Summary
Het doel van deze studie is om de rat orthotopische levertransplantatie model te wijzigen om beter te vertegenwoordigen menselijke levertransplantatie en verbetering van de overleving van de ontvanger. De gepresenteerde methode hersteld leverslagaderlijke instroom door het aansluiten van de donor lever gemeenschappelijke lever slagader aan de juiste lever van de ontvanger slagaderslagader.
Abstract
Het rat orthotopische levertransplantatie (OLT) model is een krachtig hulpmiddel om acute en chronische afstoting te bestuderen. Het is echter geen volledige weergave van menselijke levertransplantatie als gevolg van de afwezigheid van arteriële heraansluiting. Hier beschreven is een gewijzigde transplantatie procedure die de integratie van leverslagader (HA) reconnectie omvat, wat leidt tot een duidelijke verbetering van de transplantatie resultaten. Met een gemiddelde anhepatische tijd van 12 min en 14 s resulteert HA reconnectie in een verbeterde perfusie van de getransplanteerde lever en een toename van de overlevingskans op lange termijn van 37,5% naar 88,2%. Dit protocol omvat het gebruik van 3D-geprinte manchetten en houders om de portaalader en infrahepatische inferieure vena cava aan te sluiten. Het kan worden uitgevoerd voor het bestuderen van meerdere aspecten van levertransplantatie, van immuunrespons en infectie tot technische aspecten van de procedure. Door het opnemen van een eenvoudige en praktische methode voor arteriële herconnectie met behulp van een microvasculaire techniek, dit gemodificeerde rat OLT protocol nauw nabootst aspecten van menselijke levertransplantatie en zal dienen als een waardevol en klinisch relevant onderzoeksmodel.
Introduction
De wereldwijde last van leverziekte blijft toenemen, met een stijging van 30% van de sterfgevallen aan leverziekten van 2005 tot 20131,2. Levertransplantatie is vaak het enige beroep voor patiënten met een leverziekte in het eindstadium. De lever is het op één na meest getransplanteerde vaste orgaan en het aantal wereldwijd uitgevoerde levertransplantaties steeg van 2015 tot 2016 met 7,25%1,2. Ondanks de prevalentie zijn de overlevingskansen na transplantatie gestagneerd3,4,5. De overlevingskans van 15 jaar patiënt wordt gemeld op 53%, en de 20-jarige patiënt overlevingskans kan zo laag zijn als 21%3,5. Hoewel er spannende nieuwe immunobiologie-initiatieven zijn die kunnen leiden tot nieuwe behandelingen en verbeterde klinische resultaten, is er nog geen betrouwbaar klein diermodel om ze te testen.
Het rat OLT-model is veel gebruikt bij het onderzoek naar levertransplantatie, waaronder afstoting6,7,8,9,10, immuuntolerantie11, transplantatie-reperfusieletsel12, immunosuppressie13en galboomletsel14,15,16,17. Een nadeel van het model in zijn huidige vorm is echter de hoge postoperatieve morbiditeit en mortaliteit18,19. Dit is een ernstig nadeel dat in strijd is met de menselijke operatie, en het compromitteert het vermogen om klinisch relevante conclusies te trekken uit het model20.
Bovendien kan een groot deel van deze morbiditeit worden toegeschreven aan een afwezige of onvolmaakte leverslagader (HA) reconnectie18. Hoewel een kritieke stap in menselijke levertransplantatie, hebben technische problemen de neiging om HA heraansluiting in het rat OLT-model in gevaar te brengen. Als gevolg hiervan is galkanaal (BD) anastomose zwak en resulteert dit in hoge percentages gallekkage en BD-necrose21. Naast de hoge incidentie van galcomplicaties22verandert een afwezigheid van arteriële instroom de fysiologie van de transplantaat lever na transplantatie23, met hypoxie in de donorlevertransplantt24 en leverschade waargenomen bij ontstoken lobben19,25,26. Rat OLT zonder arteriële heraansluiting heeft ook de neiging om fibrose27te bevorderen. Het hieronder beschreven rat OLT-protocol pakt deze problemen aan door een eenvoudige HA-reconstructiestap op te nemen met een eerder gepubliceerde rat OLT-methode28, wat resulteert in het behoud van lever parenchyma en verbeterde overlevingskansen.
Levertransplantatie heeft drie fasen: (1) extractie van het levertransplantaat van de donor, (2) voorbereiding van de donorlevertransplantt, en (3) vervanging van de ontvangende lever met de levertransplantatie. De procedure omvat de manipulatie van vijf anatomische structuren: de suprahepatische inferieure vena cava (SHVC), portaalader (PV), infrahepatische inferieure vena cava (IHVC), leverslagader (HA) en galkanaal (BD).
OLT in de rat werd voor het eerst geïntroduceerd door Lee et al. met behulp van microsuture anastomose van de SHVC, PV en IHVC, en een pull-through techniek voor de BD29. Dit model werd later verbeterd door het gebruik van de twee-manchet techniek in 197930. Sindsdien zijn verschillende alternatieve technieken voorgesteld, waarbij de meerderheid zich richt op veneuze anastomose en met behulp van een twee-manchettechniek met een paar wijzigingen31. Hoewel HA-anastomose eerder in het rat OLT-model is beschreven met behulp van technieken zoals microsuture, manchet en intraluminale mouwen26,,31,32,33,34, vereisen deze technieken vaak zeer getrainde microchirurgische vaardigheden, veranderen de rattenfysiologie aanzienlijk en worden ze belemmerd door trombose en/of biliaire complicaties27,35.
Bovendien kan de keuze van chirurgische ingreep ook de anhepatische tijd beïnvloeden (tijd van PV-klemmen tot reperfusie van graft via de gereconstitueerde PV), wat cruciaal is voor het succes van rattenlevertransplantatie. In het bijzonder worden hoge overlevingskansen waargenomen met anhepatische tijden van 15-20 min36, en 30 min is de bovengrens voor succes37,38. Daarom is het doel van deze methode is om een minder invasieve en gemakkelijker aanneembare chirurgische rat OLT-model dat in staat is om de leverslagader opnieuw te verbinden implementeren, het bevorderen van efficiënte perfusie van de getransplanteerde lever, handhaven stroom naar de ontvanger galkanaal, en het behoud van de ontvanger fysiologische conditie.
Hier beschreven zijn alle stappen van dit herziene protocol, met inbegrip van de manipulatie van de coeliakie stam van de donor lever evenals het gebruik van 1) een 1,5 mm stent om een extraluminale mouw verbinding met de ontvanger juiste HA uit te voeren, 2) een lopende hechting voor de SHVC reconstructie, 3) twee 3D-geprinte plastic manchetten voor PV en IHVC reconstructie39,40, 4) een microvasculaire mouw heraansluiting voor de HA18,27,41 en 5) een eerder beschreven BD stenting techniek28. Twee extra stappen zijn ook opgenomen: een cold flush via de PV, en een antibioticum regime dat is gebaseerd op eerdere bevindingen17. Dit geoptimaliseerde OLT-protocol minimaliseert perioperatieve complicaties en morbiditeit en modelleert nauwer de chirurgische operatieprocedure die wordt gebruikt bij menselijke levertransplantatie.
Protocol
De studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van knaagdier behandeling en chirurgie, en de studie protocol werd goedgekeurd door de University Health Network Animal Care Committee (UHN AUP # 5840.3) en volgt de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care. De studie maakt gebruik van mannelijke Lewis ratten (stam LEW / SsNHsd), 12-14 weken oud, met een gewicht tussen 250-300 g.
