Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

직교 간 이식의 쥐 모형에 있는 동맥 재연결 후에 감소된 합병증

Published: November 7, 2020 doi: 10.3791/60628
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 1, 1,2, 1, 1, 3, 3, 1, 1, 1,2,3, 1
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Department of Immunology, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

이 연구의 목표는 쥐 정형 소 간 이식 모델을 수정하여 인간의 간 이식을 더 잘 나타내고 수령인 생존을 개선하는 것입니다. 제시된 방법은 기증자 간동맥을 수령인 간동맥에 연결하여 간 동맥 유입을 재확립합니다.

Abstract

쥐 직교 간 이식 (OLT) 모델은 급성 및 만성 거부를 연구하는 강력한 도구입니다. 그러나 동맥 재연결의 부재로 인해 인간 간 이식의 완전한 표현은 아닙니다. 여기에 설명된 간 동맥(HA) 재연결의 통합을 포함하는 수정된 이식 절차, 이식 결과에 있는 현저한 개선으로 이끌어 내는. 평균 간 시간 12 분 과 14s, HA 재연결 결과 이식 된 간의 향상 된 관류와 장기 받는 사람 생존의 증가 37.5% 받는 사람 88.2%. 이 프로토콜에는 포털 정맥과 적외선 베나 카바를 연결하는 3D 프린팅 커프스와 홀더의 사용이 포함됩니다. 그것은 간 이식의 여러 측면을 공부하기 위한 구현될 수 있습니다., 면역 반응 및 감염에서 절차의 기술적인 측면에. 이 수정된 쥐 OLT 프로토콜은 미세 혈관 기술을 사용하여 동맥 재연결을 위한 간단하고 실용적인 방법을 통합함으로써 인간 간 이식의 측면을 면밀히 모방하고 귀중하고 임상적으로 관련된 연구 모델로 작용할 것입니다.

Introduction

간 질환의 글로벌 부담은 2005년부터 2013년1,2까지간 질환 관련 사망자가 30% 증가하면서 계속 증가하고있습니다. 간 이식은 종종 말기 간 질환을 가진 환자에 대 한 유일한 의지. 간은 두 번째로 자주 이식된 고체 기관이며, 2015년부터 2016년1,2까지 전 세계적으로 수행된 간 이식 횟수는 7.25%증가했습니다.2 그것의 보급에도 불구하고, 이식 후 생존율은정체되고 있다 3,,4,,5. 15년 환자 생존율은 53%로 보고되고, 20년 환자 생존율은 21%3,3,5로낮을 수 있다. 새로운 치료와 향상된 임상 결과로 이끌어 낼 수 있는 흥미진진한 새로운 면역생물학 이니셔티브가 있는 동안, 그(것)들을 시험하는 믿을 수 있는 작은 동물 모형은 아직 없습니다.

쥐 OLT 모델은 거부,,6,7,8,89,10,면역 내성11,이식 허혈-재관류 부상12,면역 억제13,담즙 나무 부상,14,,15,16,17을포함한 간 이식 에 대한 조사에 널리 사용되어 왔다.,, 그러나, 현재 의 형태로 모델의 단점은 높은 수술 후 이환율과 사망률18,,19이다. 이것은 인간 적인 작동과 확률에 심각한 단점이며, 모델(20)에서임상적으로 관련 된 결론을 도출 하는 능력을 손상.

추가적으로, 이 이환율의 큰 비율은 결석하거나 불완전한 간 동맥 (HA) 재연결18에기인할 수 있습니다. 비록 인간의 간 이식에 중요 한 단계, 기술적 어려움 쥐 OLT 모델에서 HA 재연결을 손상 하는 경향이. 그 결과, 담관(BD) 해부학은 끈질기게 되어 담즙 누설 및 BD괴사(21)의높은 비율을 초래한다. 담즙합병증(22)의높은 발생률을 넘어, 동맥 유입의 부재는 이식후이식23의생리학을 변화시키고, 공여자 간이식편(24)에서 저산소증과 염증이 있는엽(19,,25,,26)에서간 손상이 관찰된다. 동맥 재연결 없이 쥐 OLT는 또한 섬유증을 촉진하는 경향이있다 (27). 아래에 설명된 쥐 OLT 프로토콜은 이전에 발표된 쥐 OLT방법(28)과간단한 HA 재건 단계를 통합하여 이러한 문제를 해결하여 간 parenchyma의 보존과 생존율 향상을 초래합니다.

간 이식은 기증자로부터 간 이식의 (1) 추출, (2) 기증자 간 이식의 준비, (3) 간 이식과 함께 받는 간 교체의 3상이 있다. 절차는 5개의 해부학 적인 구조물의 조작을 관련시킵니다: supracc 열등한 베나 카바 (SHVC), 포털 정맥 (PV), 적외선 정맥 (IHVC), 간 동맥 (HA), 및 담관 (BD).

쥐내OLT는 SHVC, PV 및 IHVC의 미세 수거 해부학, 그리고 BD29용풀스루 기술을 사용하여 이외 에 의해 처음 도입되었다. 이 모델은 나중에 1979 년30에서두 커프 기술을 사용하여 개선되었다. 그 이후로, 몇몇 대체 기술은 제안된, 대다수는 정맥 해부학에 집중하고 몇몇 수정31와2 개의 커프 기술을 사용하여. HA 해부학은 이전에 쥐 OLT 모델에서 미세 수, 커프 및 인트라루컬 슬리브(26,,31,,32,,33,34)와34같은 기술을 사용하여 쥐 OLT 모델에 설명되었지만, 이러한 기술은 종종 고도로 훈련 된 미세 수술 능력을 필요로하고 쥐 생리학을 크게 변화시키고 혈전증 및 / 또는 담즙 합병증27,,35에의해 방해된다.

더욱이, 외과적 수술의 선택은 또한 쥐 간 이식의 성공에 중요한 ancc 시간 (PV 클램핑에서 재구성된 PV를 통해 이식의 재침투에 시간)에 영향을 미칠 수 있습니다. 구체적으로, 높은 생존율은 15-20분36의간시간, 30분은성공의 상한선인 37,,38로관찰된다. 따라서, 이 방법의 목표는 간 동맥을 다시 연결하고, 이식된 간의 효율적인 관류를 촉진하고, 수령인 담관으로의 흐름을 유지하고, 수령인의 생리적 상태를 보존할 수 있는 덜 침습적이고 더 쉽게 채택할 수 있는 수술용 쥐 OLT 모델을 구현하는 것이다.

여기에 상세하여 기증자 간체 의 체강 트렁크의 조작뿐만 아니라 1) 1.5mm 스텐트의 사용을 포함하여 이 개정 된 프로토콜의 모든 단계는 받는 사람과 의외소매 연결을 수행 적절한 HA, 2) SHVC 재건을 위한 러닝 봉합사, 3) PV 및 IHVC 재건을 위한 2개의 3D 인쇄 플라스틱커프스(39,40,4) HA18,,27,,41 및 5) 이전에 설명된 BD 스텐팅,기술(28)에대한 마이크로혈관 슬리브 재연결. PV를 통한 감기 홍조와 이전 연구결과(17)를기반으로 하는 항생제 처방등 2개의 추가 단계도 포함되어 있습니다. 이 최적화된 OLT 프로토콜은 perioperative 합병증과 이환율을 최소화하고 인간 간 이식에 사용되는 수술 수술을 보다 면밀히 모델합니다.

Protocol

연구 결과는 설치류 취급 및 수술의 지침에 따라 수행되고, 연구 프로토콜은 대학 건강 네트워크 동물 관리 위원회 (UHN AUP #: 5840.3)에 의해 승인되고 동물 관리의 캐나다 위원회의 지침을 따릅니다. 연구 결과는 250-300 g 사이에서 무게가 12-14 주 오래된 남성 루이스 쥐 (긴장 LEW/SsNHsd), 12-14 주를 이용합니다.

