Summary
Ett protokoll för generering av dynamiska kemiska landskap genom fotolys inom mikrofluidiska och millifluidiska uppställningar presenteras. Denna metod är lämplig att studera olika biologiska processer, inklusive motile beteende, näringsupptag, eller anpassning till kemikalier av mikroorganismer, både på encellig och befolkningsnivå.
Abstract
Vi visar en metod för generering av kontrollerade, dynamiska kemiska pulser – där lokaliserade kemoattractant plötsligt blir tillgänglig på mikroskala – för att skapa mikromiljöer för mikrobiella chemotaxisexperiment. För att skapa kemiska pulser utvecklade vi ett system för att införa aminosyrakällor nästan omedelbart genom fotolys av buraminosyror i en polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk kammare som innehåller en bakteriell suspension. Vi tillämpade denna metod på chemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klättra dessa dynamiska kemiska gradienter samtidigt spåras av videomikroskopi. Aminosyror, som återges biologiskt inert ("bur") genom kemisk modifiering med en fotoflyttbar skyddsgrupp, är jämnt närvarande i suspensionen men inte tillgängliga för konsumtion fram till deras plötsliga utsläpp, som sker vid användardefinierade punkter i tid och rum med hjälp av en nästan UV-A fokuserad LED-balk. Antalet molekyler som frigörs i pulsen kan bestämmas av ett kalibreringsförhållande mellan exponeringstid och uncaging fraktion, där absorptionsspektrumet efter fotolys kännetecknas av användning av UV-Vis spektroskopi. Ett nanoporöst polykarbonatmembran (PCTE) kan integreras i den mikrofluidiska enheten för att möjliggöra kontinuerlig borttagning genom flöde av uncaged föreningar och de förbrukade medierna. Ett starkt, irreversibel bindning mellan PCTE-membranet och PDMS mikrofluidisk struktur uppnås genom beläggning av membranet med en lösning på 3-aminopropyltrietoxysilane (APTES) följt av plasmaaktivering av ytorna som ska bindas. Ett datorstyrt system kan generera användardefinierade pulssekvenser på olika platser och med olika intensiteter, för att skapa resurslandskap med föreskrivna rumsliga och tidsmässiga variationer. I varje kemiskt landskap kan dynamiken i bakterierörelsen i individskala och deras ackumulering på populationsnivå erhållas, vilket möjliggör kvantifiering av kemotaktiskprestanda och dess effekter på bakterieaggregeringar i ekologiskt relevanta miljöer.
Introduction
Mikrober förlitar sig på chemotaxis, processen att upptäcka kemiska gradienter och ändra motilitet som svar1,att navigera kemiska landskap, närma sig näringskällor och värdar, och undkomma skadliga ämnen. Dessa mikroskala processer bestämma makroskala kinetik av interaktioner mellan mikrober och deras miljö2,3. De senaste framstegen inom mikrofluidik och mikrotillverkning teknik, inklusive mjuk litografi4,har revolutionerat vår förmåga att skapa kontrollerade mikromiljöer för att studera interaktioner av mikrober. Till exempel har tidigare experiment studerat bakteriell chemotaxis genom att generera mycket kontrollerade, stabila lutningar av mellanliggande till höga näringskoncentrationer5,6. I naturliga miljöer kan dock mikroskalakemiska gradienter vara kortlivade – skingras av molekylär diffusion – och bakgrundsförhållanden är ofta mycket utspädda7. För att direkt mäta chemotactic svar av mikrobiellpopulationer först utsätts för ostadiga kemiska miljöer, vi utarbetat och här beskriva metoder för att kombinera mikrofluidisk teknik med fotolys, vilket härmar gradienter som vilda bakterier möter i naturen.
Uncaging teknik sysselsätter ljuskänsliga sonder som funktionellt kapsla in biomolekyler i en inaktiv form. Bestrålning frigör burmolekylen, vilket möjliggör riktad störning av en biologisk process8. På grund av den snabba och exakta kontrollen av cellulär kemi som uncaging ger9, fotolys av bur föreningar har traditionellt använts av biologer, fysiologer och neuroforskare att studera aktivering av gener10, jon kanaler11, och nervceller12. På senare tid har forskare utnyttjat de betydande fördelarna med fotolys för att studera chemotaxis13, för att bestämma flagella växlingdynamiken hos enskilda bakterieceller utsätts för en stegvis kemoattractant stimulans14,15,och att undersöka motilitet mönster av enstaka spermieceller i tredimensionella (3D) lutningar16.