1. Uitrustingsinrichting
- Houd een scherpe punt van 31 G vast met een naaldhouder en creëer een stompe L-vormige injector door de punt herhaaldelijk heen en weer te buigen totdat de punt eraf klikt. Met behulp van een plat metalen bestand, stomp en glad het einde van de injector.
- Snijd de poortader (PV) en infrahepatische inferieure vena cava (IHVC) manchetten van de 3D-geprinte basis met een scalpel (Aanvullend materiaal 1, Aanvullend Materiaal 2, Figuur 1, Aanvullende figuur 1).
OPMERKING: Een 3D-ontwerpsoftware wordt gebruikt om de manchetten en houders te ontwerpen, die worden afgedrukt op een 3D-printer (Tabel van materialen) met behulp van autoclalaveerbare hars39,40 (specificaties voor alle 3D-geprinte materiaal opgenomen in het aanvullende materiaal 1-10). - Gebruik een nieuwe scalpel om de 22 G katheter in een dubbelzijdige schuine buis (3,5 mm lang) te snijden. Met behulp van de scalpel, voorzichtig eth lijnen op het oppervlak van de galkanaal (BD) stent (niet snijden door de wand van de buis). Deze etsen voorkomen dat de banden uitglijden tijdens de procedure.
- Gebruik een nieuwe scalpel om de 24 G katheter in een eenzijdige schuine buis (2,0 mm in lengte) te snijden en verschillende krassen te creëren op het oppervlak van de nieuwe slagaderlijke stent.
OPMERKING: Voorkom vernauwing of occlusie van het lumen van de BD-stent door de toepassing van druk op de stent te vermijden. Als de stent wordt verkleind of afgesloten, zal de overleving van de ontvanger worden aangetast door biliaire obstructie.
- Snijd de poortader (PV) en infrahepatische inferieure vena cava (IHVC) manchetten van de 3D-geprinte basis met een scalpel (Aanvullend materiaal 1, Aanvullend Materiaal 2, Figuur 1, Aanvullende figuur 1).
2. Donoroperatie
- Stel een warmtekussen in op 37 °C en plaats het onder het chirurgische platform. Zet de temperatuurmonitor in, zodat de kerntemperatuur van de rat via een rectale sonde kan worden gevolgd. Stel het isoflurane anesthesie-apparaat in.
OPMERKING: Tijdens de operatie, controleer de diepte van anesthesie door het opmerken van de ademhaling, hartslag, kleuring van de organen / slijmvliezen, en de aanwezigheid van een pedaal terugtrekking reflexen. - Schik de chirurgisch gedrapeerde werkruimte met alle benodigde instrumenten en materialen (d.w.z. schaar, tang, gaas, heparine, oprolmechanismen, buikkussen, katoentips, 4-0 zijde, 7-0 zijde, 8-0 niet-absorbeerbare steriele hechting, en 10-0 niet-opneembare monofilament hechting) gemakkelijk geplaatst aan de zijkanten van het chirurgische platform.
- Schik het werkstation met alle oplossingen, inclusief ringer's lactaatoplossing en 300 IE natriumheparine (zie Tabel van materialen).
- Weeg het dier. Verdoven de donorrat door deze in de verdovingskamer te plaatsen met 5% isoflurane, 5 L/min luchtstroom en 70% FiO2 voor inductie. Wanneer de rat het bewustzijn verliest, verklein de verdoving tot 3% isoflurane, 0,5 L/min luchtstroom en 70% FiO2. Controleer op het gebrek aan pedaalrespons door de teen te knijpen.
- Bereid de huid van de buik. Verwijder met behulp van een elektrisch scheerapparaat de vacht van de ventrale kant. Observeer aandachtig de ademhaling van de donor tot het een stabiel en diep tempo bereikt.
- Leg de chirurgisch gedrapeerde rat, zodat de ventrale kant is gericht op het plafond. Plaats de neus in een anesthesie aaseters met 3% isoflurane, 0,5 L/min luchtstroom, en 70% FiO2. Bereid de buikwand met povidone-jodium, werken vanaf de middellijn naar buiten, gevolgd door 70% ethanol.
- Maak een incisie van het xiphoid-proces naar de schaamsympfyse met behulp van een rondgepuntige chirurgische schaar en verbeter vervolgens de blootstelling met een bilaterale dwarsincisie. Stop elke bloeden uit de buikwand met behulp van een bi-polaire elektrochirurgische eenheid voor cautery. Na de incisie, vermindering van het onderhoud isoflurane tot 2%, 0,5 L/min luchtstroom, en 70% FiO2.
OPMERKING: Pas de isoflurane vaporizer aan om een ademhalingssnelheid van ongeveer één adem per seconde te bereiken en vergeet niet om regelmatig de diepte van anesthesie te beoordelen in de loop van de operatie. - Plaats een 4-0 zijden steek in het xiphoid proces en gebruik de hechting om de borstwand cephalad in te trekken. Tape de zijden draad aan de bovenkant van de structuur die de anesthesie aaseters op zijn plaats houdt. Houd de lichaamsholte van de donorrat open met 3D-geprinte oprolmechanismen (zie Aanvullend materiaal 3)aan weerszijden van de buik (oprolmechanismen worden op hun plaats gehouden met elastiekjes aan magneten op het chirurgische platform).
OPMERKING: Muggen tangen kunnen ook worden gebruikt om het xiphoid proces te grijpen en de kopvorm in te trekken. Fix de mug tang op zijn plaats met behulp van tape. - Gebruik een niet-geweven gaasspons (4 cm x 4 cm) gedempt door ringer lactaat oplossing om de dunne en dikke darmen omsluiten. Gebruik een kleine, natte, niet-geweven gaasspons (2 cm x 4 cm) om de lever voorzichtig te bedekken.
- Plaats een klein gerold gaasje onder de buik om de buik op te tillen en de blootstelling van de suprahepatische inferieure vena cava (SHVC) te verbeteren.
- Snijd de falciforme ligament door. Scheid de linker diafragmatische ader van de SHVC met behulp van micro-tangen. Ligate de linker diafragmatische ader met 7-0 zijde, dicht bij de SHVC.
OPMERKING: Gebruik de kleine, natte, niet-geweven gaasspons, gedempt met Ringer's lactaat en geplaatst op de lever, om de lever voorzichtig uit de buurt van het xiphoid-proces te trekken en de linker diafragmatische ader bloot te stellen. - Snijd de linker driehoekige en de gastro-hepatische ligamenten met ronde-getipt scharen.
- Bloot de caudate kwab door voorzichtig terug te trekken de linker en middelste lobben naar het xiphoid proces met behulp van een kleine, natte, niet-geweven gaas spons. Laat het ligament dat de caudatekwab scheidt van de rest van de lever vrij met een rondgepuntige schaar.
- Verdeel en scheid de hepato-slokdarmligament met behulp van een bipolaire elektrochirurgische eenheid dicht bij de slokdarm.
OPMERKING: Verleg de dunne en dikke darmen voorzichtig naar de linkerkant van de buikholte en bedek ze met nat, niet-geweven gaas. - Ontleed het retroperitoneum en het vet dat de IHVC bedekt. Bloot stellen en isoleren van de IHVC naar de linker nierader.
- Verplaats de IHVC enigszins met een wattenstaafje om eventuele kleine aders die in de rechterkant van het IHVC samensmelten en vervolgens te cauteren, met behulp van de bipolaire elektrochirurgische eenheid. Ook cauterize alle lumbale aderen samenvoegen in de IHVC.
- Verdeel de rechter suprarenale (bijnier) ader over twee 7-0 zijden ligaturen, dicht bij het IHVC. Bevrijd de lever van zijn achterste ligamenten door deze onder zachte tractie te snijden.