1. 장비 설정

  1. 바늘 홀더와 31 G 날카로운 팁을 잡고 팁이 벗겨질 때까지 반복적으로 앞뒤로 팁을 구부려 무딘 L 자형 인젝터를 만듭니다. 플랫 메탈 파일을 사용하여 인젝터의 끝을 무디게 하고 부드럽게 합니다.
    1. 메스를 가진 3D 프린팅 베이스에서 포털 정맥(PV) 및 적외선 베나 카바(IHVC) 커프스를 잘라냅니다(보충재료 1, 보충 재료 2, 도 1, 보충도 1).
      참고: 3D 설계 소프트웨어는 자동 수지39,,40(보충 재료 1-10에포함된 모든 3D 인쇄 재료에 대한 사양)을 사용하여 3D 프린터(재료표)에인쇄된 커프스와 홀더를 설계하는 데 사용됩니다.40
    2. 새로운 메스를 사용하여 22 G 카테터를 양면 경사 튜브(길이 3.5mm)로 자릅니다. 메스를 사용하여 담관 (BD) 스텐트의 표면에 부드럽게 에칭 라인을 삽입합니다 (튜브의 벽을 통과하지 마십시오). 이러한 에칭은 절차 중에 관계가 미끄러지는 것을 방지합니다.
    3. 새로운 메스를 사용하여 24 G 카테터를 일방적인 기울어진 가장자리 튜브(길이 2.0mm)로 자르고 새로운 동맥 스텐트의 표면에 여러 가지 긁힌 자국을 만듭니다.
      참고: 스텐트에 압력을 가하지 않도록 BD 스텐트의 루멘의 협착 또는 폐색을 방지합니다. 스텐트가 좁아지거나 가려지면, 수령인의 생존은 담즙 방해에 의해 손상될 것입니다.

2. 기증자 운영

  1. 히트 패드를 37°C로 설정하고 수술 플랫폼 아래에 놓습니다. 쥐의 핵심 온도를 직장 프로브를 통해 모니터링할 수 있도록 온도 모니터를 켭니다. 이소플루란 마취 장치를 설정합니다.
    참고: 수술 중 호흡 속도, 심박수, 장기/점막의 착색, 페달 철수 반사 신경의 존재를 지적하여 마취의 깊이를 모니터링하십시오.
  2. 모든 필요한 악기와 재료 (즉, 가위, 집게, 거즈, 헤파린, 리트랙터, 중간 층 패드, 면 팁, 4-0 실크, 7-0 실크, 8-0 비흡수성 멸균 봉합사 및 10-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사)는 수술 플랫폼의 측면에 편리하게 배치됩니다.
  3. 링거의 젖산 용액과 300IU의 헤파린 나트륨(재료 표 참조)을 포함한 모든 솔루션으로 워크스테이션을정렬합니다.
  4. 동물의 무게. 기증자 쥐를 마취 챔버에 5% 이소플루란, 5 L/min 공기 흐름, 유도시 70% FiO2로 배치하여 마취래를 마취합니다. 쥐가 의식을 잃으면 마취를 3% 이소플루란, 0.5 L/min 공기 흐름, 70% FiO2로감소시한다. 발가락을 꼬집어 페달 반응의 부족을 확인합니다.
  5. 복부의 피부를 준비합니다. 전기 면도기사용으로 복부 측에서 털을 제거합니다. 기증자의 호흡 속도를 안정적이고 깊은 속도에 도달할 때까지 주의 깊게 관찰합니다.
    1. 외과적으로 드레이프쥐를 놓아 복부 면이 천장을 향하고 있습니다. 마취 폐포에 코를 3% 이소플루란, 0.5 L/min 공기 흐름, 70% FiO2로 배치합니다. 포비단 요오드로 복부 벽을 준비하고, 중간선에서 바깥쪽으로 작업한 다음 70%의 에탄올이 뒤따릅니다.
  6. 둥근 기울어진 수술 가위를 사용하여 음모 심기로 시포이드 프로세스에서 절개를 한 다음 양측 횡단 절개를 통해 노출을 향상시킵니다. 소터에 대한 양극성 전기 외과 단위를 사용하여 복부 벽에서 출혈을 중지합니다. 절개 후, 유지 보수 이소플루란을 2%, 0.5 L/min 공기 흐름, 70% FiO2로감소한다.
    참고: 초당 약 1호흡의 호흡 속도를 달성하기 위해 이소플루란 기화기를 조정하고 정기적으로 수술 과정 전반에 걸쳐 마취의 깊이를 평가하는 것을 기억하십시오.
  7. xiphoid 과정에 4-0 실크 스티치를 놓고 봉합사를 사용하여 가슴 벽 세팔라드를 철회하십시오. 실크 실을 마취 폐소기를 제자리에 보관하는 구조의 상단에 테이프를 붙입니다. 기증자 쥐의 신체 구멍을 3D 인쇄 된 리트랙터 (보충 재료 3참조)와 열어 두어 복부의 양쪽에 배치 (re트랙터는 수술 플랫폼에 자석에 부착 된 고무 밴드와 함께 제자리에 개최됩니다).
    참고 : 모기 집게는 또한 xiphoid 과정을 파악하고 세팔라드를 철회하는 데 사용할 수 있습니다. 테이프를 사용하여 모기 집게를 제자리에 고정합니다.
  8. 링거의 젖산 용액으로 약해진 부직포 거즈 스폰지(4cm x 4cm)를 사용하여 소장과 대형 내장을 둘러싸습니다. 작고 젖은 부직거 스펀지(2cm x 4cm)를 사용하여 간을 부드럽게 덮습니다.
  9. 복부를 들어 올리고 수중 정맥 (SHVC)의 노출을 개선하기 위해 중간 부분 아래에 작은 압연 거즈를 놓습니다.
  10. 팔시폼 인대를 잘라냅니다. 마이크로 포셉을 사용하여 왼쪽 횡격막 정맥을 SHVC에서 분리합니다. SHVC에 가깝게 유지하면서 왼쪽 횡격막 정맥을 7-0 실크로 리게이트합니다.
    참고: 링거의 젖산으로 감쇠된 작고 젖은 무직거즈 스폰지를 사용하여 간을 부드럽게 철회하고 왼쪽 횡격막 정맥을 노출시킵니다.
  11. 왼쪽 삼각형과 위장관 인대를 둥근 기울어진 가위로 자른다.
  12. 작고 젖은, 부직포 거즈 스폰지를 사용하여 xiphoid 과정쪽으로 왼쪽 및 중간 엽을 조심스럽게 당겨 서 카우다이트 엽을 노출시. 둥근 기울어진 가위로 간의 나머지 부분에서 카우다데이트 엽을 분리하는 인대를 놓습니다.
  13. 식도에 가까운 양극성 전기 외과 장치를 사용하여 간식도 인대를 나누고 분리합니다.
    참고: 크고 작은 내장을 복강좌 왼쪽으로 부드럽게 옮기고 젖은 부직포 거즈로 덮습니다.
  14. IHVC를 덮고 있는 레트로페리톤과 지방을 해부합니다. IHVC를 왼쪽 신장 정맥으로 노출하고 분리합니다.
  15. IHVC를 면봉으로 약간 변위하여 IHVC의 오른쪽으로 병합되는 작은 정맥을 이중 극성 전기 외과 유닛을 사용하여 노출한 다음 소작합니다. 또한 IHVC로 병합되는 요추 정맥을 소작합니다.
  16. 오른쪽 수근(부신) 정맥을 7-0 실크 합자 2개로 나누고 IHVC에 가깝게 유지합니다. 부드러운 견인아래 이들을 절단하여 후반인대에서 간을 해방.
  17. 오른쪽 신장 동맥과 미세 한 팁 소어를 사용하여 이웃 조직에서 오른쪽 신장 정맥을 분리합니다. 오른쪽 신장 정맥 오리피스를 8-0으로 밀봉하십시오. 흡수성이 없는 멸균 합자.
  18. PV를 덮는 지방을 분리하여 유두 정맥(오른쪽 위 정맥)과 비장 정맥을 PV를 병합하는 지점에서 찾습니다. 7-0 실크로 이 정맥을 리게이트하여 8-0으로 PV에 가장 가까운 측면을 강화합니다. 흡수성이 없는 멸균 봉합사 스티치. 정맥을 관계 사이에 나눕니다.
    참고 : 작고 젖은 거즈를 사용하여 PV를 노출하여 십이지덴을 다시 그립니다. 지방이 PV에서 분리되면 커프스를 삽입하는 것이 더 쉬워지므로 PV 커프의 협착을 방지합니다.
  19. IHVC에 헤파린 나트륨 300 IU를 주입하고, 1mL 주사기(31G 바늘)를 사용하여 정상 식염수 1mL로 희석한다.
  20. BD 분기 아래 5mm절을 만들고 BD 스텐트를 일반적인 BD에 삽입합니다. 추가 넥타이는 분기 아래 10mm인 절개 아래에 만들 수 있습니다. 스텐트가 고정되면 이 두 관계 사이에 BD를 잘라냅니다.
  21. BD 또는 적절한 간 동맥(HA)을 클립하지 마십시오. 10-0 비흡수성 멸균 수술 용 모노필라멘트 봉합사 스티치를 분리시 마커로서 절개시 BD의 3시 위치에 놓아 재연결 후 비틀림을 방지한다.
  22. 적절한 HA를 노출하고 위장 동맥 (GDA)을 두 개의 7-0 실크 합자 사이에 나눕니다. 왼쪽 위 동맥, 비장 동맥 및 체강 트렁크를 노출합니다. 세 개의 동맥을 무분별하게 묶고 이륙에 가깝게 묶습니다.
  23. 왼쪽 위 동맥, 비장 동맥 및 동맥 관계 사이 체강 트렁크를 잘라. 21.5 G 바늘을 사용하여 20mL 주사기를 사용하여 20mL의 냉간(4°C) 링거 젖산 용액을 PV에 천천히 주입합니다. 왼쪽 신장 정맥이 IHVC와 합쳐져 플러시 유출을 허용하는 지점 아래의 베나 카바를 잘라냅니다.
    참고 : 바늘은 힐룸에서 가능한 한 멀리 유지해야합니다. 기증자 간 감기 관류는 1-2 분 사이에서 지속되어야 합니다. 간을 플러시하는 동안, 간 표면에 차가운 링거의 젖산을 분출하는 다른 손을 사용합니다.
  24. 플러시 후 비장 정맥 아래 PV 트렁크를 잘라냅니다. 왼쪽 신장 정맥 바로 위에 IHVC를 잘라. 다이어프램에 직접 인접한 SHVC를 잘라냅니다.
  25. 간과 레트로 페리톤 사이의 인대와 결합 조직을 잘라.
    참고: 상부 캐빌 해부학을 용이하게 하기 위해 전방 및 후방 SHVC 벽의 충분한 길이가 있는지 확인하십시오. 다이어프램에 즉시 인접하여 가능한 한 많은 길이를 유지하는 것이 중요합니다.
  26. 간을 복부에서 제거한 후 4°C 링거의 젖산 용액으로 채워진 접시에 빠르게 넣습니다. 차가운 온도를 유지하기 위해 얼음 패드 위에 접시를 놓습니다.
  27. 제도적 지침에 따라 기증자 쥐의 유해를 폐기하십시오.

