Summary
هنا ، نقدم طريقه لفحص العوامل الفيروسية المضادة للتهاب الكبد B التي تمنع تفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام المقايسة الخاص بالانقسام. هذا النظام يسمح بسهوله الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين وهو مناسب لتحديد مثبطات مثل هذه التفاعلات.
Abstract
هناك حاجه ماسه للعوامل العلاجية الجديدة للعدوى بفيروس التهاب الكبد B (HBV). علي الرغم من ان النظائر المتوفرة حاليا النيونوس (t) ide تمنع النسخ المتماثل الفيروسية ، فانها ليس لها تاثير مباشر علي التعبير عن البروتينات الفيروسية المنقولة من الحمض النووي الفيروسي الدائري المغلق (cccDNA). كما تحميل مستضد الفيروسية عاليه قد تلعب دورا في هذا السرطان المزمنة وذات الصلة HBV, الهدف من العلاج HBV هو القضاء علي البروتينات الفيروسية. HBV البروتين التنظيمية X (HBx) بربط البروتين الحمض النووي المضيف الضرر الملزمة 1 (DDB1) البروتين لتتحلل الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، مما ادي إلى تفعيل النسخ الفيروسي من cccDNA. هنا ، باستخدام نظام الفحص المتكامل لمسح البيانات ، نقدم نظاما شاملا للفحص المركب للتعرف علي مثبطات تفاعل HBx-DDB1. بروتوكولنا يتيح الكشف السهل لديناميكيات التفاعل في الوقت الحقيقي داخل الخلايا الحية. قد تصبح هذه التقنية فحصا رئيسيا لاكتشاف العوامل العلاجية الجديدة لعلاج عدوي HBV.
Introduction
فيروس التهاب الكبد B (HBV) العدوى هي مصدر قلق رئيسي في مجال الصحة العامة في جميع انحاء العالم ، مع التقديرات السنوية 240,000,000 الأشخاص المصابين بامراض مزمنة مع HBV و 90,000 الوفاات بسبب مضاعفات العدوى ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية (اتش سي سي)1. علي الرغم من ان العوامل العلاجية المضادة لHBV الحالية, النيونوس (ر) نظائرها ide, تمنع بما فيه الكفاية النسخ العكسي الفيروسية, انها نادرا ما تحقيق القضاء علي البروتينات الفيروسية, وهو الهدف السريري علي المدى الطويل. تاثيرها الفقراء علي القضاء علي البروتين الفيروسي ويرجع ذلك إلى عدم وجود تاثير مباشر علي النسخ الفيروسية من الفيروسات الفيروسية بشكل دائري مغلقه الحمض النووي (cccDNA) minichromosomes في نواه الخلايا الكبدية2.
يتم تنشيط النسخ HBV من قبل HBV التنظيمية X (HBx) البروتين3. وكشفت الدراسات الحديثة ان hbx يحط من الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، وهو عامل تقييد المضيف الذي يمنع HBV النسخ من cccdna ، عن طريق اختطاف DDB1-CUL4-ROC1 E3 اوبيكويتين يغاز مجمع4،5،6. ولذلك ، ويعتقد ان خطوه حاسمه في تعزيز النسخ الفيروسي من cccDNA هو التفاعل HBx-DDB1. المركبات القادرة علي تثبيط الربط بين hbx و DDB1 قد منع النسخ الفيروسية ، وفي الواقع تم تحديد نيتازوكسانيد كمثبط للتفاعل hbx-DDB1 عن طريق نظام الفرز المتقدمة في المختبر لدينا7.
هنا ، ونحن نقدم نظام الفرز لدينا مريحه تستخدم لتحديد مثبطات التفاعل hbx-DDB1 ، والتي تستخدم المقايسة التكميلية الانقسام لوسيفيراز7،8. وتنصهر وحدات الوحدات الفرعية لتقسيم لوسيفيراز إلى hbx و DDB1 ، ويجلب تفاعل hbx-DDB1 الوحدات الفرعية إلى القرب القريب لتشكيل انزيم وظيفي يولد اشاره مضيئه ساطعه. وبما ان التفاعل بين الوحدات الفرعية قابل للعكس ، فان هذا النظام يمكنه الكشف بسرعة عن البروتينات DDB1 (الشكل 1). وباستخدام هذا النظام ، يمكن فحص مكتبه مجمعه كبيره بسهوله ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف مركبات جديده قادره علي تثبيط تفاعل DDB1 بكفاءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: يبين الشكل 1(ا) التمثيل التخطيطي لفحص البيانات التحليلية المجزاه ، وترد عمليه الفحص في الشكل 1باء. ويمكن قياس ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي دون تحلل الخلية.