- Isoleer de juiste nierader van de juiste nierslagader en van het naburige weefsel met behulp van een fijne cautery. Verzegel de juiste nieraderopening met een 8-0 niet-opneembare steriele ligatuur.
- Maak het vet dat de PV bedekt om de pylorische ader (rechter maagader) en de miltader te lokaliseren op de punten waar ze de PV samenvoegen. Ligate deze aderen met 7-0 zijde, het versterken van de zijkant het dichtst bij de PV met een 8-0 niet-opneembare steriele hechtingsteek. Verdeel de aderen over de banden.
OPMERKING: Stel de PV bloot door klein, nat gaas te gebruiken om de twaalfvingerige darm terug te trekken. Het inbrengen van de manchet is gemakkelijker als vet wordt losgemaakt van de PV, die ook stenose van de PV-manchet voorkomt. - Injecteer 300 IE heparine natrium in de IHVC, verdund tot 1 mL van normale zoutoplossing, met behulp van een 1 mL spuit (31 G naald).
- Maak een incisie 5 mm onder de BD-splitsing en steek de BD-stent in de gemeenschappelijke BD. Zet de stent vast met een 7-0 zijden ligatuur 1 mm boven de incisie. Een extra das kan worden gemaakt onder de incisie, die 10 mm onder de splitsing. Zodra de stent is beveiligd, snijd de BD tussen deze twee banden.
- Knip nooit de BD of de juiste leverslagader (HA). Plaats een 10-0 niet-opneembare steriele chirurgische monofilament hechting steek op de 3 uur positie in de BD bij de incisie als een marker om te voorkomen dat draaien na reconnectie.
- Leg de juiste HA bloot en verdeel de gastroduodenale slagader (GDA) over twee 7-0 zijden ligaturen. Bloot de linker maagslagader, miltslagader, en coeliakie stam. Bind de drie slagaders zowel distally en dicht bij hun starts.
- Snijd de linker maagslagader, miltslagader, en coeliakie stam tussen de slagader banden. Injecteer langzaam 20 mL koude (4 °C) Ringer lactaatoplossing in de PV, met behulp van een spuit van 20 mL met een naald van 21,5 G. Snijd de vena cava onder het punt waarop de linker nierader fuseert met de IHVC om spoeluitstroom mogelijk te maken.
LET OP: De naald moet zoveel mogelijk van het hilum worden bewaard. De donorleverkoud perfusie moet tussen 1-2 min duren. Tijdens het spoelen van de lever, gebruik de andere hand te spuiten koud Ringer lactaat op het leveroppervlak. - Snijd de PV-stam onder de miltader na de flush. Snijd de IHVC net boven de linker nierader. Snijd de SHVC direct naast het middenrif.
- Snijd de ligamenten en bindweefsel tussen de lever en retroperitoneum.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er voldoende lengtes van de voorste en achterste SHVC-wanden zijn om de bovenste cavalanose te vergemakkelijken. Het is van cruciaal belang om direct naast het middenrif te snijden om zoveel mogelijk lengte te behouden. - Nadat de lever uit de buik is verwijderd, plaats deze snel in een schaal gevuld met de lactaatoplossing van 4 °C Ringer. Leg de schotel op een ijskussen om een koude temperatuur te behouden.
- Gooi de resten van de donorrat weg, volgens de institutionele richtlijnen.
3. Donorleverpreparaat ("achterbank")
- Vul de koude petrischaal met een voldoende volume van 4 °C Ringer lactaatoplossing om de donorlever onder te dompelen. Draai voorzichtig de donorlever die voorzichtig in de schaal zweeft, zodat het inferieure oppervlak naar boven kijkt. Doe de manchetten voor PV en IHVC(respectievelijk Aanvullend Materiaal 1 en Aanvullend Materiaal 2)in de schaal.
- Trek de PV door de PV manchet en vouw het uiteinde van de ader over de manchet. Bind de PV stevig rond de manchet met 7-0 zijde. Spoel de PV door met 10 mL van 4 °C Ringer's lactaatoplossing.
- Herhaal stap 3.2 met de IHVC, zonder de flush.
- Verwijder het vetweefsel rond de coeliakie. Vorm een grotere arteriële mouw manchet door het opensnijden van de splitsing van de coeliakie stam, miltslagader, en linker maagslagader (Figuur 2A).
OPMERKING: Het is moeilijk om de arteriële stent in de gemeenschappelijke HA te steken. Rek en strek de slagader uit met tangen meerdere malen voor het invoegen van de stent. Zorg ervoor dat de schuine kant van de stent naar boven gericht is en dat de slagader niet gedraaid is (figuur 2B). - Doe de 1,5 mm lengte 24 G arteriële stent in de donor gemeenschappelijke HA via de arteriële manchet. Zet de stent vast met een 8-0 polypropyleenligatuur (figuur 2C) en spoel de stent door met ringer lactaatoplossing (figuur 2D).
- Plaats een microklem (4-6 mm lang) op de proximale IHVC, die bedoeld is om bloedverlies na portalreperfusie te voorkomen en luchtembolie te voorkomen.
- Draai de lever en bloot zijn superieure kant. Twee 8-0 invoegen polypropyleen taper punt hechtingen op de laterale en mediale randen van de SHVC.
- Houd de lever op 4 °C zodat deze klaar is voor transplantatie in de donor.
4. Werking van de ontvanger
- Raadpleeg de sectie donoroperatie hierboven en herhaal stap 2.1-2.4.
OPMERKING: Mannelijke Lewis ratten in de leeftijd van 12-14 weken oud worden hier gebruikt, met een gewicht van 5-20 g zwaarder dan de donoren. Tijdens de operatie, controleer de diepte van anesthesie door het op te wijzen op de ademhaling, hartslag, kleuring van de organen / slijmvliezen, en de aanwezigheid van een pedaal terugtrekking reflexen. - Leg de chirurgisch gedrapeerde rat met zijn ventrale kant naar boven gericht. Plaats de neus in de anesthesie aaseters voor isofluraan inademing. Bevochtig de ogen met opthalamisch smeermiddel. Bereid de buikwand eerst met providone-jodium, dan met 70% ethanol.
- Injecteer 5 mL van ringer lactaatoplossing onderhuids aan beide onderzijde van de buikwand van de ventrale. Gebruik de assistent van een chirurgische assistent om 0,5 mL van 200 mg/kg piperacilline natrium intramusculair in de linker buikwand te injecteren voor laparotomie. Bovendien, toedienen 0,5 mL van 10 mg/mL bupivacaine onderhuids in de rechter buikwand.
OPMERKING: Beheer dezelfde dosis piperacilline natrium 1x/dag gedurende 3 dagen postoperatief. - Bereid de buikwand opnieuw met providone-jodium eerst en vervolgens met 70% ethanol. Maak een middellijn incisie van de sternale xiphoïde tot 1 cm boven de schaambeen symphysis. Afname isofluraan tot 2%, 0,5 L/min luchtstroom, en FiO2 70% voor het onderhoud van anesthesie na het maken van de incisie.
OPMERKING: Muggen tangen kunnen worden gebruikt om het xiphoïde proces te grijpen en de kopbeen in te trekken. Fix de mug tang op zijn plaats met behulp van tape. De lichaamsholte wordt opengehouden door 3D-geprinte oprolmechanismen (zie Aanvullend Materiaal 3)aan beide zijden met elastiekjes die magnetisch aan het chirurgische platform worden vastgehouden. - Wikkel de dunne en dikke darmen met een natte, niet-geweven gaasspons (4 cm x 4 cm) gedempt met Ringer lactaatoplossing. Gebruik een kleine (2 cm x 4 cm), natte, niet-geweven gaas spons gedempt met ringer lactaat oplossing om voorzichtig te dekken de lever.