3. 기증자 쥐 간 준비 ("백 벤치")

  1. 차가운 페트리 접시를 4°C 링거의 젖산 용액을 충분히 부피하여 기증자 쥐 간을 침수합니다. 열등한 표면이 위쪽으로 향할 수 있도록 조심스럽게 접시에 떠있는 기증자 간을 조심스럽게 회전시합니다. PV 및 IHVC(보조재료 1 및 보충 재료 2)용소맷부리를 접시에 넣습니다.
  2. PV 커프를 통해 PV를 당기고 정맥 끝을 커프스 위에 접습니다. 7-0 실크를 사용하여 커프 주위에 PV를 단단히 묶습니다. 4 °C 링거의 젖산 용액의 10mL로 PV를 플러시하십시오.
  3. 플러시 없이 IHVC로 3.2 단계를 반복합니다.
  4. 체강 트렁크 주위의 지방 조직을 제거합니다. 체강 트렁크, 비장 동맥 및 좌측 위동맥(그림2A)의분기를 열어 절단하여 더 큰 동맥 슬리브 커프를 형성한다.
    참고: 동맥 스텐트를 공통 HA에 삽입하는 것은 어렵습니다. 스텐트를 삽입하기 전에 여러 번 집게로 동맥을 펴고 펴보습니다. 스텐트의 베벨이 위쪽으로 향하고 동맥이 뒤틀리지 않았는지확인하십시오(그림 2B).
  5. 1.5 mm 길이 24 G 동맥 스텐트를 기증자 공통 HA에 넣어 동맥 커프를 통해. 8-0으로 스텐트를 고정 폴리프로필렌 합자(도2C)와링거의 젖산용액(도Figure 22D)으로스텐트를 플러시한다.Figure 2
  6. 포털 재퍼퓨전 후 혈액 손실을 방지하고 공기 색전증을 피하기 위한 근위 IHVC에 마이크로 클램프(길이 4-6mm)를 배치한다.
  7. 간을 회전시키고 우수한 면을 노출시십시오. 8-0 2개 삽입 SHVC의 측면 및 내측 가장자리에 있는 폴리프로필렌 테이퍼 포인트 봉합사.
  8. 간을 4°C로 유지하여 기증자로 이식할 준비가 되어 있습니다.