I vårt tillvägagångssätt genomför vi fotolys av bur aminosyror inom mikrofluidiska enheter för att studera beteendesvaret hos en bakteriepopulation till kontrollerade kemiska pulser, som blir nästan omedelbart tillgängliga genom photorelease. Användningen av ett mål med låg förstoring (4x) (NA = 0,13, fokusdjup som är cirka 40 μm) gör det möjligt att både observationen av befolkningsnivå aggregeringssvaret hos tusentals bakterier över ett stort synfält (3,2 mm x 3,2 mm) och mätning av rörelse på encellnivå. Vi presenterar två tillämpningar av denna metod: 1) frisättningen av en enda kemisk puls för att studera bakteriell ackumulering−avledning dynamik från enhetliga förhållanden, och 2i)frisättning av flera pulser för att karakterisera bakterieackumuleringdynamiken under tidsvarierande, rumsligt heterogena kemoattractant villkor. Denna metod har testats på de marina bakterierna Vibrio ordalii utför chemotaxis mot aminosyran glutamat17,men metoden är i stort sett tillämplig på olika kombinationer av arter och kemoattractants, liksom på biologiska processer bortom chemotaxis (t.ex. näringsupptag, antibiotikaexponering, kvorumavkänning). Detta tillvägagångssätt lovar att hjälpa belysa mikroorganismers ekologi och beteende i realistiska miljöer och att avslöja de dolda kompromisser som enskilda bakterier står inför när de navigerar efemära dynamiska gradienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av mikrofluidisk enhet för Single Chemical-pulse Experiment
- Designa kanalen med hjälp av datorstödd design (CAD) programvara och skriv ut den på en genomskinlighetfilm för att skapa fotomask(figur 1A).
- Tillverka befälhavaren genom mjuk litografi (under renrumsförhållanden).
- Rengör en kisel wafer (4 inches) i snabb följd med aceton, metanol och isopropanol, torka sedan med kväve. Grädda wafer i ugnen vid 130 °C i 5 min.
- Placera wafer i mitten av en spin-coater och häll SU-8 photoresist på wafer. Ramp hastigheten på spin-coater upp till 500 rpm över 5 s, och hålla på 500 rpm i 10 s. Ramp upp till den slutliga hastigheten över 10 s och hålla i denna hastighet i 30 s.
OBS: Det exakta värdet av den slutliga hastigheten beror på den riktade beläggningstjockleken och su-8 som används. - Efter spinnbeläggningsprocessen, grädda wafer vid 65 °C och sedan vid 95 °C. Låt wafer svalna vid rumstemperatur (RT) i minst 5 min.
OBS: Baktiden beror på den riktade tjocklekoch typ av fotomotstånd som används. I allmänhet bör wafer för varje 100 μm skikt bakas i 5 min vid 65 °C och 45 min vid 95 °C. - Placera fotomasken på rånet för att säkerställa att bara den region av intresse exponeras och polymeriseras. Utsätt för UV-ljus under den tid som rekommenderas i SU-8-handboken.
OBS: Här, med en exponeringsenergi på 200 mJ cm-2 vid en våglängd på 350 nm, exponerades wafer i 150 s. - Grädda wafer vid 65 °C och 95 °C under den tid som rekommenderas i SU-8 manualen.
OBS: I allmänhet bör wafer för varje 100 μm skikt bakas i 5 min vid 65 °C och 45 min vid 95 °C. - Doppa wafer i en bägare fylld med polymetylmetakrylat (PMMA) utvecklare för att få befälhavaren. Skaka försiktigt bägaren för att säkerställa att den opolymeriserade fotomotstånd tvättas ut. Grädda befälhavaren vid 200 °C för att ytterligare korslänka SU-8-skiktet.
- Förbered en polydimetylsiloxan (PDMS) blandning genom att kombinera elastomer med dess härdningsmedel (Table of Materials)med ett 10:1 förhållande i en bägare (här, 40 ml). Blanda kraftigt tills vätskan är homogen.
OBS: PDMS blandningen kommer att se ogenomskinlig eftersom bubblor genereras under blandningsprocessen.
VARNING: För att förhindra att huden kommer i kontakt med potentiellt farliga kemikalier eller biologiskt material, använd alltid en labbrock och engångsplasthandskar i hela protokollet och följ eventuella specifika säkerhetsprotokoll enligt Materialet säkerhetsdatablad (MSDS). - Degas PDMS blandningen i en vakuumkammare i 45 min vid RT. För att påskynda processen, regelbundet släppa vakuum för att spränga bubblor som bildas vid gränssnittet.
OBS: Avgasningen måste utföras inom 1 tim för att förhindra att PDMS-blandningen börjar botas. - Ta bort damm från befälhavarens yta med en trycksatt rengöringsmedel, häll sedan den avgaserade PDMS-blandningen på befälhavaren och grädda i en ugn vid 80 °C i 2 h.