- Plaats een kleine 3D-geprinte steunstoot (achterhouder; zie Aanvullend Materiaal 4) onder de buik van de rat om de blootstelling van de SHVC te verhogen door de draai te buigen. Dit kan veilig worden uitgevoerd bij ratten en wordt uitgevoerd door een chirurg assistent.
- Snijd de falciforme ligament en gebruik de kleine, natte niet-geweven gaasspons om de lever voorzichtig weg te trekken van het xiphoid-proces en de linker diafragmatische ader bloot te stellen. Scheid de linker diafragmatische ader van de SHVC met behulp van micro-tangen. Ligate de linker diafragmatische ader met 7-0 zijde dicht bij het middenrif.
- Snijd de linker driehoekige en de gastro-hepatische ligamenten met ronde-getipt scharen.
- Trek de linker- en middelste lobben voorzichtig naar het xiphoid-proces met een kleine, natte niet-geweven gaasspons om de caudate kwab te onthullen. Verbreken het ligament dat de caudate kwab scheidt van de rest van de lever.
- Verdeel de hepato-slokdarmligament en stolleer eventuele bloedingspunten met de bipolaire elektrochirurgische eenheid, dicht bij de lever. Snijd de ligamenten op het achterste aspect van de lever.
- Trek de dunne en dikke darmen voorzichtig naar de linkerkant van de buikholte en bedek ze met nat, niet-geweven gaas.
- Ontleed het retroperitoneum en vet op de IHVC om de IHVC bloot te leggen en te isoleren tot aan de juiste nierader. Verplaats de IHVC enigszins met een wattenstaafje en cauter alle kleine aders die in de rechterkant van het IHVC samensmelten, met behulp van de bipolaire elektrochirurgische eenheid. Op dezelfde manier, cauterize alle lumbale aderen het invoeren van de IHVC.
- Verdeel de rechter suprarenale (bijnier) ader over twee 7-0 zijden ligaturen. Bevrijd de lever van zijn achterste ligamenten door ze onder zachte tractie te snijden.
- Gebruik kleine, natte gaas gedempt met Ringer lactaat oplossing om de twaalfvingerige darm in te trekken en bloot de PV. Los vet los van de splitsing van de PV en pylorische ader.
- Verdeel de BD 0,5 cm onder zijn hilare splitsing en steek een BD-stent in de distale gemeenschappelijke BD. Zet de stent in positie met een 7-0 ligatuur ongeveer 0,2 mm onder de incisie. Een extra das kan worden geplaatst boven de incisie, dicht bij de splitsing. Snijd de BD dicht bij de lever, maar distaal aan de das.
- Scheid de BD met tangen en vermijd het knippen van de BD of de juiste HA. Plaats een 10-0 niet-opneembare monofilament (bijvoorbeeld ethilon) steek op de 3 uur positie in de BD als een marker om te voorkomen dat draaien na het opnieuw verbinden.
- Bloot de juiste HA en de splitsing van de gemeenschappelijke HA en GDA. Bloot de linker HA, midden HA, en rechts HA. Bind de drie slagaders distaal aan de CHA bifurcatie en snijd de slagaders dicht bij de lever, boven de banden.
- Zet een lang dun gaas achter de SHVC.
- Plaats een 3D-geprinte IHVC-houder of "handvat" (Cava 150g 2.1; zie Aanvullend Materiaal 5) achter het IHVC en naai de uiteinden van de 3D-geprinte "handvat" samen met behulp van 10-0 niet-opneembare monofilament suture (figuur 3A).
- Plaats een 3D-geprinte PV-houder of "handvat" (Porta 1.4.1-see Additional Material 6) achter de PV, direct inferieur aan de lever, en naai de uiteinden van de 3D-geprinte "handvat" samen met behulp van 10-0 niet-opneembare monofilament suture.
- Bind losjes een 7-0 zijden ligatuur onder beide 3D-geprinte houders (IHVC en PV) (figuur 3A).
- Klem de IHVC net boven de juiste nierader, die nog steeds onder de 3D-geprinte cavalhouder moet liggen.
- Klem de PV net boven de pylorische ader, die onder de 3D-geprinte PV-houder moet liggen. Neem de anhepatische tijd op, die op dit punt begint. Daling tot 0,5% isoflurane, 0,5 L/min luchtstroom, en 70% FiO2 voor het onderhoud van anesthesie.
- Spoel 2 mL van 37 °C Ringer lactaatoplossing door de splitsing van de PV met behulp van een 3 mL spuit met een 27 G naald bevestigd.
- Klem de SHVC boven de lever met een Kitzmiller klem. Snijd onder dezelfde klem, verblijf zo dicht mogelijk bij de lever mogelijk.
- Snijd boven de 3D-geprinte houders voor zowel de PV als IHVC(figuur 3A). Verwijder de lever van de ontvanger. Oriënteer de donorlever zorgvuldig en positioneer deze in de lichaamsholte van de ontvanger op een zodanige wijze dat de bovenste caval anastomose kan worden gecreëerd.
- Een 8-0 gebruiken polypropyleen lopende hechting aan shvc van de donor met shvc van de ontvanger in de buurt van het middenrif. Ten eerste, plaats verblijf hechtingen van 8-0 polypropyleen links en rechts aspecten van de donor en ontvanger SHVC. Bind deze vervolgens vast aan de buitenkant van de adermuur.
- Gebruik de linker 8-0 polypropyleen om de achterste wand van de SHVC van links naar rechts te borduren en naar rechts te binden 8-0 Polypropyleen. Gebruik de linker 8-0 polypropyleen om de voorste wand van de SHVC-anastomose van links naar rechts te borduren, waardoor de laatste twee derde van de hechtingslijn losblijft. Spoel door met 20 mL van Ringer's lactaat tussen de losse steken, terwijl u ervoor zorgt dat eventuele luchtbellen worden geëxtraheerd.
- Draai de losse steken vast en maak een stropdas aan de buitenkant van de SHVC. Snijd de resterende 8-0 polypropyleen hechting.
OPMERKING: De clip houdt de SHVC van de ontvanger op zijn plaats, waardoor het gemakkelijker wordt om de donor en de SHVC van de ontvanger aan elkaar te naaien. Nota van de duur van SHVC-anastomose. Op dit punt zijn de porta handgrepen bevestigd aan de houder arm apparaat (houder arm McGil + houder mini arm LAB + houder arm zacht deel 1.3; zie Aanvullend Materiaal 7, Aanvullend Materiaal 8, en Aanvullend Materiaal 9, respectievelijk), direct inferieur aan de lever. Dit apparaat wordt ondersteund door een 3D-geprinte houderbasis (houderbasis 3.1; zie Aanvullend Materiaal 10). - Steek de PV manchet(Aanvullend Materiaal 1) van de donor in de ontvanger PV en draai de 7-0 zijden das. Spoel de PV van de donor en ontvanger door met ringer's lactaatoplossing opgewarmd tot 37 °C voor de verbinding.
- Verwijder de atraumatische klem uit de SHVC (eerst), dan is de microvasculaire clip voor de PV (tweede). De lever opnieuw doornemen met warm bloed; op dit punt is de anhepatische fasetijd beëindigd. Neem deze keer op.
- Giet 10 mL van warme Ringer lactaat oplossing op de top van de lever te warmen. Verwijder de 3D-geprinte houders met een schaar met ronde punt (snijd de bevestigingssteek).
