़ेराज सिग्नल को 24 घंटे बाद मापा गया था । n = 7 स्वतंत्र प्रयोग। (ख)A375 कोशिकाओं को या तो YAP2SA या नियंत्रण वेक्टर, पीआरएल-टीके निर्माण, और या तो pGL3-5xMCAT (एसवी)-४९ निर्माण या pGL3 (SV)-४९ निर्माण (ंयूनतम प्रमोटर) और लूसिफेरे संकेत से सह-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस किया गया था 24 घंटे बाद मापा गया । n = 1 प्रयोग चौगुनी में ट्रांससंक्रमित। (C)A375 कोशिकाओं को रेट्रोवायरस से संक्रमित किया गया था जो गैर-लक्षित नियंत्रण शआरएनए (एसएनटीसी) या टैंडेम वाईएपी और ताज़ श्नास (shYAP/TAZ) को लक्षित कर रहा था । स्थिर चयन के बाद, कोशिकाओं को पीआरएल-टीके निर्माण से सह-संक्रमित किया गया था और या तो पीजीएल3-5xएमसीएटी (एसवी)- 49 निर्माण या पीजीएल3 (एसवी) -49 निर्माण और लूसिफ़ेराज़ सिग्नल को 24 घंटे बाद मापा गया था। n = 4 स्वतंत्र संक्रमण; सांख्यिकीय महत्व एक तरह से ANOVA का उपयोग कर निर्धारित किया गया था Tukey कई तुलना परीक्षण के बाद; n.s= पीएंडजीटी 0.05, * पीएंडएलटी;0.05, ** पीएंडएलटी;0.01, **** पीएंडएलटी;0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि स्क्रीन के परिणाम। प्रत्येक नॉक डाउन वेक्टर से परिणाम की तुलना एसएचएनटीसी से की जाती है और गुना अंतर के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। बार ग्राफ जुगनू लूसिफेरेस/रेनिलाRenilla लूसिफ़ेरेज़ अनुपात ± मानक विचलन के औसत से पता चलता है । n = 1 प्रयोग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ट्यूब ए - ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने
अभिकर्मक आयतन
ट्रांसफेक्शन बफर प्रति प्रतिक्रिया 25 माइक्रोन
ट्रांसफेक्शन रिएजेंट 2 (दूसरा जोड़ें) प्रति प्रतिक्रिया 1.5 माइक्रोन
ट्यूब बी - रिपोर्टर कमजोर पड़ने
अभिकर्मक आयतन
ट्रांसफेक्शन बफर प्रति प्रतिक्रिया 25 माइक्रोन
20:1 जुगनू लूसिफ़ेरेरिपोर्टर: नियंत्रण रेनिला मिश्रण (दूसरा जोड़ें) प्रति प्रतिक्रिया 400 एनजी
ट्रांसफेक्शन रिएजेंट 3 (तीसरा जोड़ें) प्रति प्रतिक्रिया 1 μl
कुल: प्रति प्रतिक्रिया 26.5 माइक्रोन

तालिका 1: ट्रांसफेक्शन मिश्रण की तैयारी। 24-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्शन के लिए, ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान 2 का 1.5 माइक्रोन ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने (ट्यूब ए) का उत्पादन करने के लिए ट्रांसफेक्शन बफर के 25 माइक्रोन में पतला होता है; जबकि 20:1 जुगनू लूसिफेरेस रिपोर्टर के ४०० एनजी: नियंत्रण Renilla मिश्रण और ट्रांसफेक्शन रीजेंट 3 के 1 μL ट्रांसफेक्शन बफर के 25 μL में पतला करने के लिए रिपोर्टर कमजोर पड़ने (ट्यूब बी) का उत्पादन है ।

मौजूदा/खरीदे/उपहार वेक्टर
वेक्टर स्रोत
GIPZ मानव श्रना लेंटिवायरल वेक्टर जीई हेल्थकेयर
वीएसवीजी हायनेस लैब [2]
psPAX2 एडजीन (#12260)
झूठ/पोल एडजीन (#14887)
पीजीएल3-(एसवी))-49 आयन फर्नेस [15]
PGL3-5xMCAT (एसवी)-49 आयन फर्नेस [15]
पीआरएल-टीके प्रोमेगा
एमएससीवी-आईआरएस-हाइग्रो लामार लैब [2]
MSCV-YAP-S127A, S381A-IRES-Hygro लामार लैब [2]
MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 लामार लैब [14]
नए वेक्टर
वेक्टर स्रोत रीढ़
MSCV-YAP-S94A, S127A, S381A-IRES-Hygro एमएससीवी-आईआरएस-हाइग्रो

पूरक तालिका 1: वेक्टर की तालिका। उपयोग किए जाने वाले सभी वेक्टर वर्णित नए वेक्टर के साथ सूचीबद्ध हैं। मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग नए वेक्टर उत्पन्न करने के लिए किया गया था।

पूरक तालिका 2: लूसिफ़ेरेज़ परख डेटा विश्लेषण। पहली टेबल में श्रन्ना लाइब्रेरी की व्यवस्था दिखाई गई है। दूसरी और तीसरी तालिकाओं में क्रमशः कच्चे जुगनू और रेनिला लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल दिखाई देते हैं । सभी कुओं के लिए रेनिला लूसिफ़ेरेज सिग्नल के लिए मतलब और मानक विचलन पीले बक्से में इंगित किए जाते हैं। एक रेनिला लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल के साथ वेल्स को नीचे 1 मानक विचलन से अधिक किया जाता है, लाल पाठ के साथ हाइलाइट किया जाता है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाता है। हर कुएं काजुगनू/रेनिला अनुपात कच्चे रेनिला लूसिफ़ेराज़ सिग्नल (चौथी तालिका) द्वारा कच्चे जुगनू लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल को विभाजित करके प्राप्त किया गया था । प्रत्येक कुएं केजुगनू/रेनिला अनुपात को तब जुगनू/रेनिला अनुपात नियंत्रण (एसएचएनटीसी) कुओं (पांचवीं तालिका) के औसत तक सामान्यीकृत किया गया था ।Renilla डुप्लिकेट कुओं को अगले प्रत्येक निर्माण के लिए औसत किया गया था और मानक विचलन की गणना (छठी तालिका) की गई थी। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एक दोहरी-ल्यूसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शन रिपोर्टर परख के साथ संयोजन में सरणी वायरल पुस्तकालयों की मध्यम थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं जिसका उपयोग प्रतिलेखन कारकों के उपन्यास नियामकों की पहचान करने और परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। किसी भी स्क्रीन से पहले प्रत्येक सेल लाइन के लिए रिपोर्टर सिस्टम को चिह्नित और अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगों की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए कि रिपोर्टर प्रतिलेखन कारक की जांच की जा रही है और गतिविधि में परिवर्तन की भयावहता वीटोर्स को नियंत्रित करने के सापेक्ष परीक्षण किया जाना चाहिए की परिवर्तित गतिविधि के लिए उत्तरदायी है । रिपोर्टर निर्माण के साथ पीआरएल-टीके निर्माण का सह-ट्रांसफेक्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह रिपोर्टर से ट्रांस्रेड कोशिकाओं की संख्या और रिपोर्टर निर्माण की प्रति संख्या के लिए नियंत्रण में मदद करता है, दोनों ही लूसिफ़ेरे संकेत की भयावहता को बदल सकते हैं । अनुकूलन प्रयोगों को यह भी सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रतिलेखन कारक संविलियन रेनिला निर्माण या न्यूनतम प्रमोटर निर्माण की गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है क्योंकि इससे परिणामों की व्याख्या जटिल हो सकती है। पुस्तकालय में शामिल किए जाने वाले नियंत्रणों पर भी सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल सैकड़ों श्आरएनए के साथ पुस्तकालयों की "ब्लाइंड स्क्रीन" के लिए डिज़ाइन किया गया है, जहां प्रत्येक श्रना द्वारा प्रभावी नॉकडाउन की पुष्टि करना संभव नहीं है। इसलिए, कुछ झूठे सकारात्मक और नकारात्मक होने की संभावना है। स्क्रीन में तकनीकी और/या जैविक प्रतिकृतियों की संख्या बढ़ाने से झूठे सकारात्मक और नकारात्मक की संख्या को कम करने में मदद मिल सकती है । हालांकि, यह भी काफी संस्कृति और परख के लिए कुओं की संख्या में वृद्धि होगी तो देखभाल के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए उपइष्टतम संस्कृति की स्थिति में परिणाम नहीं है (नीचे देखें) । झूठी सकारात्मक और नकारात्मक को कम करने के लिए एक और दृष्टिकोण एक ही सेल लाइन या अतिरिक्त सेल लाइनों में पूरी स्क्रीन दोहराना होगा, या केवल "हिट" 3 जैविक प्रतिकृति का उपयोग कर सहित एक छोटे पुस्तकालय स्क्रीन करने के लिए होगा । सभी मामलों में, किसी भी हिट को रिपोर्टर के अलावा रीडआउट का उपयोग करके मान्य किया जाना चाहिए, जैसे ज्ञात लक्ष्य जीन के लिए क्यूपीसीआर। इन सत्यापन चरणों में लक्षित जीन के प्रभावी नॉकडाउन की भी पुष्टि की जानी चाहिए। निष्कर्ष shRNAs के बारे में नहीं किया जाना चाहिए कि गतिविधि में परिवर्तन नहीं है जब तक shRNA द्वारा प्रभावी नॉकआउट की पुष्टि की है । सत्यापन प्रयोगों को यह भी सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रतिलेखन कारक की जांच की जा रही है जो लक्षित जीन (एस) द्वारा विनियमित है और ये जीन रेनिला या न्यूनतम प्रमोटर निर्माण को प्रभावित नहीं करते हैं।

प्रत्येक सेल लाइन के लिए सेल संस्कृति की स्थिति को अनुकूलित करना भी महत्वपूर्ण है ताकि अति-संगम, बहुत कम कोशिकाएं, खराब सेल व्यवहार्यता, या चर प्रसार क्षमता जैसी उप-इष्टतम स्थितियों से बचा जा सके। सेल सीडिंग घनत्व दोहरी-लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर निर्माण (चरण 5) के ट्रांसफेक्शन के समय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है और जब रिपोर्टर गतिविधि (चरण 6) मापी जाती है। ट्रांसफेक्शन दक्षता सेल घनत्व के साथ काफी भिन्न हो सकती है और खराब ट्रांसफेक्शन दक्षता के परिणामस्वरूप असंगत परिणाम हो सकते हैं यदि सेल आबादी का केवल एक छोटा सा अंश परसा जा रहा है। परीक्षण की गई अधिकांश सेल लाइनें 40 - 60% संगम पर उच्चतम ट्रांसफेक्शन दक्षता दिखाती हैं, लेकिन यह सिफारिश की जाती है कि ट्रांसफेक्शन की स्थिति और सीडिंग घनत्व को वेक्टर का उपयोग करके दिए गए सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रदान करता है। सेल लाइनें जो संक्रमित करने के लिए मुश्किल है और/या ट्रांसफेक्ट, जैसे प्राथमिक कोशिकाएं इस स्क्रीन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। गरीब रिपोर्टर ट्रांसफेक्शन दक्षता या खराब सेल व्यवहार्यता आमतौर पर बहुत कम रेनिला लूसिफेराज़ सिग्नल में परिणाम देती है। हालांकि, सेल लाइन के लिए रेनिला लूसिफ़ेराज़ सिग्नल की सीमा निर्धारित करने के लिए एक पायलट प्रयोग किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि सरणी पुस्तकालय से उत्पादित वायरस का टिटर काफी अधिक है जो सेल लाइन में कम से कम 30% की संक्रमण दक्षता देने के लिए है। संक्रमण दक्षता बहुत भिन्न हो सकती है और कई कारक वायरल टिटर को प्रभावित कर सकते हैं। उपयोग की जाने वाली वायरल सुपरनेटेंट की मात्रा को प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और यदि आवश्यक हो, तो वायरल टिटर में सुधार करने के लिए स्टेप 2 को और अनुकूलित किया जा सकता है।

सेल घनत्व और सेल व्यवहार्यता भी सेलुलर रास्तों की गतिविधि को प्रभावित कर सकते है कि प्रतिलेखन कारकों को विनियमित, तो यह रिपोर्टर ट्रांसफेक्शन के लिए कोशिकाओं बीज इतना है कि वे दिन दोहरी लूसिफ़ेराज़ परख पढ़ा है पर एक समान घनत्व पर सभी कर रहे है महत्वपूर्ण है (6 कदम) । यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं केंद्र में घने पैच में क्लस्टरिंग के बजाय अच्छी तरह से पालन करें। जैसा कि ऊपर वर्णित है, रेनिला लूसिफ़ेराज़ सिग्नल में अच्छी तरह से महत्वपूर्ण भिन्नता के परिणामस्वरूप डेटा हो सकता है जिसकी व्याख्या करना मुश्किल है। अन्य सभी कुओं की तुलना में रेनिला लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल में महत्वपूर्ण कमी दिखाने वाले कुओं को बाहर करना सबसे अच्छा है क्योंकि इससे पता चलता है कि या तो वायरल वेक्टर सेल व्यवहार्यता को कम कर रहा है या उस कुएं के लिए ट्रांसफेक्शन दक्षता बहुत कम थी। यहां हमने मतलब रेनिला ल्यूसिफ़ेरेज़ सिग्नल से 1 मानक विचलन से अधिक कुओं को बाहर रखा, लेकिन प्रत्येक सेल लाइन के लिए उचित कटऑफ निर्धारित करने के लिए अनुकूलन प्रयोग किए जाने चाहिए। यह भी संभव है कि सेल व्यवहार्यता को कम करने वाले shRNAs ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर की गतिविधि में फेरबदल करके ऐसा कर सकते हैं। यदि यह एक चिंता का विषय है, shRNAs कि Renilla लूसिफ़ेरेज संकेत को कम करने के लिए फिर से प्रेरक shRNAs या अंय assays का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है । यह भी समय की राशि है कि अनुयायी कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद निलंबन में है सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है । कोशिकाओं के ट्राइप्सिनाइजेशन और सीडिंग के दौरान अधिकांश चरणों के लिए एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें, और बड़ी स्क्रीन के लिए, बैचों में प्लेटों के साथ काम करें। इसके अलावा कोशिकाओं के संक्रमण और रिपोर्टर परख के बीच के समय को सीमित करना सबसे अच्छा होता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर प्रतिलेखन कारक परखे जा रहा है सेल प्रसार या अस्तित्व को नियंत्रित करता है । इस मामले में, प्रभावी नॉकडाउन वाली कोशिकाओं को कम कुशल नॉकडाउन वाली कोशिकाओं द्वारा मात दी जाएगी।

वर्णित प्रोटोकॉल के कई संशोधन व्यवहार्य हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग किसी भी प्रतिलेखन कारक के नियामकों की पहचान करने के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है यदि एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित रिपोर्टर उत्पन्न होता है, और कई सबसे आम प्रतिलेखन कारकों के लिए रिपोर्टर पहले से मौजूद है। इस प्रोटोकॉल को एक विस्तृत विविधता के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या मैन्युअल रूप से इकट्ठे पुस्तकालयों के उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है, जिसमें आरएनएआई, CRISPR/CAS9, ORF या cDNA शामिल हैं । दरअसल, हम पहले YAP के लिए एक छोटे सीडीएनए पुस्तकालय14का परीक्षण करने के लिए एक ऐसी ही रणनीति का इस्तेमाल किया/ पुस्तकालयों को रेट्रोवायरस, लेंटिवायरस, एडेनोवायरस, या क्षणिक क्षणिक का उपयोग करके वितरित किया जा सकता है। यहां इस्तेमाल होने वाला वायरल कोट प्रोटीन (वीएसवीजी) लेंटिवायरस उत्पन्न करता है जो मानव संक्रामक है। यदि कृंतक कोशिकाओं का उपयोग किया जा रहा है और गैर-मानव संक्रामक इकोट्रॉपिक वायरस वांछित है, तो वीएसवीजी के बजाय इको कोट प्रोटीन देने वाले वेक्टर का उपयोग किया जा सकता है।

अन्य तरीकों का उपयोग ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के नियामकों के लिए पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग सुविधा तक पहुंच स्वचालित तरीके से बहुत बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देगी। इसी तरह, जीनोम-वाइड स्क्रीन "हिट" की पहचान करने के साधन के रूप में गहरी अनुक्रमण के साथ पूल किए गए पुस्तकालयों का उपयोग करके की जा सकती है। हालांकि, इन दोनों दृष्टिकोणों के लिए ऐसे उपकरणों की आवश्यकता होती है जो कई शोधकर्ताओं के लिए सुलभ नहीं हैं, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या गहरी अनुक्रमण के लिए शुल्क निषेधात्मक रूप से उच्च हो सकता है। इसके अलावा, पूल ्ड स्क्रीन को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या ट्रांसक्रिप्शन गतिविधि में वांछित परिवर्तन दिखाने वाली कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए किसी अन्य तरीके का उपयोग करके कोशिकाओं की छंटाई की आवश्यकता होगी। एक दोहरी-ल्यूसिफ़ेरेज़ आधारित ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख का उपयोग करके बड़े सरणी अभिव्यक्ति पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग पहले एक बेंचटॉप रोबोट55का उपयोग करके प्रदर्शित की गई है, लेकिन यह आमतौर पर सभी शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं है। इसके विपरीत, यहां वर्णित विधि तेजी से, मध्यम थ्रूपुट, अपेक्षाकृत सस्ती है, और उपकरणों और अभिकर्मकों का उपयोग करती है जो अधिकांश जांचकर्ताओं के लिए सुलभ हैं। यह विधि एक ही प्रयोग में कई नियामकों को प्रकट कर सकती है, जो एक प्रतिलेखन कारक के ऊपर संभावित नियामक मार्गों की खोज करने का एक लागत प्रभावी और सुविधाजनक तरीका है।

वर्णित दृष्टिकोण में, उम्मीदवार जीन को स्थिर रूप से नीचे गिरा दिया गया था और फिर चयन के बाद, रिपोर्टर निर्माण कोशिकाओं में क्षणिक रूप से ट्रांसवेटेड थे । हालांकि, ट्रांसफेक्शन दक्षता कई सेल लाइनों में खराब है और परिवर्तनशीलता पेश कर सकती है और सेलुलर विषाक्तता का कारण बन सकती है। एक बेहतर वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए स्थिर ब्याज की सेल लाइन के जीनोम में रिपोर्टर निर्माण एकीकृत और फिर स्क्रीनिंग के लिए वायरल पुस्तकालयों के साथ रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं को संक्रमित होगा । यह सुधार क्षणिक क्षणिक परिवर्तन द्वारा शुरू की गई परिवर्तनशीलता को कम करेगा और लंबे समय तक संक्रमण के बाद संस्कृति के कारण प्रतिलेखन कारक गतिविधि में किसी भी संभावित परिवर्तन को रोकेगा । जैसा कि ऊपर बताया गया है, एक छोटे बेंचटॉप रोबोट का उपयोग प्रक्रिया को बहुत कारगर बना देगा और पुस्तकालयों के आकार को बढ़ाएगा जिसकी जांच की जा सकती है। एक और काफी परिवर्तन सरणी प्रेरक वेक्टर पुस्तकालयों का उपयोग करना है, जो अधिक प्रभावी नॉकडाउन के साथ कोशिकाओं के खिलाफ चयन की संभावना को कम करेगा और सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन के कारण परिवर्तनशीलता को कम करेगा।

एक महत्वपूर्ण चुनौती है कि कई कैंसर के प्रभावी उपचार को रोकता है कि ट्यूमर कोशिकाओं को भी सबसे प्रभावी लक्षित चिकित्सा के लिए प्रतिरोध प्राप्त है । रोगी के परिणाम में सुधार के लिए इस चिकित्सीय प्रतिरोध के लिए आवश्यक प्रोटीन की पहचान आवश्यक है। वर्णित दृष्टिकोण आसानी से लक्षित चिकित्सा विज्ञान के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है जीन है कि वृद्धि की संवेदनशीलता या इन यौगिकों के लिए प्रतिरोध का कारण प्रकट करने के लिए । इस दृष्टिकोण का एक और संभावित भविष्य आवेदन संयोजन में उम्मीदवार चिकित्सकीय लक्ष्यों का परीक्षण करने के लिए इस सरणी स्क्रीनिंग का उपयोग करना होगा। इसके लिए, कोशिकाओं को दो वायरल वेक्टर से संक्रमित किया जाएगा जिसमें प्रोटीन की पहचान करने के लक्ष्य के साथ प्रतिलेखन कारक गतिविधि पर सहक्रियात्मक प्रभाव पड़ता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम श्रना वैक्टर की तैयारी में सहायता करने के लिए एमिली नॉर्टन और मिकाएलन Cucciarre-Stuligross का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एक सुसान जी कोमेन कैरियर उत्प्रेरक अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था जो जेएमएल (#CCR17477184) को सम्मानित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

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Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

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