1. اعداد الخلية
- الحفاظ علي الخلايا الHEK293Tه المستزرعة في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ v/v الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1x البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية في 20 ٪ O2 و 5 ٪ CO2.
- بذور 5 × 106 خلايا في صحن 100 ملم مع 10 مل من dmem واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- Transfect عابره 1 ميكروغرام من HBx و DDB1 مع الluciferases الانقسام في الخلايا وفقا للأسلوب التالي.
ملاحظه: قد يعتمد مبلغ الحمض النووي البلازميد علي الوصي المستخدم. يجب تحديد الوضع الأمثل لانقسام لوسيفيراز إلى البروتين المستهدف مسبقا. في هذه الحالة, hbx تنصهر إلى lgbit في C-المحطة من hbx (hbx-lgbit) و DDB1 تنصهر إلى smbit في N-تيرمينوس من DDB1 (smbit-DDB1) قدمت أفضل النتائج (اي, ألمع إشارات لوسيفيراز). وقد تم الإبلاغ عن هذه العملية سابقا بالتفصيل7.- تمييع 1 ميكروغرام من hbx-lgbit التعبير عن البلازميد الحمض النووي و 1 ميكروغرام من smbit-DDB1 التعبير عن الحمض النووي البلازميد (جدول المواد) في العازلة الحمض النووي التكثيف (جدول المواد) إلى حجم إجمالي 300 μl.
- أضافه 16 μL من حل محسن (جدول المواد) ومزيج من vortexing ل 1 s.
- احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 3 دقائق.
- أضافه 60 μL من الكاشف ترانسفيكشن (جدول المواد) إلى العينة ومزيج من قبل vortexing ل 10 s.
- احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 8 دقائق.
- اثناء الحضانة ، يستنشق الوسط الثقافي من الطبق (أعدت في الخطوة 1.2) ، ويغسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة (تلفزيوني). أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح وأضافه 7 مل من DMEM.
- أضف 3 مل من DMEM إلى الأنبوب الذي يحتوي علي المجمعات الناقلة. اخلطيها بالأنابيب واضفي المجمعات الناقلة إلى الخلية في طبق 10 سم.
- احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية في حاضنه تحت 5 ٪ CO2 لمده 10 ساعة.
- Reseed الخلايا في لوحه بيضاء 96 جيدا في 5 × 104 خلايا/بئر في 50 μl متوسطه/جيدا وفقا للأسلوب التالي.
- أزلت ال ينفق خليه ثقافة متوسطه ويغسل خلايا مع 5 [مل] من [ببس].
- أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح ، أضافه 1 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا ، واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق لفصل الخلايا.
- أضافه 4 مل من DMEM وتفريق المتوسطة عن طريق التنضيد علي سطح طبقه الخلية عده مرات. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب.
- خلايا الطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
- تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من تلفزيوني.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة وتجاهل supernatant.
- تمييع الخلية بيليه مع مخزنه الخلية المتوسطة الثقافة (الجدول من المواد) تستكمل مع 10 ٪ لكثافة البذر من 1.0 x 106 خلايا/مل.
- ماصه 50 μL من تعليق الخلية في كل بئر من لوحه جيده 96 وأعاده الخلايا إلى الحاضنة.
- احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية تحت 5 ٪ CO2 لمده 10 ساعة.
2. الفحص المركب
- اثناء الحضانة ، تمييع مركبات الفحص (جدول المواد) والمذيبات (ثنائي ميثيل سولفوكسيد [dmso]) في تركيز 13.5 x. علي سبيل المثال ، إذا كان المخزون هو 10 ملم وتركيز الفرز هو 10 μM ، أضافه 1 μL من الحل الأسهم إلى 73.1 μL من المتوسطة الخلية الثقافة.