OBS: Alternativt skulle bakning över natten (eller i minst 12 timmar) vid 60 °C uppnå samma härdade PDMS. - Skär PDMS med ett blad runt mikrostrukturerna (på ett avstånd av ca 5 mm) och skala sedan försiktigt pdms från befälhavaren.
- Hål för att fungera som inlopp och utlopp för mikrokanalen (här, ett inlopp och ett utlopp, se figur 1A). Se till att inget vidrör pdms undersida där funktionerna finns.
Protokollet kan pausas här. Mikrokanalen ska förseglas med tejp för att förhindra ansamling av damm och andra partiklar under lagring. - Bind PDMS-mikrokanalen till en glasrutschbana.
- Rengör en glasrutschbana noggrant med tvål, isopropanol och avjoniserat vatten. Låt glaset glida torrt eller använd tryckluft för att påskynda processen.
- Ta bort dammpartiklar genom att dabbing med tejp. Bind PDMS mikrokanal på den rena glasrutschbanan, omedelbart efter behandling av båda ytorna med plasma (genom att använda antingen ett coronasystem eller en plasma syrekammare) i 2 min.
- Placera den mikrofluidiska anordningen att värma på en kokplatta vid 80 °C i minst 1 h för att stärka den kemiska bindningen med glaset.
2. Tillverkning av den 3D-tryckta millifluidiska enheten för experimentet med flera pulser
- Designa 3D-formen med 3D-design programvara och skriv ut befälhavaren för PDMS mögel med en högupplöst 3D-skrivare(Figur 1B).
OBS: Se Materialförteckning för 3D-skrivare och mögelmaterial som används för att skapa befälhavaren. - Upprepa steg 1.3−1.4, rengör sedan befälhavarens yta genom att dabbing med tejp. Sätt befälhavaren på en skala, då, samtidigt som man undviker den centrala regionen av befälhavaren som kommer att ockuperas av membranet, häll på den exakta mängden obetjänta PDMS blandning (här, 23,4 g) för att få önskad höjd PDMS genom att matcha höjden på befälhavaren (här, 0,5 mm). Ta bort eventuella återstående bubblor med hjälp av tryckluft.
- Placera PDMS gjuten på befälhavaren i en ugn vid 45 °C för att baka i minst 12 timmar.
- Bind 3D PDMS mögel till en petriskål.
- Dra försiktigt av det härdade PDMS-skiktet och stanshålen för injektion av bakteriesuspensionen (figur 1C).
- Aktivera både ytan på en petriskål (90 mm x 15 mm) och PDMS mögel med syreplasma i 2 min. Bond PDMS mögel på Petri skålen. Tryck försiktigt formen till Petriskålen, men tryck inte på var funktionerna finns eftersom detta kan kollapsa förhörskammaren.
- Placera petriskålen bunden till PDMS 3D-formen i en ugn vid 45 °C i minst 12 timmar för att stärka den kemiska bindningen.
Protokollet kan pausas här.
- Membranytfunktionisering18
- Aktivera det nanoporösa polykarbonatmembranet (PCTE) i en plasmakammare för syre i 1 min vid RT.
VARNING: Undvik att använda ett koronsystem för plasmaaktivering eftersom det kommer att skada membranet. - Under en kemisk huva, späd en kommersiell lösning av 3-aminopropyltrietoxysilane (APTES) i avjoniserat vatten till 1 volymprocent (här, 40 ml), med hjälp av ett polypropenrör.
VARNING: APTES-lösningen är akut giftig (MSDS hälsoriskpoäng 3) och bör hanteras med extrem vård uteslutande under en kemisk huva med handskar. Byt handskar omedelbart efter hantering av APTES-lösning. APTES ångor är destruktiva för slemhinnorna och övre luftvägarna. Målorganen hos APTES är nerver, lever och njure. Om en rökhuva inte är tillgänglig måste en ansiktssköld och ansiktsandningsskydd implementeras. - Överför den utspädda APTES-lösningen i en petriskål och sänk ned det aktiverade membranet i APTES-lösningen i 20 min.
- Ta bort membranet från APTES-lösningen med pincett och placera det på en renrumstorka för att torka.
- Aktivera det nanoporösa polykarbonatmembranet (PCTE) i en plasmakammare för syre i 1 min vid RT.
- För tillverkning av PDMS mikrofluidiska kanaler som kommer att ligga på membranet och tillåta tvättning av bakteriearenan, upprepa steg 1.1−1.7.
- Bind PDMS tvättkanaler till det funktionaliserade membranet.
- Aktivera både PDMS tvättkanal och PCTE-membranet med en syreplasmakammare i 2 min.