4. 받는 사람 작업

  1. 위의 기증자 작업 섹션을 참조하고 2.1-2.4 단계를 반복하십시오.
    참고: 12-14주 된 남성 루이스 쥐는 기증자보다 5-20 g 무거운 무게로 여기에서 사용됩니다. 수술 중 호흡 속도, 심박수, 장기/점막의 착색, 페달 철수 반사 신경의 존재를 지적하여 마취의 깊이를 모니터링합니다.
  2. 외과적으로 드레이프된 쥐를 위쪽으로 향하는 복부 면을 놓습니다. 이소플루란 흡입을 위해 마취 폐포에 코를 놓습니다. 옵탈라믹 윤활유로 눈을 촉촉하게 합니다. 먼저 providone-요오드로 복부 벽을 준비한 다음 70 %의 에탄올로 준비하십시오.
  3. 링거의 젖산 용액5mL을 복부 벽의 양쪽 하단에 피하로 주입하십시오. 외과 조수의 보좌관을 사용하여 복강경 전에 왼쪽 복벽에 근육질로 200 mg / kg 의 피페라실린 나트륨의 0.5 mL을 주입하십시오. 또한, 오른쪽 복벽에 피하적으로 10 mg/mL 부피바카인의 0.5 mL을 관리한다.
    참고: 수술 후 3일 동안 동일한 용량의 피페라실린 나트륨을 1x/일 투여합니다.
  4. 먼저 providone-요오드로 복벽을 다시 준비한 다음 70%의 에탄올로 준비합니다. 흉골 시포이드에서 음모 심기 보다 1cm 높이까지 중간 절개를 합니다. 이소플루란을 2%, 0.5L/min 공기 흐름으로 줄이고, 절개를 한 후 마취를 유지하려면 FiO2 70%가 감소합니다.
    참고 : 모기 집게는 xiphoid 과정을 파악하고 세팔라드를 철회하는 데 사용할 수 있습니다. 테이프를 사용하여 모기 집게를 제자리에 고정합니다. 바디 캐비티는 3D 인쇄 된 리트랙터 (보충 재료 3참조)에 의해 열려 유지되며 양쪽에는 고무 밴드가 외과 플랫폼에 자석으로 고정됩니다.
  5. 링거의 젖산 젖어 있는 저조거 스폰지(4cm x 4cm)로 크고 작은 내장을 감싸는 다듬습니다. 링거의 젖산 용액으로 약해진 작은(2cm x 4cm), 젖은 부직거 스폰지를 사용하여 간을 부드럽게 덮습니다.
  6. 작은 3D 프팅 지지 패드(백 홀더; 보충 재료 4참조)를 쥐 중간부 아래에 놓고 스핀을 구부려 SHVC의 노출을 증가시다. 이것은 쥐에서 안전하게 수행 할 수 있으며 외과 의사 조수에 의해 실행됩니다.
  7. 팔시폼 인대를 자르고 작고 젖은 부직포 거즈 스폰지를 사용하여 간을 부드럽게 철회하고 왼쪽 횡격막 정맥을 노출시킵니다. 마이크로 포셉을 사용하여 왼쪽 횡격막 정맥을 SHVC에서 분리합니다. 왼쪽 다이어프램 정맥을 7-0 실크로 다이어프램에 가깝게 리게이트합니다.
  8. 왼쪽 삼각형과 위장관 인대를 둥근 기울어진 가위로 자른다.
  9. 작고 젖은 부직포 거즈 스폰지로 왼쪽과 중간 엽을 섬세하게 시포이드 공정쪽으로 당겨 카우다테 로브를 드러냅니다. 간의 나머지 부분에서 카우다데이트 엽을 분리 인대를 끊는다.
  10. 간식도 인대를 나누고 간에 가깝게 머무르면서 양극성 전기 외과 유닛과 출혈 점을 응집합니다. 간의 후방 측면에 인대를 잘라.
  11. 크고 작은 내장을 복강좌 의 왼쪽으로 조심스럽게 철회하고 젖은, 부직포 거즈로 덮습니다.
  12. IHVC에 레트로 페리토네움과 지방을 해부하여 IHVC를 올바른 신장 정맥으로 노출하고 분리합니다. 면봉으로 IHVC를 약간 대체하고 양극성 전기 외과 장치를 사용하여 IHVC의 오른쪽으로 병합되는 작은 정맥을 소작합니다. 마찬가지로, IHVC를 입력 하는 어떤 요추 정맥을 소작.
  13. 오른쪽 수레서널(부신) 정맥을 7-0 실크 합자 2개로 나눕니다. 부드러운 견인하에 절단하여 후반인대에서 간을 해방.
  14. 링거의 젖산 용액으로 약해진 작고 젖은 거즈를 사용하여 십이지장 기를 철회하고 PV를 노출하십시오. PV와 유청의 양분의 양화에서 지방을 분리합니다.
  15. BD0.5cm를 하이라 분기 아래 나누고 BD 스텐트를 탈모 공통 BD에 삽입합니다. 추가 넥타이는 절개 위에 배치 할 수 있습니다, 분기 에 가까운. BD를 간 가까이잘라내지만 넥타이에 말단하십시오.
  16. BD를 집게로 분리하고 BD 또는 적절한 HA를 클리핑하지 마십시오. BD의 3시 위치에 10-0 흡수성 모노필라멘트(예: 에틸론) 스티치를 마커로 놓아 재연결 후 비틀림을 방지한다.
  17. 일반적인 HA 및 GDA의 적절한 HA 및 분기를 노출합니다. 왼쪽 HA, 중간 HA 및 오른쪽 HA를 노출합니다. CHA 분열에 탈반세 동맥을 묶고 간 가까이에 있는 동맥을 묶고, 넥타이 위에 동맥을 잘라냅니다.
  18. SHVC 뒤에 긴 얇은 거즈 조각을 넣습니다.
  19. IHVC 뒤에 3D 프릭 IHVC 홀더 또는 "핸들"(Cava 150g 2.1; 보충 재료 5참조)을 IHVC 뒤에 놓고, 10-0 흡수성 모노필라멘트 봉합사(그림3A)를사용하여 3D 인쇄된 "핸들"의 끝을 함께 바느질한다.Figure 3
  20. 3D 프린팅 PV 홀더 또는 "핸들"(Porta 1.4.1 참조 보충 재료 6)을PV 뒤에 놓고, 간보다 직접 열등하며, 10-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 3D 인쇄 "핸들"의 끝을 함께 바느질합니다.
  21. 느슨하게 3D 인쇄 홀더 (IHVC 및 PV)(그림 3A)아래 7-0 실크 합자를 묶어.
  22. IHVC를 오른쪽 신장 정맥 바로 위에 고정하면 3D 인쇄 된 카발 홀더 아래에 있어야합니다.
  23. 3D 인쇄 PV 홀더 바로 아래에 있어야 하는 유철물 정맥 바로 위에 PV를 고정하십시오. 이 시점에서 시작되는 간 시간을 기록합니다. 마취 유지를 위해 0.5% 이소플루란, 0.5 L/min 공기 흐름, 70% FiO2로 감소합니다.
  24. 27G 바늘이 부착된 3mL 주사기를 사용하여 PV의 분기를 통해 37°C 링거의 젖산 용액의 플러시 2mL.
  25. 키츠밀러 클램프로 간 위에 SHVC를 고정합니다. 같은 클램프 아래로 잘라, 가능한 한 간 가까이 체재.
  26. PV 와 IHVC(그림3A)에대해 3D 프프린트 홀더 위로 잘라냅니다. 받는 사람의 간을 제거합니다. 기증자 간을 주의 깊게 방향을 지정하고 상부 캐빌 해부학이 생성 될 수있는 방식으로 수령인의 신체 구멍에 배치합니다.
  27. 8-0 사용 다이어프램 근처의 수령인의 SHVC와 함께 기증자의 SHVC에 합류하기 위해 봉합사를 실행하는 폴리 프로필렌. 첫째, 8-0의 장소 숙박 봉합사 기증자 및 받는 사람 SHVC의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 폴리 프로필렌. 그런 다음 정맥 벽 의 바깥쪽에 이것들을 묶어 두는 다.
  28. 왼쪽 8-0 사용 폴리 프로필렌은 왼쪽에서 오른쪽으로 SHVC의 후방 벽을 스티치하고 오른쪽 8-0에 넥타이 폴 리 프로필 렌. 왼쪽 8-0 사용 폴리 프로필렌은 SHVC 해부학의 전방 벽을 왼쪽에서 오른쪽으로 스티치하여 봉합사 선의 마지막 3 분의 2를 느슨하게 합니다. 느슨한 스티치 사이에 링거의 젖산 20mL를 사용하여 거품을 추출하십시오.
  29. 느슨한 바늘을 조이고 SHVC의 외부에 넥타이를 만듭니다. 나머지 8-0 을 잘라 폴리 프로필렌 봉합사.
    참고: 클립에는 받는 사람의 SHVC가 제자리에 있으므로 기부자와 받는 사람의 SHVC를 함께 바느질하는 것이 더 쉽습니다. SHVC 해부학의 지속 시간을 기록합니다. 이 때, 포르타 핸들은 홀더 암 장치(홀더 암 McGil + 홀더 미니 암 LAB + 홀더 팔 소프트 파트 1.3; 보충 재료 7, 보충 재료 8,및 보충 재료 9,각각 참조)에 부착되어 간보다 직접적으로 열등하다. 이 장치는 3D 인쇄 홀더 베이스 (홀더 베이스 3.1; 보충 재료 10참조)에 의해 지원됩니다.
  30. 기증자로부터 PV커프(보충 재료 1)를받는 사람 PV에 삽입하고 7-0 실크 넥타이를 조입니다. 링거의 젖산 용액으로 기증자와 수령인의 PV를 연결 하기 전에 37°C로 따뜻하게 합니다.
  31. SHVC(첫 번째)에서 외상성 클램프를 제거한 다음 PV(초)에 대한 미세 혈관 클립을 제거합니다. 따뜻한 혈액으로 간을 다시 퍼퓨즈; 이 시점에서, 간 단계 시간이 끝났습니다. 이번에는 기록하십시오.
  32. 따뜻한 링거의 젖산 용액 10mL를 간 위에 붓고 따뜻하게 합니다. 둥근 팁 가위로 3D 프린팅 홀더를 제거합니다(고정 스티치 를 잘라냅니다).
  33. 기증자 IHVC 커프(보충재료 2)를받는 사람 IHVC에 삽입하고 7-0 실크 넥타이로 고정합니다. 먼저 기증자 IHVC 클립을 제거한 다음 받는 사람의클립(그림 3B)을제거합니다. 상기와 같이 홀더 장치 및 홀더 베이스에 부착된 카바는,
  34. 라운드 팁 가위로 3D 프린터 홀더(porta 및 cava)를 제거합니다(고정 스티치절단; 도 3C),연결된 IHVC(그림3D)를초래한다.Figure 3
  35. 조심스럽게 어떤 출혈간 주변 지역을 검사. 37°C 링거의 젖산 용액의 인스틸 3mL은 체공 내부의 바둑판식.
  36. 동맥 해부학 : 스텐트를 넘어 확장 기증자에서 체강 트렁크의 부분을 잘라.
  37. 받는 사람의 적절한 HA를 고정하고 마지막에 넥타이를 차단합니다. 혈관을 둘러싼 여분의 조직을 잘라냅니다(도 4A). 링거의 젖산 용액으로 기증자와 수령인 선박의 루멘을 플러시하십시오.
  38. 하 해부학을 달성하기 위해 기증자 HA 스텐트의 슬리브로 받는 사람에게 적절한 HA를 당깁니다. (기증자) HA의 왼쪽 측면을 통해 10-0 에틸론을 놓고, 스텐트 (외부에서 안쪽으로) 해발 오리피스 위에 2.5 mm를 두고, 스텐트 의 끝을 통해 10-0 에틸론 (4cm 길이)으로 곡선 바늘(도 4B)에의해 유도됩니다.
  39. 수령인을 선박 오리피스 아래에 0.5mm 떨어진 오른쪽으로 고정하고, 스티치를 먼저(내부에서 외부로) 용기의 왼쪽에, (외부에서 안쪽으로) 동맥의 오른쪽에 놓습니다.
  40. 봉합사를 안쪽에서 외부로(기증자) HA의 오른쪽 벽을 통해 원래 스티치와 동일한 스텐트 오리피스에서 멀리 떨어진 곳에 놓습니다. 10-0 비흡수성 모노필라멘트의 양단을 당기면, 이는 수령인이 HA스텐트(도Figure 44C)로적절히 미끄러집니다.
    참고 : 혈액의 펌핑을 관찰. 한 가지 옵션은 기증자 GDA를 잘라 혈액이 해부학을 통해 펌핑되고 있는지 확인하는 것입니다. GDA가 절단된 경우 다음 절차 단계로 이동하기 전에 동맥을 다시 묶는지 확인합니다.
  41. 기증자HA(도4D)를통해 10-0 비흡수성 모노필라멘트를 그 자체로 묶는다. 동맥 해부학이 완성되었습니다.
  42. 담즙 해부학 : 받는 사람 BD 및 스텐트(그림 5A)주위에 느슨하게 넥타이를 배치 한 다음 BD 스텐트를 제거합니다. 담즙 연결이 완료되기 전에 받는 사람과 기증자 모두의 BD를 플러시하십시오.
  43. 기증자의 BD 스텐트를 받는 사람의 담관(그림5B)에삽입하고 이전에 받는 사람 BD(그림5C)주위에배치되었던 넥타이를 조입니다.
  44. 내장을 신체 구멍에 반환합니다. 37°C 링거의 젖산 용액을 캐비티에 주입하여 세척합니다. 일부 용액을 거즈로 담그세요.
  45. 장들이 5-0 모노크릴로 정수리 성 구막과 피부를 바느질하기 전에 원래의 위치에 다시 있는지 확인하십시오.
  46. 5-0 모노크릴로 두 레이어로 절개를 닫습니다. 0.5mL의 0.5mL를 바느질 된 정수리 성 회막 주위에 주입하고 피부가 함께 바느질되면 이를 반복하십시오.
  47. 케이지로 옮길 때 받는 쥐를 종이 타월에 부드럽게 헤딩합니다. 동물이 각성 시점부터 물과 음식에 무료로 접근할 수 있도록 하십시오. 24-38 h에 대한 케이지의 절반 아래에 따뜻한 물 순환 담요를 유지합니다. 수술 후 즉시 한 케이지에 하나의 쥐가 지정됩니다.

