Summary
Hier presenteren we een methode voor het screenen van anti-hepatitis B-virale middelen die de HBX-DDB1-interactie remmen met behulp van een split plaats-testsysteem. Dit systeem maakt een eenvoudige detectie van eiwit-eiwit interacties mogelijk en is geschikt voor het identificeren van remmers van dergelijke interacties.
Abstract
Er is dringend behoefte aan nieuwe therapeutische middelen voor infectie met het hepatitis B-virus (HBV). Hoewel momenteel beschikbare nucleos (t) IDE-analogen krachtig de virale replicatie remmen, hebben ze geen direct effect op de expressie van virale eiwitten die zijn getranscribeerd uit een virale covalent gesloten circulair DNA (cccDNA). Aangezien hoge virale antigeen belasting een rol kan spelen bij deze chronische en HBV-gerelateerde carcinogenese, is het doel van de behandeling met HBV om virale eiwitten uit te roeien. HBV regulerend proteïne X (HBx) bindt aan het host DNA damage-binding Protein 1 (DDB1) eiwit om structureel onderhoud van chromosomen 5/6 (Smc5/6) te degraderen, wat resulteert in activatie van virale transcriptie van cccDNA. Hier, met behulp van een split plaats complementatie assay systeem, presenteren we een uitgebreide samengestelde screeningsysteem om remmers van de HBX-DDB1 interactie identificeren. Ons protocol zorgt voor een eenvoudige detectie van interactie dynamiek in real-time binnen levende cellen. Deze techniek kan een belangrijke test worden om nieuwe therapeutische middelen te ontdekken voor de behandeling van HBV-infectie.
Introduction
Infectie met het hepatitis B-virus (HBV) is wereldwijd een belangrijk volksgezondheidsprobleem, met jaarlijkse schattingen van 240.000.000 mensen die chronisch zijn geïnfecteerd met HBV en 90.000 sterfgevallen als gevolg van complicaties van de infectie, waaronder cirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC)1. Hoewel de huidige anti-HBV therapeutische middelen, nucleos (t) IDE analogen, voldoende remmen virale omgekeerde transcriptie, ze zelden bereiken eliminatie van virale eiwitten, dat is de lange termijn klinische doelstelling. Hun slechte effect op de eliminatie van virale eiwitten is te wijten aan hun gebrek aan direct effect op virale transcriptie van episomale virale covalent gesloten circulair DNA (cccdna) minichromosomen in de hepatocyte Nucleus2.
HBV transcriptie wordt geactiveerd door HBV Regulatory X (HBx) Protein3. Recente studies toonden aan dat HBX structureel onderhoud van chromosomen degradeert 5/6 (Smc5/6), een hostbeperkings factor die HBV-transcriptie van cccdna blokkeert, via het hijacken van een DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitine ligase complex4,5,6. Daarom, een cruciale stap in het bevorderen van virale transcriptie van cccDNA wordt beschouwd als de HBx-DDB1 interactie. Verbindingen die kunnen remmen de binding tussen HBx en DDB1 kan virale transcriptie blokkeren, en inderdaad nitazoxanide werd geïdentificeerd als een remmer van de HBx-DDB1 interactie via een screeningsysteem ontwikkeld in ons laboratorium7.
Hier presenteren we ons handige screeningsysteem dat wordt gebruikt om remmers van de HBX-DDB1-interactie te identificeren, die gebruik maakt van een gesplitste plaats-Complementaire assay7,8. Split plaats subeenheden zijn samengesmolten naar HBX en DDB1, en de HBX-DDB1 interactie brengt de subeenheden in de nabijheid van een functioneel enzym dat een heldere lichtgevende signaal genereert vormen. Aangezien de interactie tussen de subeenheden omkeerbaar is, kan dit systeem snel dissocierende HBx-DDB1 eiwitten detecteren (Figuur 1). Met behulp van dit systeem, een grote samengestelde bibliotheek kan gemakkelijk worden gescreend, wat kan resulteren in de ontdekking van nieuwe verbindingen geschikt voor het efficiënt remmen van de HBx-DDB1 interactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: een schematische weergave van de gesplitste plaats test wordt weergegeven in Figuur 1Aen het testproces wordt beschreven in Figuur 1B. De interactie dynamiek kan in real-time worden gemeten zonder cellysis.
1. voorbereiding van de cel
- Onderhouden van gekweekte HEK293T cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% v/v foetaal runderserum (FBS), 1x penicillair/streptomycine bij 37 ° c bij 20% O2 en 5% Co2.
- Zaai 5 x 106 cellen in een schaal van 100 mm met 10 ml DMEM en inincuberen bij 37 °c 's nachts.
- Transitief transfect 1 μg HBx en DDB1 met gespleten luciferasen in de cellen volgens de volgende methode.
Opmerking: de hoeveelheid plasmide DNA-transport kan afhangen van de gebruikte transfectie regent. De optimale positie van de gesplitste plaats gefuseerde met het doeleiwit moet vooraf worden bepaald. In dit geval fuseerde HBX met lgbit op het C-Terminus van HBX (HBX-lgbit) en DDB1 samengesmolten tot smbit bij het N-eindpunt van DDB1 (smbit-DDB1), mits de beste resultaten (d.w.z. de helderste plaats-signalen). Dit proces is eerder in detail7gerapporteerd.- Verdun 1 μg HBx-LgBit die DNA-plasmide uitdrukt en 1 μg SmBit-DDB1 die DNA-plasmide (tabel van materialen) in DNA-condensatie buffer (tabel met materialen) tot een totaal volume van 300 μL uitdrukken.
- Voeg 16 μL versterker oplossing (tabel met materialen) toe en meng door grondig voor 1 s.
- Incuberen het monster bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
- Voeg 60 μL transfectie reagens (tabel met materialen) toe aan het monster en meng door grondig gedurende 10 sec.
- Incuberen het monster bij kamertemperatuur gedurende 8 min.
- Zuig tijdens de incubatie het kweekmedium op uit de schaal (bereid in stap 1,2) en was cellen met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder PBS door aspiratie en voeg 7 mL DMEM toe.
- Voeg 3 mL DMEM toe aan de buis die de transfectie complexen bevat. Meng door Pipetteer en voeg de transfectie complexen toe aan de cel in de 10 cm schaal.
- Incuberen de cellen bij 37 °C in een incubator onder 5% CO2 gedurende 10 uur.
- Reseed de cellen in een witte 96 goed plaat op 5 x 104 cellen/goed in 50 μL medium/goed volgens de volgende methode.
- Verwijder het gebruikte celkweekmedium en was cellen met 5 mL PBS.
- Verwijder PBS op aspiratie, voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA toe en inincuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten om cellen los te maken.
- Voeg 4 mL DMEM toe en dispergeren het medium door een aantal malen over het oppervlak van de cellaag te pipetteren. Breng de celsuspensie over naar een buis.
- Centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi supernatant weg en regeer de celpellet in 1 mL PBS.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
- Verdun de celpellet met gebufferd celkweekmedium (tabel met materialen) aangevuld met 10% FBS tot een zaaien dichtheid van 1,0 x 106 cellen/ml.
- Pipetteer 50 μL celsuspensie in elke put van een 96-goed plaat en retourneer de cellen naar de incubator.
- Incuberen cellen bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 10 uur.
2. samengestelde screening
- Verdun tijdens de incubatie de screenings verbindingen (tabel met materialen) en oplosmiddel (dimethylsulfoxide [DMSO]) bij 13,5 x concentratie. Als de voorraad bijvoorbeeld 10 mM is en de screening concentratie 10 μM is, voeg dan 1 μL stamoplossing toe aan 73,1 μL gebufferd celkweekmedium.
- Voeg 12,5 μL lichtgevend substraat (tabel van materialen) toe aan elk goed en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: als negatieve controles moeten de putjes aan beide uiteinden van de plaat (d.w.z. kolommen 1 en 12) geen lichtgevend substraat bevatten. - Meet de luminescentie van de basislijn met behulp van een luminometer (tabel met materialen).
- Onmiddellijk na de initiële meting, voeg 5 μL verbindingen en controle DMSO verdund in stap 2,1 aan elke put.