- Steek de donor IHVC manchet(Aanvullend Materiaal 2) in de ontvanger IHVC en veilig met een 7-0 zijden stropdas. Verwijder eerst de donor-IHVC-clip en vervolgens de clip van de ontvanger(figuur 3B). De cava is bevestigd aan het houderapparaat en de houderbasis zoals hierboven beschreven;
- Verwijder de 3D-printerhouders (porta en cava) met een schaar met ronde punt (snijd de bevestigingssteek; Figuur 3C), resulterend in een aangesloten IHVC (figuur 3D).
- Zorgvuldig onderzoeken het gebied rond de lever voor een bloeding. Instil 3 mL van 37 °C Ringer lactaat oplossing in de lichaamsholte.
- Arteriële anastomose: snijd het gedeelte van de coeliakieboom van de donor af die verder reikt dan de stent.
- Klem de juiste HA van de ontvanger en snijd de das aan het einde af. Snijd extra weefsel rond het vat af(figuur 4A). Spoel met de lactaatoplossing van Ringer de lumen van zowel donor- als ontvangervatuiteinden door.
- Trek de ontvanger juiste HA in de mouw van de donor HA stent om de HA anastomose te bereiken. Plaats een 10-0 ethilon door het linkeraspect van de (donor) HA, 2,5 mm boven de distale opening van de stent (van buiten naar binnen), en vervolgens door het einde van de stent, met 10-0 ethilon (4 cm lengte) geleid door een gebogen naald(figuur 4B).
- Transfix de ontvanger juiste HA 0,5 mm onder de opening van het vat, het plaatsen van de steek eerst (van binnen naar buiten) aan de linkerkant van het vat, dan (van buiten naar binnen) aan de rechterkant van de slagader.
- Plaats de hechting door de rechterwand van de (donor) HA van binnen naar buiten, op een afstand van de stent opening identiek aan de originele steek. Trek aan de twee uiteinden van de 10-0 niet-absorberende monofilament, die de ontvanger juiste HA omhoog en in de HA stent (Figuur 4C) zal glijden.
LET OP: Let op het pompen van bloed. Een optie is om de donor GDA snijden om te bevestigen dat bloed door de anastomose pompt. Zorg ervoor dat u de slagader opnieuw bindt voordat u naar de volgende stap van de procedure gaat als de GDA wordt doorgesneden. - Bind de 10-0 niet-opneembare monofilament met zichzelf, over de donor HA (Figuur 4D). De arteriële anastomose is nu voltooid.
- Biliaire anastomose: plaats een stropdas losjes rond de ontvanger BD en stent (Figuur 5A), verwijder dan de BD-stent. Spoel het BD van zowel ontvanger als donor door voordat de biliaire verbinding is voltooid.
- Plaats de BD-stent van de donor in de galbuis van de ontvanger(figuur 5B) en draai de das aan die eerder rond de ontvanger BD(figuur 5C) werd geplaatst.
- Breng de darmen terug naar de lichaamsholte. Giet 2 mL van 37 °C Ringer lactaatoplossing in de holte om het door te spoelen. Week een deel van de oplossing met gaas.
- Zorg ervoor dat de darmen terug zijn in hun oorspronkelijke positie voor het naaien van de pariëtale buikvlies en de huid met 5-0 monocryl.
- Sluit de incisie in twee lagen met 5-0 monocryl. Injecteer 0,5 mL van 0,5% bupivacaine rond het genaaide pariëtale buikvlies en herhaal dit zodra de huid aan elkaar is genaaid.
- Zachtjes inswaddle de ontvanger rat in een papieren handdoek bij het overbrengen naar de kooi. Geef het dier vrije toegang tot water en voedsel uit de tijd van ontwaken. Houd een warm water-circulerende deken onder de helft van de kooi voor 24-38 uur. Eén rat wordt tijdens de onmiddellijke postoperatieve periode in één kooi aangewezen.
5. Postoperatieve zorg
- Week voedsel pellets in water en leg ze in een petrischaal op de kooivloer.
- Controleer de hartslag, ademhalingssnelheid en huidskleur van de rat.
- Beheer piperacilline op postoperatieve dagen 1, 2 en 3. Beheer buprenorfine onderhuids en controleren op tekenen van pijn, zoals eventuele gedragsveranderingen, lethargie, ungroomed bont, depressie, verminking, of verlies van eetlust voor de eerste 72 uur.
OPMERKING: Pijn wordt ten minste 2x per dag beoordeeld gedurende 3 dagen na transplantatie, daarna ten minste 1x per dag.
Representative Results
Bij het vaststellen van een niet-HA anastomosis rat OLT-model met behulp van een eerder beschreven protocol28, ons team waargenomen 50% en 37,5% overlevingskansen op 21 dagen en 60 dagen na de operatie, respectievelijk. Hoewel hoge percentages van overleving op lange termijn zonder HA-anastomose zijn gemeld door sommige groepen28,deze vroege resultaten wijzen op de nadelen van het niet hebben van arteriële instroom. De geoptimaliseerde HA-heraansluitingsprocedure heeft daarentegen de overleving op lange termijn aanzienlijk verhoogd van 37,5% naar 88,2% (p = 0,015) (figuur 6).
Histologische analyse van een representatieve subgroep van getransplanteerde dieren zonder HA-heraansluiting (op dag 6 en 13 na de operatie) vertoonde tekenen van hypoxische leverletsel met centrilobulaire necrose(figuur 7). Uitgebreide levernecrose werd geassocieerd met enorm verhoogde niveaus van alanine aminotransferase (ALT) en aspartaat aminotransferase (AST) bij deze dieren(figuur 7). In tegenstelling, getransplanteerde ratten met HA reconnectie toonde geen tekenen van leverletsel, en histologische analyse bleek een normale lever parenchyma structuur met georganiseerde acini, lobules (bijvoorbeeld, centrale ader en portaal triades met leverader), slagaders, en galwegen (Figuur 7).
Hoewel de gemiddelde anhepatische tijd in de loop van 23 afzonderlijke bewerkingen aanvaardbaar was (12 min en 14 s [± 78 s]), is het nog steeds mogelijk dat de overleving in het niet-HA heraansluitingsmodel uiteindelijk kan worden verbeterd met meer praktijk. Het is echter vermeldenswaard dat drie van de vier dieren getransplanteerd zonder HA reconnectie (die werden gevolgd voor de lange termijn overleven) werden geëuthanaseerd als gevolg van nood op de dagen 56, 96, en 111 na de operatie. Bovendien, histologische analyse van de levers bleek reactieve veranderingen na hypoxische leverletsel met inbegrip van gemarkeerde galkanaal proliferatie, periportale fibrose en ontsteking, en vervormde lever parenchyma (Aanvullende figuur 2). De aanwezigheid van morfologische kenmerken van hypoxische leverletsel bevestigt de bevindingen dat HA reconnectie belangrijk is voor een efficiënte leverperfusie en een normale functie.