5. 수술 후 치료

  1. 푸드 펠릿을 물에 담그고 케이지 바닥에 페트리 접시에 넣습니다.
  2. 쥐의 심박수, 호흡 속도 및 피부 색을 모니터링합니다.
  3. 수술 후 일 1, 2 및 3일에 파이피라실린을 투여합니다. 부프레노르핀을 피하시 투여하고 첫 72h에 대한 모든 행동 변화, 혼수, 웅크린 모피, 우울증, 절단 또는 식욕 상실과 같은 통증의 징후를 모니터링하십시오.
    참고: 통증은 이식 후 3일 동안 매일 적어도 2배 이상 평가되며, 그 다음에는 매일 적어도 1배 이상 평가됩니다.

Representative Results

이전에 설명된프로토콜(28)을사용하여 비HA 해부학 쥐 OLT 모델을 확립하는 동안, 우리 팀은 각각 21일과 60일 후에 생존율을 50% 및 37.5%로 관찰했습니다. HA 해부학없이 장기 생존의 높은 비율은 일부 그룹에 의해보고되었지만28,이러한 초기 결과는 동맥 유입이없는 단점을 강조. 대조적으로, 최적화된 HA 재연결 절차는 장기 생존율이 37.5%에서 88.2%로 크게 증가하였다(p= 0.015)(그림6).

HA 재연결 없이 이식된 동물의 대표적인 하위 집합(6일과 13일 수술 후)의 조직학적 분석은 중심 괴사를 가진 저산소 간 손상의 징후를보였다(도 7). 광범위한 간 괴사는 이들 동물에서 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르타테 아미노트랜스퍼라제(AST)의 엄청나게 높은 수준과 연관되었다(그림7). 대조적으로, HA 재연결을 가진 이식된 쥐는 간 상해의 흔적을 보여주지 않았고, 조직화된 아시니, 소류(예를 들어, 간 정맥을 가진 중앙 정맥 및 포털 트라이아드), 동맥 및담관(그림 7)을가진 일반적인 간 빈혈 구조를 드러냈다.

23개의 개별 적인 수술 과정을 통해 평균 ancc 시간이 허용되었지만 (12 분 및 14 s [± 78 s]), 비 HA 재연결 모델에서의 생존은 결국 증가 된 연습으로 개선 될 수 있습니다. 그러나 HA 재연결 없이 이식된 4마리의 동물 중 3마리가 56일, 96일, 111일 의 고민으로 인해 안락사되었다는 점은 주목할 가치가 있다. 추가적으로, 간내학적 분석은 표시된 담관 증식, periportal 섬유증 및 염증, 왜곡된 간 parenchyma(보충 도 2)를포함하여 저산소 간 손상 후에 반응성 변화를 밝혔습니다. 저산소 간 상해의 형태학적 특징의 존재는 HA 재연결이 효율적인 간 관류 및 정상적인 기능에 중요하다는 사실 인정을 확증합니다.