- أضافه 12.5 μL من الركيزة الاناره (جدول المواد) إلى كل بئر واحتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: كما الضوابط السلبية ، ينبغي ان الآبار في كلا طرفي لوحه (اي ، الاعمده 1 و 12) لا تحتوي علي الركيزة الاناره. - قياس التلالؤ الأساسي باستخدام مقياس الاناره (جدول المواد).
- مباشره بعد القياس الاولي ، أضافه 5 μL من المركبات والتحكم DMSO المخفف في الخطوة 2.1 إلى كل بئر.
ملاحظه: سيكون التركيز النهائي 10 μM. - قياس قيم التلالؤ كل 30 دقيقه لمده 2 ساعة.
ملاحظه: يجب احتضان لوحه في الظلام في درجه حرارة الغرفة. - حساب الآثار المثبطة بالمقارنة مع السيطرة DMSO العلاج بعد التطبيع إلى إشارات خط الأساس.
ملاحظه: يمكن ان يؤدي فحص كل مركب في تكرار أو ثلاث نسخ إلى تقليل التباين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد النتائج التمثيلية بعد استخدام هذا البروتوكول في الشكل 2الف وباء. وكانت نسبه الاشاره إلى الخلفية أكبر من 80 وكان عامل Z '9 (مؤشر الجودة القياسي الذهبي للفحص العالي الانتاجيه) أكبر من 0.5 ، مما يشير إلى ان نظام الفحص هذا كان مقبولا للفحص العالي الانتاجيه. مع تعيين عتبه > 40 ٪ تثبيط مقارنه مع السيطرة (dmso فقط) ، حددنا نيتازوكسانيد كدواء مرشح7. باستخدام هذا النظام ، يمكن العثور علي أفضل الادويه المرشحة عن طريق فحص الأخرى ، ومكتبات مجمع أكبر.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتحليل البيانات التحليلية المنقسمة لتفاعل HBx-DDB1. (ا) المبدا الذي يقوم عليه الكشف عن الربط DDB1 باستخدام نظام المقايسة التكميلية لتقسيم لوسيفيراز. الوحدات الفرعية لوسيفيراز منفصلة ، lgbit و smbit ، تنصهر إلى hbx و DDB1 ، علي التوالي. التفاعل HBx-DDB1 يجلب الوحدات الفرعية إلى قرب وثيق لتشكيل الانزيم الوظيفي الذي يولد اشاره الاناره. والتفاعل بين الوحدات الفرعية قابل للعكس. (ب) الفحص المجزا للوسيفيراز. بعد دمج البلازميدات للتعبير عن HBx تنصهر إلى LgBit و DDB1 تنصهر إلى SmBit ، تم أعاده البذور الخلايا في لوحه جيدا 96. أضافه الركيزة الاناره تمكن قياس النشاط لوسيفيراز دون خطوه تحلل الخلية. يمكن قياس أنشطه luciferase بعد أضافه مركبات الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج الناجحة لعمليه الفحص المجزاه. (ا) إشارات الاناره الاساسيه التمثيلية من صفيحه بئر 96. وتمثل كثافة luciferase بالأرقام وألوان. الاعمده 1 و 12 هي عناصر التحكم التي لم تتم أضافه الركيزة الاناره. وكان عامل Z أكبر من 0.5. (ب) نتيجة السلسلة الزمنيه التمثيلية لمستويات النشاط النسبية للوسيفيراز بعد أضافه مركبات الفحص إلى صفيحه بئر 96. يمثل المحور السيني التاثيرات المثبطة المحسوبة مقارنه بالتحكم (dmso) بعد التوحيد القياسي لنشاط لوسيفيراز الأساسي. وكان المركب الأكثر فعاليه nitazoxanide. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قمنا بتطوير طريقه فحص مريحه باستخدام اختبار المسح الذي تم تقسيمه للعثور علي مثبطات DDB1 الملزمة من HBx. ويمكن الكشف عن ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية دون الحاجة إلى تحلل الخلية. تثبيط التفاعل HBx-DDB1 يؤدي إلى استعاده Smc5/6 ، مما يؤدي إلى قمع النسخ الفيروسية ، والتعبير عن البروتين ، و cccDNA الإنتاج7. هذه اليه الجديدة للعمل المضاد للفيروسات قد تتغلب علي أوجه القصور في علاجات HBV الحالية.
علي الرغم من ان هناك عددا من الطرق المتاحة للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا الحية ، ودراسة هذه التفاعلات لا تزال صعبه10. إجراءاتنا بسيطه ويتطلب سوي وقت قصير للشاشة 1 96 لوحه جيدا. وعلاوة علي ذلك ، كانت نوعيه الفحص مرضيه مع ارتفاع درجه Z ' ، ومؤشر الجودة القياسية الذهب للفحص عاليه الانتاجيه9. قد يكون لدينا فحص مناسبه لاتمته الروبوتية11 وهو فحص فعال لاكتشاف المخدرات.
وفي حين ان البروتوكول الموصوف هنا يستخدم خط الخلية HEK293T لان فعاليته العالية في النقل وقدرته علي الانتشار العالي مناسبه للفحص العالي الإنتاجي ، يمكن تنفيذ طريقه الفحص هذه باستخدام خطوط خلوية أخرى (علي سبيل المثال ، HepG2) دون تعديلات7. كاستراتيجية واقعيه لفحص المركبات ، يمكن استخدام خلايا HEK293T في الفحص الأول تليها خلايا HepG2 في فحص التحقق من صحة الثانية. قد لا تظهر بعض المركبات نتائج هامه في خطوط الخلايا المختلفة عندما تعتمد التاثيرات علي أليات غير المباشرة.
وبما اننا نعتزم تطوير طريقه فرز عاليه الانتاجيه ، فان دراسات المصادقة اللاحقة ضرورية للتاكد مما إذا كانت المركبات المحددة تعمل كمثبطات تفاعل. انخفاض مستويات الإشارات المضيءه في هذا الفحص لا تتوافق دائما مع تثبيط تفاعل HBx-DDB1. اختبارات السمية الخلوية, دراسات ايمونوبريسيبيتيشن, والمزيد من التجارب المضادة لHBV مهمة لتاكيد الآثار7.
علي الرغم من اننا حددنا في وقت سابق نيتازوكسانيد كمثبط للتفاعل hbx-DDB1 عن طريق فحص مكتبه مركب صغيره نسبيا7، ويمكن اجراء دراسات أخرى تنطوي علي فحص المكتبات مجمع أكبر بكثير من السهل لتحديد المركبات الجديدة التي هي قادره علي تثبيط التفاعلات بروتين البروتين أكثر كفاءه. عند اجراء مثل هذا الفحص الإضافي ، يمكن استخدام نيتازوكسانيد كعنصر تحكم إيجابي لفحص. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق النظام الموصوف هنا علي التفاعلات البروتين البروتين الأخرى. تفاعلات بروتين بروتين هي فئة هامه من أهداف المخدرات12. في الواقع ، تتفاعل العديد من الفيروسات الأخرى مع العوامل المضيفة للنسخ المتماثل أو التعبير عن الامراضيها13،14. المقايسة المستندة إلى الانقسام luciferase الموصوفة هنا ، والتي تستهدف التفاعلات بين البروتينات الفيروسية والمضيفة ، قد توفر استراتيجية جديده لتطوير علاجات لHBV والامراض المعدية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المساعدة المقدمة من وزاره التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا واليابان (#19H03430 و #17K09405 إلى الأسلوب الذي و#19J11829 إلى K.S.) ، من خلال منحه المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره (#18H05024 إلى الأسلوب) ، من قبل برنامج البحوث المتعلقة بالتهاب الكبد من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية ، AMED (إلى الأسلوب ، #JP19fk021005) ، من خلال برنامج التنمية المبتكرة وتطبيق الادويه الجديدة للتهاب الكبد #JP19fk0310102 المؤسسة اليابانية لانزيمات التطبيقية ومن مؤسسه كوباياشي لأبحاث السرطان (إلى الأسلوب) ، من قبل GSK اليابان منحه البحوث 2018 (إلى K.S.) ، ومنحه من مؤسسه ميياكاوا للبحوث التذكارية (إلى K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