Figuur 1: Schematische weergave van het 3D-geprinte manchetontwerp voor portaalader en infrahepatische inferieure vena cava. De eerste das wordt aangedraaid in de groef (ii) die het dichtst bij het handvat (iii) ligt, en de tweede das wordt aangedraaid in de groef (i) het verst van het handvat verwijderd. De buitendiameters zijn (iv) 2,38 mm voor de poortader (PV) en 2,15 mm voor de infrahepatische inferieure vena cava (IHVC). De binnendiameters zijn (v) 1,74 mm voor de PV en 1,38 mm voor de IHVC. De lengtes zijn (vi) 2,60 mm voor de PV en 2,15 mm voor de IHVC (exacte specificaties voor alle 3D-geprinte materialen zijn te vinden in Aanvullende Materialen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Hepatische slagader stent inbrengen in graft. (A) Het openingseinde van de coeliakie stam (i) wordt verbreed door het snijden van de miltslagader aan de linker maagslagader, die de splitsing van de gemeenschappelijke HA blootstelt. ii) De BD-stent is gebonden vóór de extractie van de donorlever. iii) De PV-manchet en iv) IHVC-manchet worden ingebracht en gebonden door de uiteinden van de vaten over de manchet te vouwen. (B) i) Om de HA-stent in te voegen, wordt de blootgestelde gemeenschappelijke HA meerdere keren uitgerekt met tangen. (C) (i) De HA-stent is veilig in de gemeenschappelijke HA geplaatst en gebonden met 8-0 prolene. (D) i) De HA-stent wordt gespoeld met (ii) Ringer lactaatoplossing (BD = galkanaal, IHVC = infrahepatische inferieure vena cava, HA = leverslagader). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Infrahepatic inferieure vena cava verbinding met behulp van 3D-geprinte houder. (A) De (i) PV is verbonden met dezelfde techniek als de IHVC-verbinding. Het transplantaat is (ii) geklemd boven de (iii) IHVC manchet. De ihvc-opening van de ontvanger wordt (iv) aan de zijkanten van de opening gehecht aan een 3D-geprinte houder om deze open te houden. Een losse (v) 7-0 zijde is gebonden rond de ontvanger IHVC. (B) De manchet van het transplantaat IHVC wordt (i) ingevoegd in de ontvanger IHVC. De losse das is nu aangedraaid. (C) De klem wordt verwijderd en (i) de 3D-geprinte houder wordt met een schaar losgemaakt. (D) Een extra (i) 7-0 zijde is gebonden rond de verbinding, zo niet veilig, maar meestal een stropdas is voldoende (PV = portaal ader, IHVC = infrahepatische inferieure vena cava). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Microvasculaire mouwverbinding van de leverslagader. aA) i) De BD-stent is niet verbonden met de ontvanger. ii) De HA-stent wordt in het transplantaat geplaatst, dat is gekoppeld aan de eigen HA van de (iv) ontvanger. iii) De PV is aangesloten. (B) 10-0 ethilon met een (i) gebogen naald wordt getrokken door de HA stent aan de zijkanten van de ontvanger HA opening einde. (C) De 10-0 ethilon wordt teruggetrokken door de HA stent; daarom wordt de juiste HA van de ontvanger als een mouw door de stent getrokken. (D) (i) Een gelijkspel met 10-0 ethilon wordt gemaakt zodra de juiste HA van de ontvanger in de stent wordt getrokken om het gedeelte dat eerst door de HA-stent loopt. (E) Hier wordt een schema van de HA-anastomose beschreven in (B), (C) en (D) (BD = galkanaal, HA = hepatische slagader, PV = poortader). * Het openingseinde van de coeliakie stam wordt verbreed door het snijden van de miltslagader aan de linker maagslagader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Galkanaalverbinding met twee stents. aA) i) Graft BD-stent wordt in de ontvangende BD gestoken met behulp van de (ii) stent die losjes is vastgebonden bij de opening van het BD van de ontvanger.B (C) De das die losjes de ontvanger stent is vrijzekeren wordt nu gebruikt om de verbinding te binden, en (i) een andere 7-0 zijde wordt gebruikt om stevig te houden van de stent op zijn plaats om te voorkomen dat uitglijden of draaien van de stent. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Transplantatie procent overleving. Orthotopische levertransplantatie zonder HA reconnectie (n = 8) en met HA reconnectie (n = 17). Dieren worden na transplantatie gedurende ten minste 60 dagen op de voet gevolgd wegens tekenen van leverfalen en/of infectie. Ratten die geen complicaties vertoonden na een operatie werden beschouwd als overlevenden (*p = 0,015, zoals berekend door Kaplan-Meier schatting [lange rangtest]). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Lever histopathologische beoordeling. Representatieve hematoxyline en met eosine bevlekte secties bij dieren (A) zonder en (B) met hepatische slagader (HA) opnieuw aansluiten op dagen 6 en 13 na levertransplantatie (LTx). (C) Normale lever parenchyma met portaal triade (portaal ader, slagader, en galkanaal), lobules met inbegrip van centrale ader, en acini. Hepatocyten naast de portaal triade zijn zone 1 hepatocyten; hepatocyten naast de centrale ader binnen lobules zijn zone 3 hepatocyten; en hepatocyten tussen zones 1 en 3 zijn zone 2 hepatocyten (ALT = alanine aminotransferase, AST = aspartaat aminotransferase, CV = centrale ader). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Stent- en manchetafmetingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 2: Lever histopathologische beoordeling waaruit verstoring van lever parenchyma. Representatieve hematoxylin en eosine-gekleurde secties bij dieren zonder HA reconnectie op de dagen 54, 96 en 111 na LTx. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend materiaal 1: Porta manchet 200g - ondersteuning 2.0. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 2: Cava manchet 200g - ondersteuning 2.0. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 3: Leverrolmechanisme 200g. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 4: Achterhouder - 1.2. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 5: Cava 150g - 2.1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 6: Porta 1.4.1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 7: Houder arm McGil. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 8: Houder mini arm LAB. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 9: Houder en arm zacht deel 1.3. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend materiaal 10: Houderbasis - 3.1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Discussion
Kleine dierlijke levertransplantatie modellen zijn belangrijk voor het begrijpen van transplantatie immuniteit en het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën32. Het ideale kleine dierlijke levertransplantatiemodel repliceert alle stappen van de menselijke procedure, inclusief arteriële anastomose. Het kan een uitdaging zijn om resultaten van het rat OLT-model te interpreteren, omdat de meeste versies geen HA-anastomosestap bevatten, wat leidt tot hogere percentages complicaties en morbiditeit42. Sommige reconstructieprocedures hebben gebruik gemaakt van de nierslagader, die verwijdering van de nier27vereist. Dit protocol vermijdt orgaanverwijdering, omdat het verder gaat dan wat er in de menselijke procedure gebeurt.
Arteriële reconstructies kunnen ook worden uitgevoerd door het manipuleren van de rat aorta31. Deze methoden vereisen echter uitgebreide dissectie en klemmen van de aorta. Als de klemtijd wordt verlengd, zal de ontvangende rat slechte resultaten hebben in verband met distale ischemie43. Bij mensen, een LT chirurgische techniek omvat de ligatie en de verdeling van de ontvanger gastroduodenal slagader (GDA). Echter, de fysiologische en anatomische kenmerken van knaagdieren maken transplantatie met behulp van deze techniek meer fysiologisch uitdagend en kan leiden tot complicaties (dat wil zeggen, necrose van de alvleesklier en galkanaal35 en gallekkage44). De arteriële heraansluiting in dit protocol is bedoeld om deze uitdaging te omzeilen, de bloedstroom van het kanaal te handhaven en de uitkomst van de ontvanger te verbeteren.
Het gebruik van een mouw en stenting techniek voor de wederopbouw van de rat HA is eerder beschreven27. In deze techniek wordt een stent gebruikt als een gids, en de slagader wordt gereconstrueerd van de donor coeliakie stam aan de ontvanger gemeenschappelijke HA. De ontvanger gemeenschappelijke HA wordt vervolgens ontleed, en de ontvanger GDA is gebonden27. Als gevolg hiervan kan de bloedtoevoer naar het onderste deel van de ontvanger BD en het hoofd van de alvleesklier in het gedrang komen. Er wordt aangenomen dat de bijkomende circulatie naar dit gebied vaak onvoldoende bloedtoevoer naar de galwegen biedt. Bijvoorbeeld, dit protocol test-klemt de ontvanger GDA eerst met een microvasculaire clip, dan verdeelt de ontvanger BD. Met de GDA geklemd, bloedt de verdeelde BD niet. Na het verwijderen van de GDA klem, stevige bloeden uit de BD wordt waargenomen. Dit protocol, dat een goede doorstroming naar de verdeelde ontvanger galkanaal onderhoudt, beschermt de fysiologie van de ontvanger leverweefsel door het verstrekken van voldoende leverbloed perfusie en het voorkomen van post-OLT hypoxische leverletsel.
