Summary
在这里，我们提出了一种使用裂解荧光素酶检测系统来抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统易于检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于识别此类相互作用的抑制剂。
Abstract
迫切需要新的治疗乙型肝炎病毒（HBV）感染的治疗方法。虽然目前可用的核细胞（t）ide类比能有效抑制病毒复制，但它们对从病毒共价闭环DNA（cccDNA）转录的病毒蛋白的表达没有直接影响。由于高病毒抗原负荷可能在这个慢性和HBV相关的致癌作用，HBV治疗的目标是根除病毒蛋白。HBV调节蛋白X（HBx）与宿主DNA损伤结合蛋白1（DDB1）蛋白结合，降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，导致从cccDNA激活病毒转录。在这里，使用裂化荧光素酶补充测定系统，我们提出了一个全面的化合物筛选系统，以识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂。我们的协议能够轻松检测活细胞内的相互作用动力学。这项技术可能成为发现治疗HBV感染的新治疗剂的关键测定方法。
Introduction
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界一个重大的公共卫生问题，每年估计有2.4亿人长期感染乙肝病毒，9万人死于感染并发症，包括肝硬化和肝细胞癌（HCC）1。虽然目前抗HBV治疗剂，核细胞（t）类比，足以抑制病毒逆转录，但它们很少实现病毒蛋白的消除，这是长期的临床目标。它们对病毒蛋白消除的不良影响是因为他们对肝细胞核2中表皮病毒共价闭合环DNA（cccDNA）小染色体的病毒转录缺乏直接影响。
HBV转录由HBV调节X（HBx）蛋白3激活。最近的研究表明，HBx通过劫持DDB1-CUL4-ROC1 E3泛素结合酶复合物4，5，6，降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，这是阻止HBV转录从cccDNA的宿主限制因子。因此，促进来自cccDNA的病毒转录的关键步骤被认为是HBx-DDB1相互作用。能够抑制HBx和DDB1之间结合的化合物可以阻断病毒转录，事实上，硝基氧烷通过实验室7开发的筛选系统被确定为HBx-DDB1相互作用的抑制剂。
在这里，我们介绍我们方便的筛选系统，用于识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂，它利用裂性荧光素酶补充测定7，8。裂化荧光素酶亚单位与HBx和DDB1融合，HBx-DDB1相互作用使亚单位接近，形成产生明亮发光信号的功能酶。由于亚单位之间的相互作用是可逆的，该系统可以检测迅速分离的HBx-DDB1蛋白（图1）。利用该系统，可以很容易地筛选大型化合物库，从而发现能够有效抑制HBx-DDB1相互作用的新型化合物。
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Protocol
注：图1A显示了裂解荧光素酶测定的示意图表示，如图1B所示。图1B概述了测定过程。 相互作用动力学可以实时测量，无需细胞分变。
1. 细胞制备
- 在Dulbeco的改性Eagle培养基（DMEM）中保持培养的HEK293T细胞，辅以10%v/v胎儿牛血清（FBS），1x青霉素/链霉素在37°C，在20%O2和5%CO2中。
- 种子 5 x 106细胞放入 100 mm 的培养皿中，其 DMEM 为 10 mL，并在 37°C 下孵育过夜。
- 根据以下方法，用裂化荧光素酶将HBx和DDB1的瞬时转染1μg进入细胞。
注：质粒DNA转染的量可能取决于所使用的转染。与靶蛋白融合的裂性荧光素酶的最佳位置必须事先确定。在这种情况下，HBx 在 HBx （HBx-LgBit） 的 C 端与 LgBit 融合，DDB1 在 DDB1 的 N 端（SmBit-DDB1）与 SmBit 融合，提供了最佳结果（即最亮的荧光素酶信号）。此过程之前已详细报告7。- 在DNA冷凝缓冲液（材料表）中稀释1μg的HBx-LgBit表达DNA质粒和1μgSmBit-DDB1表达DNA质粒（材料表），总体积为300μL。
- 加入16μL的增强剂溶液（材料表），通过涡旋混合1s。
- 在室温下孵育样品3分钟。
- 将60μL转染试剂（材料表）加入样品，通过涡旋混合10s。
- 在室温下孵育样品8分钟。
- 在孵育期间，从培养基盘中吸出培养基（在步骤1.2中制备），用5 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。通过吸入移除 PBS 并添加 7 mL 的 DMEM。
- 在含有转染复合物的管中加入3 mL的DMEM。通过移液混合，并将转染复合物添加到10厘米盘中的细胞中。
- 在5%CO2以下的培养箱中，在37°C下孵育细胞10小时。
- 根据以下方法，在 5 x 104细胞/孔 50 μL 的介质/孔中，将细胞重新播种到白色 96 孔板中。
- 去除废细胞培养基，用5 mL的PBS洗涤细胞。
- 通过吸入去除PBS，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C孵育5分钟以分离细胞。
- 加入4 mL的DMEM，通过多次移液在细胞层表面分散介质。将细胞悬浮液转移到管子上。
- 在室温下，在500 x g下离心细胞5分钟。
- 丢弃上清液，在1mL的PBS中重新悬浮细胞颗粒。
- 在室温下将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
- 用缓冲细胞培养基（材料表）稀释细胞颗粒，辅以10%FBS，种子密度为1.0 x 106细胞/mL。
- 将50μL的细胞悬浮液放入96孔板的每个孔中，并将细胞返回到孵化器。
- 在37°C下孵育细胞，在5%CO2下孵育10小时。
2. 化合物筛选
- 在孵育过程中，以13.5倍的浓度稀释筛选化合物（材料表）和溶剂（二甲基磺酸二氧化硫[DMSO]）。例如，如果库存为 10 mM，筛选浓度为 10 μM，则向缓冲细胞培养基的 73.1 μL 中添加 1 μL 的库存溶液。
- 在每个井中加入12.5 μL的发光基板（材料表），并在室温下孵育5分钟。
注：作为负控制，板两端的孔（即1和12柱）不应含有发光基板。 - 使用光度计（材料表）测量基线发光。
- 在初始测量后，立即添加 5 μL 的化合物，并在步骤 2.1 中控制分量DMSO稀释到每个井中。
注：最终浓度为10μM。 - 每 30 分钟测量一次发光值 2 小时。
注：板应在室温下在黑暗中孵育。 - 在归一化基线信号后，通过与对照 DMSO 处理进行比较，计算抑制效果。
注：在重复或三联中筛选每种化合物可以减少变异。
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Representative Results
使用该协议后的代表性结果如图2A，B所示。信背景比大于80，Z'因子9（高通量筛选的黄金标准质量指数）大于0.5，表明该检测系统对于高通量筛选是可以接受的。与对照组（仅限DMSO）相比，阈值设置为>40%抑制，我们确定硝基氧烷为候选药物7。使用这个系统，通过筛选其他更大的化合物库可以找到更好的候选药物。
图1：HBx-DDB1相互作用的分路素酶分析的原理表示。（A） 使用裂分荧光素酶互补测定系统对HBx-DDB1结合进行基础检测的原理。分离的荧光素酶亚单位LgBit和SmBit分别融合到HBx和DDB1。HBx-DDB1 相互作用使亚单位接近，形成产生发光信号的功能酶。子单元之间的交互是可逆的。（B） 分光荧光素酶测定。在将质粒共同转染后，HBx融合到LgBit，DDB1融合到SmBit，细胞被重新播种到96孔板中。添加发光基板可以测量荧光素酶活性，而无需细胞溶解步骤。加入筛选化合物后可测量路西酶酶活性。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：裂性荧光素酶测定的成功结果。（A） 代表基线发光信号来自 96 孔板.路西法酶强度由数字和颜色表示。列 1 和 12 是未添加发光基板的控制。Z' 因子大于 0.5。（B） 在96孔板中加入筛选化合物后，相对荧光素酶活性水平的代表性时间序列结果。x 轴表示标准化到基线荧光素酶活性后与控制 （DMSO） 相比计算的抑制效应。最有效的化合物是硝胺。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们开发了一种方便的筛选方法，使用裂光酶测定法来发现HBx-DDB1结合抑制剂。相互作用动力学可以在活细胞中实时检测，而无需细胞变热。抑制HBx-DDB1相互作用导致Smc5/6的恢复，导致抑制病毒转录，蛋白质表达和cccDNA生产7。这种新的抗病毒作用机制可以克服目前HBV疗法的不足。
虽然有许多方法可用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，但检查这些相互作用仍然很困难。我们的程序很简单，只需要很短的时间来筛选一个96孔板。此外，筛选质量令人满意，Z分高，高通量筛选的黄金标准质量指数为9。我们的测定可能适用于机器人自动化11，是药物发现的有效检测。
虽然本文所述的协议使用了HEK293T细胞系，因为它的高转染效率和高增殖能力适合高通量筛选，这种筛选方法可以使用其他细胞系（例如HepG2）进行，无需修改7。作为筛选化合物的现实策略，HEK293T细胞可用于第一次筛选，随后在第二次验证筛选中使用HepG2细胞。当影响依赖于间接机制时，某些化合物可能不会在不同的细胞系中显示出显著的结果。
由于我们的目的是开发高通量筛选方法，因此有必要进行后续验证研究，以确认已识别的化合物是否作为相互作用抑制剂。此测定中的发光信号水平降低并不总是对应于 HBx-DDB1 相互作用的抑制。细胞毒性试验、共免疫沉淀研究以及进一步的抗HBV实验对于确认其效果具有重要意义。
尽管我们之前通过筛选一个相对较小的化合物库7，将氮氧化物胺确定为HBx-DDB1相互作用的抑制剂，但可以很容易地进行涉及筛选更大化合物库的进一步研究，以识别能够更有效地抑制蛋白质-蛋白质相互作用的新型化合物。在进行此类进一步筛选时，硝胺可用作检测的阳性对照。此外，此处描述的系统可应用于其他蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用是药物靶点12的重要一类。事实上，许多其他病毒与宿主因素相互作用，以复制或表达其致病性13，14。此处描述的基于裂解的荧光素酶测定，针对病毒蛋白和宿主蛋白之间的相互作用，可能为开发治疗乙肝病毒和其他传染病的新策略提供一种新策略。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了教育部的助学金支持， 文化、体育、科学和技术，日本（#19H03430和#17K09405，#19J11829到K.S.），由创新领域科学研究资助（#18H05024到M.O.），由日本医学研究和发展厅肝炎研究计划，AMED（M.O.，#JP19fk021005），由创新开发和应用新药物乙型肝炎（#JP19fk0310102日本应用酶学基金会和小林癌症研究基金会（M.O.），GSK日本研究赠款2018年（K.S.），以及宫川纪念研究基金会（K.S.）的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