Figure 1
그림 1: 포털 정맥 및 적외선 정맥에 대한 3D 인쇄 커프 디자인의 회로도 표현. 첫 번째 넥타이는 손잡이(iii)에 가장 가까운 홈(ii)으로 조여지고, 두 번째 넥타이는 손잡이에서 가장 멀리 떨어진 홈(i)에서 조여져 있습니다. 외부 직경은 (iv) 2.38 mm 포문 정맥 (PV)에 대 한 그리고 2.15 m m frac c 열 등 베나 카바 (IHVC)에 대 한. 내부 직경은 PV용 (v) 1.74mm, IHVC의 경우 1.38mm입니다. 길이는 PV용 (vi) 2.60mm, IHVC의 경우 2.15mm입니다(모든 3D 인쇄 재료에 대한 정확한 사양은 보충 재료에서찾을 수 있음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 간 동맥 스텐트 삽입에 접목. (A)체강 트렁크(i)의 개구부 끝은 좌측 위동맥에 비장 동맥을 절단하여 넓어, 이는 일반적인 HA의 분기를 노출한다. (ii) BD 스텐트는 기증자 쥐 간추출 전에 묶여 있다. (iii) PV 커프스와 (iv) IHVC 커프스가 배의 끝을 커프스 위에 접혀 삽입하여 묶습니다. (b)(i) HA 스텐트를 삽입하기 위해, 노출된 공통 HA는 집게로 여러 번 뻗어 있다. (C)(i) HA 스텐트는 공통 HA에 단단히 배치되고 8-0으로 묶여 있습니다. 프롤렌. (D)HA 스텐트는 (ii) 링거의 젖산용액(BD = 담관, IHVC = 적외선 베나 카바, HA = 간 동맥)으로 플러시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 3D 프린팅 홀더를 사용하여 적외선 정맥 카바 연결. (A)(i) PV는 IHVC 연결과 동일한 기술을 사용하여 연결된다. 접목은 (ii) (iii) IHVC 커프 위에 고정되어 있습니다. 받는 사람 IHVC 개구부 (iv) (iv) 오픈의 측면에 봉합 3D 인쇄 홀더를 열어 유지합니다. 느슨한 (v) 7-0 실크는 받는 사람 IHVC 주위에 묶여있다. (B)접목 IHVC의 커프는 (i) 받는 사람 IHVC 내에 삽입된다. 이제 느슨한 넥타이가 강화됩니다. (C)클램프가 제거되고(i) 3D 인쇄 홀더는 가위로 분리된다. (D)추가 (i) 7-0 실크는 안전하지 않은 경우 연결 주위에 묶여 있지만, 일반적으로 하나의 넥타이는 충분하다 (PV = 포털 정맥, IHVC = 적외선 베나 카바). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 간 동맥의 미세 혈관 슬리브 연결. (A)(i) BD 스텐트는 받는 사람에게 연결되지 않습니다. (ii) HA 스텐트는 (iv) 받는 사람의 적절한 HA에 연결되는 접목에 배치된다. (iii) PV가 연결되어 있습니다. (B)10-0 에틸론을 (i) 커브드 바늘을 가진 에틸론은 하스텐트를 통해 하스텐트를 통해 받는 사람 HA 개회말의 측면에 그려집니다. (C)10-0 에틸론은 HA 스텐트를 통해 다시 그려집니다. 따라서 받는 사람의 적절한 HA는 슬리브처럼 스텐트를 통해 당겨지도록 합니다. (D)(i) 10-0 에틸론이 있는 넥타이는 수령인의 적절한 HA가 먼저 HA 스텐트를 통해 실행되는 부분으로 스텐트안으로 당겨지면 만들어집니다. (E)여기에 기재된 HA 해부학의 회로도(B),B(C),및(D)(BD = 담관, HA = 간 동맥, PV = 포털 정맥). *좌측 위동맥에 비장 동맥을 절단하여 체강 트렁크의 개통 끝이 넓어질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 두 개의 스텐트를 사용하여 담관 연결. (A)(i) 이식편 BD 스텐트는 수신자의 BD의 개구부에서 느슨하게 묶인 (ii) 스텐트의 도움으로 수신자 BD에 삽입된다. (iii) PV는 BD 연결 전에 연결된다.(B)수신자의 BD의 끝에 스텐트가 제거되고 와이드 개통으로 사용되었다(ID) (C)수신자 스텐트를 느슨하게 고정하는 넥타이는 이제 연결을 연결하는 데 사용되며, (i) 또 다른 7-0 실크는 스텐트의 미끄러지거나 비틀림을 피하기 위해 스텐트를 제자리에 단단히 유지하는 데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 이식 퍼센트 생존. HA 재연결 없이 직교 쥐 간 이식 (n = 8) 하 와 HA 재연결 (n = 17). 동물은 적어도 60 일 동안 간 부전 및 /또는 감염의 표시를 위해 이식 후 밀접하게 따릅니다. 수술 후 합병증을 보이지 않는 쥐는 생존자로 간주되었다 (*p = 0.015, 카플란 마이어 추정에 의해 계산된 대로 [긴 순위 테스트]). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 간 조직 병리학 평가. 대표적인 헤마톡시린 및 에오신염색구간은 간간이식(LTx)이 끝난 후 6일과 13일에 간동맥(HA)을 재연결하지않고(B)가없는동물(A)에있다. (C)포털 트라이어드(포털 정맥, 동맥 및 담관), 중앙 정맥 및 아시니를 포함한 소구를 보여주는 정상 간 parenchyma. 포털 트라이어드 옆에 있는 간세포는 영역 1 간세포입니다. 로골 내의 중앙 정맥 옆에 있는 간세포는 영역 3 간세포입니다; 및 영역 1과 3 사이의 간세포는 영역 2 간세포 (ALT = 알라닌 아미노 전달제, AST = 아미노 트랜스퍼라제, CV = 중앙 정맥)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Figure 1
보조 도1: 스텐트 및 커프치치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Figure 2
보충 그림 2: 간 구실기종의 중단을 보여주는 간 조직 병리학 평가. 대표적인 헤마톡시린 과 에오신 염색 구간은 LTx 이후 54일, 96일, 111일 후에 HA재연결이 없는 동물의 경우.

보충 재료 1 : 포르타 커프 200g - 지원 2.0. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 재료 2 : 카바 커프 200g - 지원 2.0. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 재료 3 : 간 리트랙터 200g. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 재료 4 : 백 홀더 - 1.2. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 재료 5 : 카바 150g - 2.1. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 자료 6: 포르타 1.4.1. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 자료 7: 홀더 팔 맥길. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 소재 8: 홀더 미니 암 LAB. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 자료 9: 홀더 및 팔 소프트 파트 1.3. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

보충 자료 10: 홀더 베이스 - 3.1. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

Discussion

작은 동물 간 이식 모델은 이식 면역을 이해하고 새로운 치료 전략을 식별하는 데 중요하다32. 이상적인 작은 동물 간 이식 모델은 동맥 해부학을 포함하여 인체 절차의 모든 단계를 복제합니다. 대부분의 버전이 HA 해부학 단계를 통합하지 않기 때문에 쥐 OLT 모델의 결과를 해석하는 것은 어려울 수 있으며, 이는 합병증과이환율(42)의높은 비율로 이어진다. 일부 재건 절차는 신장 27의 제거를 필요로 하는 신장 동맥을이용했습니다. 이 프로토콜은 인간 적인 절차에서 일어나는 무슨 이상이기 때문에 기관 제거를 방지합니다.

동맥 재건은 또한 쥐대동맥(31)을조작하여 수행될 수 있다. 그러나 이러한 방법은 대동맥의 광범위한 해부 및 클램핑이 필요합니다. 클램프 시간이 연장되면 받는 쥐는 탈약허혈(43)과관련된 결과가 좋지 않습니다. 인간에서, LT 외과 기술은 수신자 위장 동맥 (GDA)의 결찰 그리고 분할을 관련시킵니다. 그러나, 설치류의 생리적 및 해부학적 특징은 이 기술을 사용하여 이식을 더 생리적으로 도전하게 하고 합병증으로 이어질 수 있습니다 (즉, 췌장 및 담즙 덕트35 및 담즙누설44). 이 프로토콜의 동맥 재연결은 이 도전을 우회하고, 덕트 혈류를 유지하고, 수령인 의 결과를 개선하기 위한 것입니다.

쥐 HA의 재건을 위한 슬리브 및 스텐팅 기술의 사용은 이전에설명되었다 27. 이 기술에서 스텐트는 가이드로 사용되며, 동맥은 기증자 체강 트렁크에서 받는 사람 공통 HA로 재구성됩니다. 받는 사람 공통 HA는 해부되고 받는 사람 GDA는27로묶여 있습니다. 그 결과, 수령인 BD의 하부에 혈액 공급과 췌장의 머리가 손상될 수 있다. 이 지역에 부수적인 순환은 종종 담관에 부적당한 혈류를 제공한다는 것을 믿어집니다. 예를 들어 이 프로토콜은 먼저 받는 사람 GDA를 마이크로혈관 클립으로 클램프한 다음 받는 사람 BD를 나눕니다. GDA가 고정되어 있는 경우 분할된 BD가 출혈되지 않습니다. GDA 클램프를 제거한 후 BD로부터 활발한 출혈이 관찰됩니다. 분할 된 받는 사람 담관에 좋은 흐름을 유지 하는이 프로토콜, 적절 한 간 혈액 관혈을 제공 하 고 후 OLT hypoxic 간 손상을 방지 하 여 받는 사람 간 조직의 생리학을 보호.