Aan de donorzijde wordt de HA-stent tijdens de graftpreparaat met gemak in de celeperaming gestoken door een pleister te maken van de selderij, linker maagslagader en miltslagader. De stent kan worden ingevoegd door de brede opening, die minder moeilijk is dan het proberen om de stent in de coeliakie stam alleen. Het is gebleken dat 24 G is een ideale grootte om te gebruiken voor de HA stent. De lengte van de stent moet 1,0-1,5 mm lang zijn, omdat deze fungeert als een open poort om de juiste HA van de ontvanger gemakkelijk in de gemeenschappelijke HA van de donor te laten trekken. Met zorgvuldige aandacht voor waar de 10-0 ethilon hechting wordt geplaatst, bloed stroomt door deze verbinding zal nooit direct raken de stent, en de ontvanger de juiste HA zal beschermen van binnenuit, het verminderen van het risico op complicaties. Belangrijk is dat de HA van de donor nooit wordt geklemd om vasospasme te voorkomen. Het succes van arteriële reconstructie wordt geëvalueerd door de donor GDA open te laten. Succesvolle anastomose resulteert in een goede bloedstroom van de donor GDA zodra de reconstructie is voltooid.
In dit protocol, vergelijkbaar met anderen, SHVC opnieuw verbinden is de langzaamste stap en uiteindelijk dicteert de duur van de anhepatische fase. Naarmate de duur van de anhepatische tijd toeneemt, neemt het risico ischemische letsel en leverdisfunctie toemet 45. Een ander essentieel onderdeel van OLT rat modellen is de grootte van de graft, stents, en manchetten. Als het transplantaat te klein is, kan het transplantaat draaien of spiegelen, waardoor de vasculaire verbindingen worden belemmerd. De grootte van de stents en manchetten kan aanpassingen vereisen afhankelijk van de leeftijd, geslacht, gewicht en stam van de rat. De grootte van de manchetten die hier werden gebruikt werd gekozen zoals eerder beschreven28, en een manchet grootte die gecontroleerd voor rat grootte werd gebruikt. Er waren geen tekenen van nood of complicaties (d.w.z. levercongestie, oedeem, ascites of splenomegaly) tijdens de follow-upperiode (tot op heden: mediaan = 133 dagen na de operatie, minimum = 115 dagen na de operatie, maximum = 161 dagen na de operatie). Verdere studies om de geschikte grootte van PV en IHVC voor verschillende rattenstammen die zowel leeftijd als geslacht uitmaken te bepalen zijn gerechtvaardigd.
Dit gewijzigde rat OLT-protocol maakt gebruik van 3D-geprinte manchetten voor de PV en IHVC, zoals eerder beschreven39,40. Bestaande methoden voor het aansluiten van de PV en IHVC omvatten een microsuture techniek32, manchettechniek46, en microsuture-tijdelijke spalktechniek47. De 3D-geprinte manchettechniek is gekozen, omdat hiermee de grootte van de manchet kan worden gestandaardiseerd op basis van rattenstam en gemakkelijk te bereiden en te gebruiken is. Grote hoeveelheden manchetten met dezelfde afmetingen kunnen in één keer worden afgedrukt. Het buitenoppervlak van de manchet heeft twee groeven om te helpen met het vastzetten van banden en het voorkomen van uitglijden. Een staart is ook opgenomen in de manchet ontwerp om gemakkelijker manipulatie van de manchet mogelijk te maken. Over het geheel genomen wordt aangenomen dat de integratie van 3D-geprinte manchetten leidt tot hoge slagingspercentages en reproduceerbaarheid van de OLT-procedure door het verkorten van de anhepatische tijd. Er wordt bepaald dat deze techniek ook de chirurgische leercurve verkort.
Tot slot, de beschreven protocol een model dat meer lijkt op menselijke levertransplantatie door de integratie van een arteriële heraansluiting stap. Dit protocol kan worden aangepast om vele immunologische en chirurgische aspecten van levertransplantatie te bestuderen en kan dienen als een model om nieuwe therapeutische interventies te testen die relevant zijn voor transplantatie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door middel van fondsen van de Multi-Organ transplantatie programma aan de UHN en steun van de Toronto General en Toronto Western Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Ethilon | Ethicon | 2830G | 10-0 Ethilon Black 1X5" BV100-4 Taper |
| 10mL Syringe | BD | B302995 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
| 1mL Syringe | BD | B309628 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
| 20mL Syringe | BD | B301031 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
| 3D Printed Cuff for IHVC | Custom | ||
| 3D Printed Cuff for PV | Custom | ||
| 3D Printed Holder for IHVC | Custom | ||
| 3D Printed Holder for PV | Custom | ||
| 3mL Syringe | BD | B309657 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
| 4-0 Sofsilk | Coviden | GS-835 | Wx coded braided silk, 30", Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle |
| 5-0 Monocryl | Ethicon | Y433H | Undyed Monofilament 1X27" TF |
| 5mL Syringe | BD | B309646 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
| 7-0 Silk | Teleflex Medical | 103-S | Black |
| 8-0 Prolene | Ethicon | 2775G | 8-0 Prolene Blue 1X24" BV130-5 EVP Double Armed |
| Barraquer Micro Needle Holder Without Catch | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | Curved 120 mm, 4 3/4″ |
| Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-025T | Small Size, Titanium |
| Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-021T | Small Size, Titanium |
| BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN | BD Angiocath / Autoguard | 382523 | 22 G x 1.00" (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min |
| BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel - Regular Wall. | BD | B305106 | PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G |
| BD Precisionglide Syringe Needle 21G | BD | 305167 | Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle |
| BD Precisionglide Syringe Needle 30G | BD | 305128 | Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle |
| Betadine Solution by Purdue Products LP | Purdue Products Lp | 67618-150-17 | 10% povidone–iodine topical solution USP |
| Bupivacaine Injection BP 0.5% | SteriMax Inc. | DIN:02443694 | 0.5% (100mg/20mL) |
| Curved Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-501E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm |
| DC Temperature Controller | FHC Inc. | 40-90-8D | |
| DK Iris Scissors (Curved) | Duckworth & Kent | 1-211B | Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs | Decon Labs, Inc. | 2716 | Dilute to 70% with d2H2O |
| Fine Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Appartus Limited | 34-1040SV | |
| Heparin LEO(heparin sodium) | LEO Pharma Inc. | DIN:00453811 | 10,000 i.u./10 mL |
| Ice-Pak | Cryopak | FIP88016 | 4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch |
| Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9% | Piramal Healthcare Limited | DIN: 02231929 | 250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25 |
| Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps | Duckworth & Kent | 2-502N | 5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm |
| Lactate Ringer's Injected USP, 1000mL | Baxter Co. | DIN: 00061085 | JB2324 |
| McPherson Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-500E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm |
| Metzenbaum Scissors - 14.5 cm | Fine Science Tools | 14024-14 | Straight Sharp/Blunt |
| Micro Kitzmiller Clamp | Scanlan | 3003-630 | Jaw length 23mm, Length 11cm |
| Microscope-Leica M525 F20 | Leica Microsystems | No catalog number | |
| Non-woven Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-028-556 | |
| Olsen-Hegar with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | 15 mm cutting edge, 2mm jaw surface - 14cm |
| OptixCare Eye Lube, 25gm | OptixCare | ES-KE8O-69U1 | Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant |
| Piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | P8396 | Penicillin analog |
| Puritan 3" Standard Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company LLC | 803-WC | Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle |
| Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock | Fine Science Tools | 12075-12 | Round handles allow easy fingertip adjustments - 12.5cm |
| Shea Scissors Curved Blunt | Fine Science Tools | 14105-12 | Transplant scissors with light and delicate pattern - 12cm |
| Stainless Steel Micro Serrefines Curved - 4mm | Fine Science Tools | 18055-06 | Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g |
| Stainless Steel Micro Serrefines Curved - 6mm | Fine Science Tools | 18055-05 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g |
| Stainless Steel Micro Serrefines Straight - 6mm | Fine Science Tools | 18055-03 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g |
| Surgical Platform | Custom, magnetic | ||
| SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine | General Anesthetic Services, Inc | V7015 | |
| T/Pump Localized Therapy | Stryker | TP700 Series | |
| Vacuum-Pressure Pump | Barnant Co. | 400-1901 | |
| Vannas Scissors with Microserrations Straight | Fine Science Tools | 15070-08 | Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm - 8.5cm |
| Vetergesic Buprenorphine | Ceva Animal Health Ltd | NAC No.:12380352 | 0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit | Summit Hill Laboratories | No catalog number | |
| Surgical Drape | PDC Healthcare | DRP1824 | Multi-purpose sterile clear plastic, 18" x 24", 40/case |
References
- Global Observatory on Donation and Transplantation. Organ Donation and Transplantation Activities. , http://www.transplant-observatory.org/download/2016-activity-data-report (2016).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Dopazo, C., et al. Analysis of adult 20-year survivors after liver transplantation. Hepatology International. 9 (3), 461-470 (2015).