OBS: Membranet, som kommer att vara inklämt mellan två PDMS lager, bör vara mindre än PDMS tvättkanal. - Omedelbart efter plasmabehandlingen, för det funktionaliserade membranet och PDMS tvättkanal i kontakt genom att försiktigt trycka på PDMS tvättkanal på membranet.
OBS: Använd inte överdrivet tryck i detta skede, eftersom det kan orsaka (irreversibel) fastsättning av membranet på kanalens tak, blockerar kanalen.
- Aktivera både PDMS tvättkanal och PCTE-membranet med en syreplasmakammare i 2 min.
- Sandwich membranet mellan två PDMS lager(Figur 1E).
- Aktivera både det bundna laminatet PDMS tvättkanal−PCTE-membran och 3D PDMS mögel tidigare bundna till petriskålen med en syreplasmakammare i 2 min. Ta dem i kontakt och tryck ihop.
- Placera petriskålen bunden till smörgåsstrukturen i en ugn vid 45 °C i minst 12 timmar för att stärka den kemiska bindningen.
Protokollet kan pausas här.
3. Cellkultur
- Odla en population av V. ordalii (stam 12B09 eller 12B09pGFP) över natten till 20 h i 2216 medium19 på en orbital shaker (600 rpm) vid 30 °C och skördeceller i slutet av exponentiell fas. För isolat som hyser pGFP, tillsätt spectinomycin (50 μg ml-1) för att upprätthålla plasmiden.
- Centrifug en 1 ml alikvot av celler vid 2500 x g i 3 min, ta bort supernatantoch åter avbryta cellerna i 1 ml filtrerat artificiellt havsvatten. Upprepa det här steget.
- Svälta populationen av V. ordalii på en orbital shaker (600 rpm) vid 30 °C för 3 timmar.
- Förbered en konstgjord havsvattenlösning på 10 mM (här, 1 ml) 4-metoxi-7-nitroindolinyl-bur- L-glutamat (MNI-bur-L-glutamat)och förvara vid -20 °C.
Obs: Skydda MNI-bur-L-glutamat lösning från omgivande ljus för att förhindra fotolys. - Späd cellerna 50x genom att åter avbryta de svultna cellerna i en konstgjordhavsvattenlösning på 1 mM MNI-bur- L-glutamat.
OBS: Detta kommer att säkerställa en slutlig bakteriell koncentration lägre än 5 x 107 ml-1 (det exakta värdet beror på den ursprungliga koncentrationen av celler i slutet av exponential, vilket vanligtvis är ~ 109 ml-1). Bakteriell koncentration uppskattades med hjälp av en spektrofotometer vid optisk densitet (OD) på 600 nm.
4. Kalibrering av Uncaging-protokollet
- Placera en droppe (20 μL) av en konstgjord havsvattenlösning av MNI-bur- L-glutamat20 vid en koncentration C0 = 10 mM på en glasrutschbana. Kapsla in droppen genom att täcka den med en cirkulär PDMS kammare (diameter d = 5 mm, höjd h = 250 μm).
- Placera glasrutschkanan på ett mikroskopstadium och exponera hela kammaren i 20 ms till en LED-balk med en våglängd på 395 nm (effekt 295 mW) med hjälp av ett 4x mål (numerisk bländare [NA] = 0,13).
- Öppna PDMS-kammaren och extrahera en droppe (1 μL) för analys med en UV-Vis-spektrofotometer.
- Upprepa steg 4.1−4.3 under olika led-belysningstid på 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (eller fram till den kemiska reaktionens mättnad) och 0 s (för att få bakgrunden). Replikera procedurstegen 4.1−4.4 minst 3x (här, 4x).
- Från absorptionsspektrumet, extrahera värdet vid 405 nm, som representerar toppen i absorptionsspektrumet av burmolekylen21. För att bestämma hastigheten k för den kemiska uncaging reaktionen av LED-exponering14,använd följande första ordningens kinetik ekvation för numerisk passform av experimentella data17
där C(t)är värdet av absorptionsspektrumet för lösningen vid 405 nm (efter borttagning av bakgrunden) med en uncaging tid på t sekunder. För små uncaging tid t så att kt 1, Eq. 1 kan förenklas till den linjära formuleringen
5. Enda kemisk-puls Experiment
- Håll den mikrofluidiska kanalen under vakuum i 20 min för att minska gaskoncentrationen inom PDMS så att bubblor är mindre benägna att bildas under fyllningsprocessen.
- Extrahera kanalen från vakuumpumpen och omedelbart införa den utspädda bakteriesuspensionen i 1 mM MNI-bur-L-glutamat i artificiellt havsvatten i mikrokanalen försiktigt med hjälp av en mikropipett för att undvika flagellar skador genom mekaniska klippkrafter (här tog hela fyllningsprocessen 5-10 s). Efter att ha fyllt kanalen med bakteriesuspensionen, sug lösningen i överskott med pappershandduk och försegla inlopp och utlopp med PDMS-kontakter genom att försiktigt trycka in dem i hålen.
OBS: På detta sätt förhindras vätskeflödet i kammaren. - Placera mikrokanalen på ett mikroskopstadium och flytta scenen för att ställa in synfältet i mitten av kanalen. Ställ in mikroskopet för att utföra avbildning i faskontrast (4x mål) med en bildhastighet på 12 fps.
OBS: Detta värde kan varieras men bör inte vara mindre än 10 fps för att möjliggöra återuppbyggnad av bakteriebanor genom bildanalys (se protokoll avsnitt 7). - Ställ in led-balkens hål på minsta bländare. Genom att ställa in kamerans exponeringstid på 5 s, spela in några bilder för att få exakta mätningar av LED-balkens rumsliga plats och storlek.
OBS: LED-ljuskällan ansluts till mikroskopets epifluorescensbelysning via vätskeljusguideanslutning. LED-balken påverkar inte videoinspelning, eftersom videoförvärv och LED-stimulering befalls oberoende via programvara. - Utför kontinuerlig avbildning under en total varaktighet på 10 min (20 min för den största kemiska pulsen), och samtidigt aktivera den fokuserade LED-balken vid 395 nm under önskad varaktighet (i detta experiment, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) vid en användardefinierad tidpunkt (här, 10 s efter starten av videoförvärvet) via mikroskopprogramvara. För att få flera repliker av samma process, flytta scenen för att registrera bakteriesvaret över olika positioner av mikrofluidiska kanalen. Replikera den här proceduren för varje pulsstorlek med hjälp av en ny mikrokanal.
OBS: Uncaging processen genererar en axisymmetrisk cylindrisk puls som sprider radiellt utåt i bildhanteringsplanet. - Utför separata experiment utan kemisk uncaging vid högre förstoring (20x mål, NA = 0,45) med en högre bildhastighet (50 fps) för att spela in opartisksimning rörelse av bakterierna.
6. Flera kemiska puls Experiment
- Håll den millifluidiska kammaren under vakuum i 20 min.
- Placera petriskålen som innehåller den millifluidiska kammaren på ett mikroskopstadium. Fyll kammaren under membranet med den utspädda bakteriesuspensionen (här tog hela fyllningsprocessen 10−15 s) GFP-fluorescerande V. ordalii i 1 mM MNI-bur- L-glutamatlösning i artificiellt havsvatten. Efter att ha fyllt kanalen med bakteriesuspensionen, sug lösningen i överskott med pappershandduk och försegla inlopp och utlopp med PDMS-kontakter genom att försiktigt trycka in dem i hålen.
OBS: På detta sätt förhindras vätskeflödet i kammaren. För att möjliggöra bättre visualisering av bakterier i denna inställning där avbildningen sker genom det nanoporösa membranet rekommenderas starkt att använda fluorescerande stammar i stället för den vilda typen (som används i experimentet med kemisk puls). - Fyll en spruta med en konstgjord havsvattenlösning på 1mM MNI-bur- L-glutamat och fäst slangen på tvättkanalens inlopp och utlopp ovanför membranet.
- Anslut slangen till en avfallsbehållare och se till att slangen är helt nedsänkt i vätskeavfallsbehållaren för att undvika trycksvängningar.
- Ställ in lämpligt flöde på sprutpumpen (här, 50 μL min-1) för att erhålla önskat medelvärde i tvättkanalen, vilket beror på kanalgeometrin.
- Starta sprutpumpen för att fastställa flödet i tvättkanalen ovanför membranet.
- Kör programvaran som styr LED-balken och mikroskopstadiet för att generera användardefinierade pulssekvenser på olika platser och med olika intensiteter.
OBS: Det kontinuerliga flödet av den konstgjorda havsvattenlösningen1 mM MNI-bur- L-glutamat i tvättkanalen ovanför membranet fyller på den bursammansatta lösningen och tvättar det använda mediet från bakteriearenan. - Spela in video med ett 4x-mål med jämna tidsintervall under en period av flera timmar och över flera sammanhängande platser för att täcka en stor yta (här, 1 cm x 1 cm, figur 1F).
7. Bildanalys och dataanalys
- Rekonstruktion av bakteriebanorna
- Från de filmer som spelats in med 4x mål, rekonstruera bakteriella banor med hjälp avspårningsprogram 17.