기증자 측에서는, HA 스텐트는 체강 트렁크, 좌측 위동맥 및 비장 동맥에서 패치를 만들어 쉽게 이식 준비 도중 체강 트렁크에 삽입됩니다. 스텐트는 넓은 개구부를 통해 삽입할 수 있으며, 이는 스텐트를 체강 트렁크에만 삽입하는 것보다 덜 어렵습니다. 24 G는 HA 스텐트에 사용하기에 이상적인 크기인 것으로 나타났습니다. 스텐트의 길이는 1.0-1.5mm 길이여야 하는데, 이는 수령인의 적절한 HA를 기증자의 일반적인 HA로 쉽게 끌어당길 수 있도록 하는 열린 게이트 역할을 하기 때문입니다. 10-0 에틸론 봉합사가 어디에 배치되는지 주의 깊게 주의를 기울이면, 이 연결을 통해 흐르는 혈액은 스텐트를 직접 만지지 않으며, 수령인의 적절한 HA는 내부에서 이를 보호하여 합병증의 위험을 줄입니다. 중요한 것은, 기증자의 HA는 혈관 경련을 피하기 위하여 결코 고정되지 않습니다. 동맥 재건의 성공은 기증자 GDA를 열어 두어 평가됩니다. 성공적인 해부학은 재건이 완료되면 기증자 GDA에서 좋은 혈류를 초래한다.

이 프로토콜에서, 다른 사람과 유사하게, SHVC 재연결은 가장 느린 단계이고 궁극적으로 간 단계의 기간을 지시합니다. 간 시간의 지속 시간이 증가함에 따라, 위험 허혈성 손상 및 간 기능 장애 증가45. OLT 쥐 모델의 또 다른 중요한 구성 요소는 접목, 스텐트 및 커프의 크기입니다. 접목이 너무 작으면 접목이 비틀거나 뒤집어 혈관 연결을 방해할 수 있습니다. 스텐트와 커프스의 크기는 쥐의 나이, 성별, 체중 및 변형에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 여기에 사용된 커프스의 크기는 이전에 설명된28로선택되었으며, 쥐 크기를 조절하는 커프 사이즈 1개를 사용했습니다. 후속 기간 동안 (즉, 간 혼잡, 부종, 아스테아시 또는 비장)의 징후는 없었다 (현재까지 : 중앙값 = 133 일 수술 후, 최소 = 115 일 후, 최대 = 161 일 후). 연령과 성별 을 모두 차지하는 다양한 쥐 균주에 대한 PV 및 IHVC의 적절한 크기를 결정하는 추가 연구가 보증됩니다.

이 수정된 쥐 OLT 프로토콜은 이전에 설명된 바와 같이 PV 및 IHVC에 대해3D,프팅 커프스를사용합니다. PV 및 IHVC를 연결하는 기존 방법에는 미세 수개기술(32),커프기술(46)및 미세 수거-임시 부목기술(47)이 포함된다. 3D 프래팅 커프 기법은 쥐 의 변형에 따라 커프의 크기를 표준화할 수 있고 준비 및 사용하기 쉽기 때문에 선택되었습니다. 동일한 치수를 가진 다량의 커프를 한 번에 인쇄할 수 있습니다. 커프의 바깥쪽 표면에는 두 개의 홈이 되어 서넥타이를 고정하고 미끄러지지 않도록 돕습니다. 또한 커프 디자인에 꼬리가 통합되어 커프스를 쉽게 조작할 수 있습니다. 전반적으로, 3D 프릭 커프스를 통합하면 간 시간을 단축하여 OLT 절차의 높은 성공률과 재현성을 초래한다고 믿어집니다. 이 기술은 또한 외과 학습 곡선을 단축한다는 것을 결정됩니다.

결론적으로, 기술된 프로토콜은 동맥 재연결 단계를 통합하여 인간 간 이식과 더 유사한 모델을 확립했다. 이 프로토콜은 간 이식의 많은 면역 학적 및 외과 적 측면을 연구하도록 적응 할 수 있으며 이식과 관련된 새로운 치료 개입을 테스트하는 모델로 사용될 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 UHN의 다기관 이식 프로그램의 자금과 토론토 일반 및 토론토 서부 재단의 지원을 통해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 Ethilon Ethicon 2830G 10-0 Ethilon Black 1X5" BV100-4 Taper
10mL Syringe BD B302995 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
1mL Syringe BD B309628 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
20mL Syringe BD B301031 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
3D Printed Cuff for IHVC Custom
3D Printed Cuff for PV Custom
3D Printed Holder for IHVC Custom
3D Printed Holder for PV Custom
3mL Syringe BD B309657 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
4-0 Sofsilk Coviden GS-835 Wx coded braided silk, 30", Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle
5-0 Monocryl Ethicon Y433H Undyed Monofilament 1X27" TF
5mL Syringe BD B309646 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
7-0 Silk Teleflex Medical 103-S Black
8-0 Prolene Ethicon 2775G 8-0 Prolene Blue 1X24" BV130-5 EVP Double Armed
Barraquer Micro Needle Holder Without Catch Aesculap Surgical Instruments FD231R Curved 120 mm, 4 3/4″
Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock Rumex International Co. 8-025T Small Size, Titanium
Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock Rumex International Co. 8-021T Small Size, Titanium
BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN BD Angiocath / Autoguard 382523 22 G x 1.00" (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min
BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel - Regular Wall. BD B305106 PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G
BD Precisionglide Syringe Needle 21G BD 305167 Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle
BD Precisionglide Syringe Needle 30G BD 305128 Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle
Betadine Solution by Purdue Products LP Purdue Products Lp 67618-150-17 10% povidone–iodine topical solution USP
Bupivacaine Injection BP 0.5% SteriMax Inc. DIN:02443694 0.5% (100mg/20mL)
Curved Tying Forceps Duckworth & Kent 2-501E 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm
DC Temperature Controller FHC Inc. 40-90-8D
DK Iris Scissors (Curved) Duckworth & Kent 1-211B Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm
Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs Decon Labs, Inc. 2716 Dilute to 70% with d2H2O
Fine Adjustable Wire Retractor Fine Science Tools 17004-05 Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer Harvard Appartus Limited 34-1040SV
Heparin LEO(heparin sodium) LEO Pharma Inc. DIN:00453811 10,000 i.u./10 mL
Ice-Pak Cryopak FIP88016 4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9% Piramal Healthcare Limited DIN: 02231929 250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25
Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps Duckworth & Kent 2-502N 5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm
Lactate Ringer's Injected USP, 1000mL Baxter Co. DIN: 00061085 JB2324
McPherson Tying Forceps Duckworth & Kent 2-500E 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm
Metzenbaum Scissors - 14.5 cm Fine Science Tools 14024-14 Straight Sharp/Blunt
Micro Kitzmiller Clamp Scanlan 3003-630 Jaw length 23mm, Length 11cm
Microscope-Leica M525 F20 Leica Microsystems No catalog number
Non-woven Gauze Sponges Fisherbrand 22-028-556
Olsen-Hegar with Suture Cutter Fine Science Tools 12002-14 15 mm cutting edge, 2mm jaw surface - 14cm
OptixCare Eye Lube, 25gm OptixCare ES-KE8O-69U1 Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant
Piperacillin sodium salt Sigma-Aldrich P8396 Penicillin analog
Puritan 3" Standard Cotton Swab w/Wooden Handle Puritan Medical Products Company LLC 803-WC Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle
Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock Fine Science Tools 12075-12 Round handles allow easy fingertip adjustments - 12.5cm
Shea Scissors Curved Blunt Fine Science Tools 14105-12 Transplant scissors with light and delicate pattern - 12cm
Stainless Steel Micro Serrefines Curved - 4mm Fine Science Tools 18055-06 Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g
Stainless Steel Micro Serrefines Curved - 6mm Fine Science Tools 18055-05 Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g
Stainless Steel Micro Serrefines Straight - 6mm Fine Science Tools 18055-03 Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g
Surgical Platform Custom, magnetic
SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine General Anesthetic Services, Inc V7015
T/Pump Localized Therapy Stryker TP700 Series
Vacuum-Pressure Pump Barnant Co. 400-1901
Vannas Scissors with Microserrations Straight Fine Science Tools 15070-08 Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm - 8.5cm
Vetergesic Buprenorphine Ceva Animal Health Ltd NAC No.:12380352 0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats
Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit Summit Hill Laboratories No catalog number
Surgical Drape PDC Healthcare DRP1824 Multi-purpose sterile clear plastic, 18" x 24", 40/case