- Schoening, W. N., et al. Twenty-year longitudinal follow-up after orthotopic liver transplantation: a single-center experience of 313 consecutive cases. American Journal of Transplantation. 13 (9), 2384-2394 (2013).
- Pischke, S., et al. Factors associated with long-term survival after liver transplantation: A retrospective cohort study. World Journal of Hepatology. 9 (8), 427-435 (2017).
- Hamdani, S., et al. Delayed and short course of rapamycin prevents organ rejection after allogeneic liver transplantation in rats. World Journal of Gastroenterology. 23 (38), 6962-6972 (2017).
- Endo, K., et al. Pretransplant replacement of donor liver grafts with recipient Kupffer cells attenuates liver graft rejection in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (5), 944-951 (2015).
- Zhao, Z., et al. IL-34 Inhibits Acute Rejection of Rat Liver Transplantation by Inducing Kupffer Cell M2 Polarization. Transplantation. 102 (6), e265-e274 (2018).
- Nagakawa, Y., et al. Over-expression of AIF-1 in liver allografts and peripheral blood correlates with acute rejection after transplantation in rats. American Journal of Transplantation. 4 (12), 1949-1957 (2004).
- Gao, L. H., Zeng, L. X., Chen, H. M., Wan, R. H. Cytomegalovirus infection accelerates the process of chronic rejection in rat liver transplantation. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2536-2538 (2013).
- Wu, Y., et al. Effects of combined genes of CTLA4Ig and IDO in post-liver transplantation immune tolerance of rats. Annals of Hepatology. 15 (5), 729-737 (2016).
- He, X. S., et al. Influence of warm ischemia injury on hepatic functional status and survival of liver graft in rats. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 2 (4), 504-508 (2003).
- Tamura, A., et al. Combination effect of tacrolimus and FTY720 in liver transplantation in rats. Transplantation Proceedings. 31 (7), 2785-2786 (1999).
- Wang, Z., et al. RhGH attenuates ischemia injury of intrahepatic bile ducts relating to liver transplantation. Journal of Surgical Research. 171 (1), 300-310 (2011).
- Jiang, J. W., et al. Chronic bile duct hyperplasia is a chronic graft dysfunction following liver transplantation. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1038-1047 (2012).
- Tang, Y., et al. S-Adenosylmethionine attenuates bile duct early warm ischemia reperfusion injury after rat liver transplantation. Molecular Immunology. 95, 83-90 (2018).
- Nosaka, T., Bowers, J. L., Cay, O., Clouse, M. E. Biliary complications after orthotopic liver transplantation in rats. Surgery Today. 29 (9), 963-965 (1999).
- Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47 (3), 428-431 (1989).
- Post, S., et al. The impact of arterialization on hepatic microcirculation and leukocyte accumulation after liver transplantation in the rat. Transplantation. 54 (5), 789-794 (1992).
- Hori, T., et al. Impact of hepatic arterial reconstruction on orthotopic liver transplantation in the rat. Journal of Investigative Surgery. 25 (4), 242-252 (2012).
- Zhou, S., et al. New method of stent-facilitated arterial reconstruction for orthotopic mouse liver transplantation. Journal of Surgical Research. 187 (1), 297-301 (2014).
- Noack, K., Bronk, S. F., Kato, A., Gores, G. J. The greater vulnerability of bile duct cells to reoxygenation injury than to anoxia. Implications for the pathogenesis of biliary strictures after liver transplantation. Transplantation. 56 (3), 495-500 (1993).
- Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26 (1), 198-205 (1997).
- Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62 (5), 582-587 (1996).
- Zhao, D., Wheatley, A. M. Orthotopic liver transplantation in the rat: comparison of models with and without rearterialization of the graft. European Surgical Research. 25 (5), 294-302 (1993).
- Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49 (4), 675-678 (1990).
- Liu, X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a New Technique for Reconstruction of Hepatic Artery during Liver Transplantation in Sprague-Dawley Rat. PLoS One. 10 (12), e0145662 (2015).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C.
- Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16 (6), 664-669 (1973).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
- Kashfi, A., et al. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation Proceedings. 37 (1), 185-188 (2005).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), a015495 (2013).
- Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45 (4), 830-832 (1988).
- Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48 (6), 1080 (1989).
- Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48 (1), 166-168 (1989).
- Shi, Y., et al. Magnetic ring anastomosis of suprahepatic vena cava: novel technique for liver transplantation in rat. Transplant International. 28 (1), 89-94 (2015).
- Dippe, B. E., et al. An improved model for rat liver transplantation including arterial reconstruction and simplified microvascular suture techniques. Journal of Investigative Surgery. 5 (4), 361-373 (1992).
- Kobayashi, E., Kamada, N., Goto, S., Miyata, M. Protocol for the technique of orthotopic liver transplantation in the rat. Microsurgery. 14 (8), 541-546 (1993).
- Oldani, G., et al. Efficient nonarterialized mouse liver transplantation using 3-dimensional-printed instruments. Liver Transplation. 22 (12), 1688-1696 (2016).
- Oldani, G., et al. Manufacturing devices and instruments for easier rat liver transplantation. Journal of Visualized Experiments. (75), e50380 (2013).
- Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22 (2), 62-68 (2002).
- Li, G. L., et al. High incidence of biliary complications in rat liver transplantation: can we avoid it? World Journal of Gastroenterology. 17 (26), 3140-3144 (2011).
- Zammert, M., Gelman, S.
- Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56 (1), 19-24 (1993).
- Ijtsma, A. J., et al. The clinical relevance of the anhepatic phase during liver transplantation. Liver Transplation. 15 (9), 1050-1055 (2009).
- Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
- Marni, A., Ferrero, M. E. A four-technique comparative study of orthotopic liver transplantation in the rat. American Journal of Surgery. 156 (3 Pt 1), 209-213 (1988).