OBS: Dessa banor representerar 2D-projektioner av 3D bakteriell rörelse i mikrokanal. - Bestäm den radiella drifthastigheten för varje simningsindivid genom att projicera sin badhastighet över riktningen mot mitten av den kemiska pulsen (figur 2D). För visualisering av spatio-temporal dynamik en radiell drifthastighet, använd ett binningsgaller med rumslig storlek 75 μm x 75 μm och tidstidsfönster på 5−10 s intervall (figur 2D,E).
På grund av processens cylindriska symmetri kan data analyseras i polarkoordinater na och i genomsnitt över vinkeldimensionen (figur 3). - Bestäm spatio-temporaldynamiken i fördelningen av bakterier när de svarar på de kemiska pulserna (figur 2E).
- Från de filmer med högre upplösning som registrerats med 20x-målet under experimenten med en puls, extrahera fördelningen av badhastighet och körtid för bakteriepopulationen när de svarar på den kemiska pulsen (figur 4).
- Från de filmer som spelats in med 4x mål, rekonstruera bakteriella banor med hjälp avspårningsprogram 17.
- Uppskatta bakteriekoefficienten genom att överväga den bakteriella populationens avledning efter att chemotaxis har slutförts17 (här, för t > 300 s; figur 3).
- Uppskatta diffusionskoefficienten av glutamat genom att tillämpa Stokes-Einstein ekvation
där aminosyramolekylerna antas vara sfäriska partiklar med hydrodynamisk radie22rG, kB är Boltzmannkonstanten (1,38 x 10-23 m2 kg-2 K-1), T är temperaturen (296 K) och η är det konstgjorda viskositeten hos det konstgjorda havsvattnet (salthalt 36 g kg-1) vid 23 °C (10-3 Pa s)23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde mikrofluidiska och millifluidiska enheter (figur 1) för att studera bakteriella ackumuleringsprofiler under dynamiska näringsförhållanden. Bakteriella banor extraherades från inspelade videor som förvärvats genom faskontrastmikroskopi av ackumuleringsavledningdynamiken hos en bakteriepopulation efter en kemisk puls som släpptes av fotolys (figur 2 och figur 3). Genom att i genomsnitt miljontals banor, spatiotemporal dynamiken i radiell drift hastighet och bakteriell koncentration erhölls. Statistik som beskriver simningen i avsaknad av en kemisk gradient erhölls i separata experiment med högre rumslig och tidsmässig upplösning (figur 4).
Figur 1: Mikrofluidiska och millifluidiska anordningar för bakterieexperiment under dynamiska näringsförhållanden. (A) Fotomask av den mikrofluidiska kanal som används för att observera bakterieansamling en enda kemisk puls. (B) Fotomask av den mikrofluidikkanal som används för att tvätta den millifluidiska bakteriekammaren för flerpulsexperimenten. De små prickarna är mikropelare (200 μm i storlek) som hjälper bindningen av membranet till PDMS, och samtidigt bidra till att förhindra att membranet buckling eller kollapsar i mitten. (C) Konstruktion av den 3D-tryckta befälhavaren som används för att skapa bakteriekammaren. (D)PDMS-skiktet med mönstret av bakteriekammaren. (E)Den kompletta millifluidiska enheten (toppvy, PCTE-membran i vitt). (F)Schematisk för den millifluidiska anordningen för generering av dynamiska näringsförhållanden (sidovy). Optiska stråldiagram visas på undersidan av enheten, där en violett stråle (395 nm) utför uncaging av kemoattractant, medan en (oberoende) blå balk (470 nm) används för observation av fluorescerande bakterier (hysa pGFP) genom en sCMOS kamera, som fångar bakteriedensiteten (nedre mitten). Enheten placeras på en motoriserad scen (nederst till höger), som kan flyttas i x-y planet för att släppa kemiska pulser på användardefinierade positioner (styrs via NIS programvara, nederst till vänster). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bakteriereaktioner på en kemisk puls. ( A,B) Maximal intensitetsprojektion som visar bakterieposition (vit) över ett intervall på 0,5 s, visas (A) omedelbart efter, och (B) 40 s efter pulsfrisättningen (mål: 4x, NA = 0,13, Ph 2; videoinspelning på 12 fps). (C) Bakteriella banor (svart) visade 60 s efter pulsfrisättning. Den skuggade regionen representerar den kemiska puls som frigörs genom fotolys vid t = 0 s i mitten av synfältet (svart kors), som därefter sprider sig. Banor rekonstruerades med hjälp av anpassad egen programvara. - Jag har intetid med det här. Tidsdynamiken i radiella drifthastigheten (D) och av bakteriekoncentrationen (E) efter en pulsfrisättning i mitten av synfältet. I panel D motsvarar negativa värden för drifthastigheten (i blå färg) riktad kemotaktisk rörelse mot pulsens mittpunkt. Denna siffra har ändrats efter Brumley et al.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Spatio-temporala profiler av radiell drifthastighet och bakteriekoncentration efter en kemisk pulsfrisättning. ( A,B) Den radiella drifthastigheten (A) och bakteriekoncentrationen (B) som en funktion av tid och avstånd från mitten av en 35 μM glutamatpuls. I panel A motsvarar negativa värden för drifthastigheten (i blå färg) riktad kemotaktisk rörelse mot pulsens mitt. Värdena beräknades genom medelvärde över alla banor. Den svarta streckade linjen vid t = 250 s ungefär delimits perioden av aktiv chemotaxis (blå skuggning i panel A, region I), varefter cellerna diffusa isotropiskt utåt (grön skuggning i panel A, region II). (C) Bakteriekoncentration (omskalad över bakgrunden B0) som en funktion av avståndet vid t = 10, 30, 60 s efter skapandet av en diffus kemisk puls. Bakterier aggregat nära platsen för pulsen på grund av chemotaxis. (D) Bakteriekoncentration tar ~ 20 min för att koppla av till bakgrunden B0 genom bakteriell diffusion. Infällningen visar passformen hos diffusivespridningen med en diffusionskoefficient på DB = 165 μm2 s-1. Panelerna A, C och D har modifieratsfrån Brumley m.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Simstatistik för en bakteriepopulation i avsaknad av kemiska gradienter. (A) Banor representerar de tvådimensionella projektionerna av den tredimensionella bakterierörelsen i mikrokanalen. Bakteriella banor extraheras med hjälp av en anpassad in-house spårning skript. Här indikerar det blå korset början på spåret, och röda och gröna symboler indikerar omorienteringshändelser. Data spelades in på 50 fps med en 20x mål, NA 0,45. (BSannolikhetsfördelningen av uppmätt bakteriell simningshastighet (svart) tillsammans med en gammafördelning (blå). Eftersom djupet av fokus vid avbildning med en 20x mål (NA 0,45) är bara ett fåtal mikrometer24,de registrerade banorna är i huvudsak planar och mätningar av simning hastighet är inte partisk av projektionen. (C) Sannolikhetfördelning av tiden mellan successiva omorienteringar. Dessa uppgifter krävdes för att effektivt kalibrera en individuell baserad modell som tar hänsyn till omorienteringsmönstret, fördelningen av badhastigheten och organismernas omorienteringsstatistik. Denna siffra har ändrats från Brumley m.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör det möjligt för forskare att studera bakteriell chemotaxis under kontrollerade, dynamiska gradienter i mikro- och millifluidiska enheter, vilket möjliggör reproducerbara datainsamling. Den nästan ögonblickliga skapandet av kemiska pulser på mikroskala genom fotolys syftar till att reproducera de typer av näringspulser som bakterier möter i naturen från en rad källor, till exempel diffusive spridning av plymer bakom sjunkande marina partiklar25,eller näringsämne sprider sig från lysed fytoplankton celler26.
Vi presenterade två tillämpningar av denna metod: 1) frisättningen av en enda kemisk puls för att studera bakteriell ackumulering−avledning dynamik en början från enhetliga förhållanden, och 2) frisättning av flera pulser för att karakterisera bakterieackumuleringprofiler under icke-jämvikt näringsförhållanden. Den första ansökan är särskilt lämpad att karakterisera beteendemässiga svar av mikrober när de först stöter på en näringskälla. Under sådana förhållanden, där koncentrationen av kemoattractant molekyler är extremt låg, domineras den tidiga fasen av chemotaxis av stokastiska bindning-unbinding händelser chemoattractant molekyler till chemoreceptors17. Vår metod, genom att snabbt och exakt släppa en känd massa chemoattractant i en noll-näringsämnen bakgrund, erbjuder betydande fördelar jämfört med tidigare metoder för att karakterisera bakterierespons under dynamiska förhållanden27,28,29. Fördelar inkluderar att veta full fördelning av kemoattractant på alla platser och hela tiden (eftersom dess diffusitet är känd), och helt undvika generering av vätskeflöde som i sig är associerad med andra enheter, såsom mikroinjektor27 eller tre-inlopp geometrier30.
I den andra applikationen förekommer de kemiska pulserna i en stor quasi-2D-domän enligt en användardefinierad sekvens i tid och rum som är helt anpassningsbar via programvara, som kan användas för att införa slumpmässiga sekvenser eller särskilda mönster. Viktigt är att denna metod ger en kraftfull koppling mellan högupplöst beteendedynamik av bakteriell chemotaxis och näringsupptag över tidsskalor av sekunder och långsiktig dynamik, såsom tillväxt och potentiellt evolution. Bakteriearenan är betydligt större (2 cm x 2 cm) än det rumsliga utbudet av kemisk interaktion av bakterierna med en enda puls (från hundratals mikrometer för de minsta pulser till några millimeter för de största pulser). Nyckeln till underhåll av en låg kemisk bakgrund (mycket lägre än koncentrationen av de kemiska pulser vid deras frisättning) är införandet av nanoporösa PCTE membran inklämt mellan de två PDMS lager18. Genom att applicera ett vätskeflöde i den mikrofluidiska kanalen placeras högst upp på enheten, realiseras en kontinuerlig tvättning av de uncaged föreningarna och det använda mediet i bakteriearenan med hjälp av molekylär diffusion genom nanoporösa membran, utan att skapa flöde i testdelen av enheten där bakterier finns (figur 1).
Genom att modulera den fokuserade LED-strålen i tid, amplitud, storlek och geometri, ger photorelease-tekniken experimenteraren stor flexibilitet att generera olika typer av kemiska miljöer. Samtidigt, medan de tester som presenteras här utfördes under quiescent villkor, kan vår metod utökas ytterligare för att testa bakteriell chemotaxis under olika flödekonfigurationer. Genom att troget rekonstruera bakterieackumuleringdynamiken genom videomikroskopi genererar vår metod stora mängder högkvalitativa data som kan användas för att uppskatta statistiken över bakteriebeteende och det potentiella näringsupptaget av bakterieceller. Vår experimentella mikrofluidiska strategi, härma näringslandskap som bakterier kan möta under naturliga miljöförhållanden, möjliggör systematisk studie av födosök beteende mikrobiella arter som är viktiga i cykling av näringsämnen på makroskopiska skala2,3. Som sådan är den typ av data som genereras genom denna metod användbar för att effektivt kalibrera befolkningsupptagsgraden och bättre härleda näringskinetik i mesoskala ekosystemmodeller.
Tillverkningen av PDMS formar för att göra den stora bakteriearenan utfördes med hjälp av en kommersiell 3D-utskrift. Liknande resultat kan dock uppnås med hjälp av en avancerad 3D-skrivare i huset, med en upplösning på 50−100 μm som krävs för att lösa de minsta funktionerna i mikrokanaldesignerna. En jämn yta av det 3D-tryckta materialet för PDMS-formen krävs för att uppnå en god bindning mellan de gjutna PDMS och de andra ytorna på enheten (dvs. glas, polystyren, PDMS). För vår tillämpning, användningen av en polystyren Petri skålen (90 mm x 15 mm) som den nedre ytan av 3D-arenan presenterar två fördelar jämfört med användningen av en glasbild som vanligen används i mikrofluidik studier: för det första minskar den avsevärt fastsättningen av bakterieceller jämfört med en glasyta (även om fastsättning kan bero på den särskilda ytan egenskaper mikrob under övervägande); För det andra ger den sekundär inneslutning, vilket kan förhindra läckage av media över mikroskopiutrustning när det gäller spill. PDMS mögel härdning sprocessen sker vanligtvis vid en hög temperatur (70−80 °C), men i denna ansökan försöksmannen måste baka PDMS mögel vid en betydligt lägre temperatur (45 °C i det aktuella fallet, se Materialförteckning), under värmedeformation en och smälttemperaturen hos det material som används för 3D-utskrift av befälhavaren. Den lägre baktemperaturen förlänger avsevärt härdningsprocessen (över natten), men ändrar inte PDMS mekaniska och kemiska egenskaper.
Även om vår metod har tillämpats på en viss kombination av bakterier och kemoattractant, är metoden lämplig för att testa olika biologiska processer, inklusive upptag av näringsämnen eller antibiotikaexponering, och kan tillämpas på modellsystem av olika arter och kemoattractants, med tanke på att en myriad av molekyler har (eller kan) bur8. En potentiell begränsning beror på kostnaderna för kommersiellt tillgängliga burföreningar, men dessa kostnader är jämförbara med dem som uppstår vid användning av de molekylära sonder som vanligtvis används i biovetenskaperna för cellbärbarhet, räkning eller intracellulär färgning. Trots denna potentiella begränsning kan den föreslagna metoden hitta breda tillämpningar inom biofysiska och biomedicinska vetenskaper, för att karakterisera tidiga reaktioner och anpassningsdynamik en mikrobiell populationer vid encelligt upplösning till dynamiska kemiska gradienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar den första mikrotillverkning anläggningen på ETH Zürich. Detta arbete stöddes av en australisk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (till D.R.B.), en Gordon och Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (till RS), och en Swiss National Science Foundation bidrag 1-002745-000 (till R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