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Observatory on Donation and Transplantation. Organ Donation and Transplantation Activities. , http://www.transplant-observatory.org/download/2016-activity-data-report (2016).
  2. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  3. Dopazo, C., et al. Analysis of adult 20-year survivors after liver transplantation. Hepatology International. 9 (3), 461-470 (2015).
  4. Schoening, W. N., et al. Twenty-year longitudinal follow-up after orthotopic liver transplantation: a single-center experience of 313 consecutive cases. American Journal of Transplantation. 13 (9), 2384-2394 (2013).
  5. Pischke, S., et al. Factors associated with long-term survival after liver transplantation: A retrospective cohort study. World Journal of Hepatology. 9 (8), 427-435 (2017).
  6. Hamdani, S., et al. Delayed and short course of rapamycin prevents organ rejection after allogeneic liver transplantation in rats. World Journal of Gastroenterology. 23 (38), 6962-6972 (2017).
  7. Endo, K., et al. Pretransplant replacement of donor liver grafts with recipient Kupffer cells attenuates liver graft rejection in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (5), 944-951 (2015).
  8. Zhao, Z., et al. IL-34 Inhibits Acute Rejection of Rat Liver Transplantation by Inducing Kupffer Cell M2 Polarization. Transplantation. 102 (6), e265-e274 (2018).
  9. Nagakawa, Y., et al. Over-expression of AIF-1 in liver allografts and peripheral blood correlates with acute rejection after transplantation in rats. American Journal of Transplantation. 4 (12), 1949-1957 (2004).
  10. Gao, L. H., Zeng, L. X., Chen, H. M., Wan, R. H. Cytomegalovirus infection accelerates the process of chronic rejection in rat liver transplantation. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2536-2538 (2013).
  11. Wu, Y., et al. Effects of combined genes of CTLA4Ig and IDO in post-liver transplantation immune tolerance of rats. Annals of Hepatology. 15 (5), 729-737 (2016).
  12. He, X. S., et al. Influence of warm ischemia injury on hepatic functional status and survival of liver graft in rats. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 2 (4), 504-508 (2003).
  13. Tamura, A., et al. Combination effect of tacrolimus and FTY720 in liver transplantation in rats. Transplantation Proceedings. 31 (7), 2785-2786 (1999).
  14. Wang, Z., et al. RhGH attenuates ischemia injury of intrahepatic bile ducts relating to liver transplantation. Journal of Surgical Research. 171 (1), 300-310 (2011).
  15. Jiang, J. W., et al. Chronic bile duct hyperplasia is a chronic graft dysfunction following liver transplantation. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1038-1047 (2012).
  16. Tang, Y., et al. S-Adenosylmethionine attenuates bile duct early warm ischemia reperfusion injury after rat liver transplantation. Molecular Immunology. 95, 83-90 (2018).
  17. Nosaka, T., Bowers, J. L., Cay, O., Clouse, M. E. Biliary complications after orthotopic liver transplantation in rats. Surgery Today. 29 (9), 963-965 (1999).
  18. Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47 (3), 428-431 (1989).
  19. Post, S., et al. The impact of arterialization on hepatic microcirculation and leukocyte accumulation after liver transplantation in the rat. Transplantation. 54 (5), 789-794 (1992).
  20. Hori, T., et al. Impact of hepatic arterial reconstruction on orthotopic liver transplantation in the rat. Journal of Investigative Surgery. 25 (4), 242-252 (2012).
  21. Zhou, S., et al. New method of stent-facilitated arterial reconstruction for orthotopic mouse liver transplantation. Journal of Surgical Research. 187 (1), 297-301 (2014).
  22. Noack, K., Bronk, S. F., Kato, A., Gores, G. J. The greater vulnerability of bile duct cells to reoxygenation injury than to anoxia. Implications for the pathogenesis of biliary strictures after liver transplantation. Transplantation. 56 (3), 495-500 (1993).
  23. Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26 (1), 198-205 (1997).
  24. Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62 (5), 582-587 (1996).
  25. Zhao, D., Wheatley, A. M. Orthotopic liver transplantation in the rat: comparison of models with and without rearterialization of the graft. European Surgical Research. 25 (5), 294-302 (1993).
  26. Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49 (4), 675-678 (1990).
  27. Liu, X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a New Technique for Reconstruction of Hepatic Artery during Liver Transplantation in Sprague-Dawley Rat. PLoS One. 10 (12), e0145662 (2015).
  28. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  29. Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16 (6), 664-669 (1973).
  30. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  31. Kashfi, A., et al. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation Proceedings. 37 (1), 185-188 (2005).
  32. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), a015495 (2013).
  33. Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45 (4), 830-832 (1988).
  34. Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48 (6), 1080 (1989).
  35. Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48 (1), 166-168 (1989).
  36. Shi, Y., et al. Magnetic ring anastomosis of suprahepatic vena cava: novel technique for liver transplantation in rat. Transplant International. 28 (1), 89-94 (2015).
  37. Dippe, B. E., et al. An improved model for rat liver transplantation including arterial reconstruction and simplified microvascular suture techniques. Journal of Investigative Surgery. 5 (4), 361-373 (1992).
  38. Kobayashi, E., Kamada, N., Goto, S., Miyata, M. Protocol for the technique of orthotopic liver transplantation in the rat. Microsurgery. 14 (8), 541-546 (1993).
  39. Oldani, G., et al. Efficient nonarterialized mouse liver transplantation using 3-dimensional-printed instruments. Liver Transplation. 22 (12), 1688-1696 (2016).
  40. Oldani, G., et al. Manufacturing devices and instruments for easier rat liver transplantation. Journal of Visualized Experiments. (75), e50380 (2013).
  41. Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22 (2), 62-68 (2002).
  42. Li, G. L., et al. High incidence of biliary complications in rat liver transplantation: can we avoid it? World Journal of Gastroenterology. 17 (26), 3140-3144 (2011).
  43. Zammert, M., Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping. Best Practice and Research: Clinical Anaesthesiology. 30 (3), 257-269 (2016).
  44. Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56 (1), 19-24 (1993).
  45. Ijtsma, A. J., et al. The clinical relevance of the anhepatic phase during liver transplantation. Liver Transplation. 15 (9), 1050-1055 (2009).
  46. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  47. Marni, A., Ferrero, M. E. A four-technique comparative study of orthotopic liver transplantation in the rat. American Journal of Surgery. 156 (3 Pt 1), 209-213 (1988).

Tags

의학 문제 165 직교 간 이식 간 동맥 해부학 간 동맥 재연결 포털 정맥 커프 적외선 정맥 카프 담관 스텐트 3D 인쇄 커프 기술 마이크로 혈관 기술 간 시간
직교 간 이식의 쥐 모형에 있는 동맥 재연결 후에 감소된 합병증
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, X. C., Sekhon, M., Ma, X. Z.,… More

Chen, X. C., Sekhon, M., Ma, X. Z., Manuel, J., Chung, S., He, E., Bartczak, A., Fischer, S., Thoeni, C., Oldani, G., Perciani, C. T., MacParland, S., McGilvray, I. Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation. J. Vis. Exp. (165), e60628, doi:10.3791/60628 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter