Identificación de inhibidores de la interacción HBx-DDB1 mediante un sistema de ensayo de Luciferase dividido
Summary
Aquí, presentamos un método para el cribado de agentes virales antihepatitis B que inhiben la interacción HBx-DDB1 utilizando un sistema de ensayo de luciferasa dividida. Este sistema permite una fácil detección de interacciones proteína-proteína y es adecuado para identificar inhibidores de dichas interacciones.
Abstract
Existe una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB). Aunque los nucleos(t)ide análogos disponibles actualmente inhiben poderosamente la replicación viral, no tienen ningún efecto directo sobre la expresión de proteínas virales transcritas a partir de un ADN circular covalentemente cerrado viral (CCCDNA). Como la alta carga de antígenos virales puede desempeñar un papel en esta carcinogénesis crónica y relacionada con el VHB, el objetivo del tratamiento del VHB es erradicar las proteínas virales. La proteína reguladora del VHB X (HBx) se une a la proteína de unión al daño del ADN huésped 1 (DDB1) para degradar el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), lo que resulta en la activación de la transcripción viral de cccDNA. Aquí, utilizando un sistema de ensayo de complementación de luciferasa dividida, presentamos un sistema de cribado compuesto integral para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1. Nuestro protocolo permite una fácil detección de la dinámica de interacción en tiempo real dentro de las células vivas. Esta técnica puede convertirse en un ensayo clave para descubrir nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por VHB.
Introduction
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un importante problema de salud pública en todo el mundo, con estimaciones anuales de 240 millones de personas infectadas crónicamente con vhVH y 90.000 muertes por complicaciones de la infección, como cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC)1. Aunque los agentes terapéuticos anti-HBV actuales, análogos de nucleos(t)ide, inhiben suficientemente la transcripción inversa viral, rara vez logran la eliminación de proteínas virales, que es el objetivo clínico a largo plazo. Su pobre efecto sobre la eliminación de proteínas virales se debe a su falta de efecto directo en la transcripción viral de los minicromosomas de ADN circular covalentemente cerrado (cccDNA) episómico en el núcleo de hepatocitos2.
La transcripción del VHB se activa mediante la proteína X reguladora del VHB (HBx)3. Estudios recientes revelaron que HBx degrada el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), un factor de restricción del host que bloquea la transcripción del VHB de cccDNA, mediante el secuestro de un complejo de ligasa de ubiquitina DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Por lo tanto, se cree que un paso crucial en la promoción de la transcripción viral de cccDNA es la interacción HBx-DDB1. Los compuestos capaces de inhibir la unión entre HBx y DDB1 pueden bloquear la transcripción viral, y de hecho nitazoxanida fue identificado como un inhibidor de la interacción HBx-DDB1 a través de un sistema de cribado desarrollado en nuestro laboratorio7.
Aquí, presentamos nuestro conveniente sistema de cribado utilizado para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1, que utiliza un ensayo complementario de luciferasa dividida7,8. Las subunidades de luciferasa divididas se fusionan a HBx y DDB1, y la interacción HBx-DDB1 acerca a formar una enzima funcional que genera una señal luminiscente brillante. Como la interacción entre las subunidades es reversible, este sistema puede detectar proteínas HBx-DDB1 que se disocian rápidamente (Figura 1). Usando este sistema, una gran biblioteca de compuestos se puede examinar fácilmente, lo que puede resultar en el descubrimiento de nuevos compuestos capaces de inhibir eficientemente la interacción HBx-DDB1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos un método de cribado conveniente utilizando un ensayo de luciferasa dividida para encontrar inhibidores de unión HBx-DDB1. La dinámica de interacción se puede detectar en tiempo real en células vivas sin necesidad de lisis celular. La inhibición de la interacción HBx-DDB1 conduce a la restauración de Smc5/6, lo que resulta en la supresión de la transcripción viral, la expresión de proteínas y la producción de ADNcccc7. Este novedoso mecanismo de acción antiviral puede s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (#19H03430 y #17K09405 a M.O., y #19J11829 a K.S.), por una Subvención en Ayuda para la Investigación Científica en Áreas Innovadoras (#18H05024 a M.O.), por el Programa de Investigación sobre Hepatitis de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico, AMED (a M.O., #JP19fk021005), por programa sobre el Desarrollo Innovador y la Aplicación de Nuevos Medicamentos para la Hepatitis B (#JP19fk0310102 a K.K.) la Fundación Japonesa para la Enzimología Aplicada y de la Fundación Kobayashi para la Investigación del Cáncer (a M.O.), por GSK Japan Research Grant 2018 (a K.S.), y por una subvención de la Miyakawa Memorial Research Foundation (a K.S.).
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