Nb: de uiteindelijke concentratie zal 10 μM zijn. - Meet de luminescentie waarden elke 30 min gedurende 2 uur.
Opmerking: de plaat moet bij kamertemperatuur in het donker worden geïnineerd. - Bereken de remmende effecten door vergelijking met de controle DMSO-behandeling na normalisatie naar de basislijn signalen.
Opmerking: het screenen van elke compound in duplicaat of drievoud kan variatie verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve uitkomsten na het gebruik van dit protocol worden weergegeven in Figuur 2A, B. De signaal-naar-achtergrond ratio was groter dan 80 en de Z ' factor9 (de Gold Standard Quality index voor high-throughput screening) was groter dan 0,5, wat erop duidt dat dit testsysteem acceptabel was voor screening met hoge doorvoer. Met de drempelwaarde ingesteld op > 40% remming in vergelijking met de controle (DMSO alleen), we identificeerden nitazoxanide als een kandidaat drug7. Met behulp van dit systeem, betere kandidaat drugs kunnen worden gevonden door het screenen van andere, grotere samengestelde bibliotheken.
Figuur 1: schematische weergave van Split plaats-analyse van de HBX-DDB1-interactie. A) het principe van de onderliggende detectie van HBX-DDB1 binding met behulp van het gesplitste plaats-Complementaire assay-systeem. De gescheiden plaats subeenheden, lgbit en smbit, zijn gefuseerd met respectievelijk HBX en DDB1. De HBx-DDB1 interactie brengt de subeenheden in de nabijheid van een functioneel enzym dat een lichtgevende signaal genereert vormen. De interactie tussen de subeenheden is omkeerbaar. B) bepaling van de plaats splitsing. Na co-transfectie van plasmiden voor expressie van HBx gesmolten tot LgBit en DDB1 gesmolten naar SmBit, cellen werden opnieuw in een 96 goed plaat. De toevoeging van lichtgevende substraat maakt meting van plaats activiteit zonder een cel lysis stap. Luciferase activiteiten kunnen worden gemeten na het toevoegen van de screening verbindingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: succesvolle resultaten van de split plaats test. A) representatievebasislijn lichtgevende signalen van a 96 well plate. De intensiteit van Luciferase wordt weergegeven door getallen en kleuren. De kolommen 1 en 12 zijn besturingselementen waarin het lichtgevend substraat niet is toegevoegd. De Z ' factor was groter dan 0,5. B) representatief tijdreeks resultaat van relatieve plaats-activiteitsniveaus na toevoeging van zeef verbindingen aan een goed plaat van 96. De x-as vertegenwoordigt de remmende effecten die zijn berekend in vergelijking met besturingselement (DMSO) na standaardisatie voor de baseline plaats-activiteit. De meest effectieve verbinding was nitazoxanide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwikkelden een handige screeningsmethode met behulp van een split plaats assay om HBX-DDB1 BIND remmers te vinden. De interactie dynamiek kan worden gedetecteerd in real-time in levende cellen zonder de noodzaak voor cel lysis. Remming van de HBx-DDB1 interactie leidt tot herstel van Smc5/6, wat resulteert in onderdrukking van virale transcriptie, eiwit expressie, en cccDNA productie7. Dit nieuwe mechanisme van antivirale actie kan de tekortkomingen van de huidige HBV-therapieën overwinnen.
Hoewel een aantal methoden beschikbaar zijn voor het onderzoeken van eiwit-eiwit interacties in levende cellen, het onderzoeken van deze interacties blijven moeilijk10. Onze procedure is eenvoudig en vereist slechts een korte tijd voor het scherm 1 96 goed bord. Bovendien was de screening kwaliteit bevredigend met een hoge Z ' Score, de Gold Standard Quality index voor screening met hoge doorvoer9. Onze assay kan geschikt zijn voor robot automatisering11 en is een efficiënte test voor het opsporen van geneesmiddelen.
Hoewel het hier beschreven protocol de HEK293T cellijn gebruikte omdat de hoge transfectie werkzaamheid en de hoge proliferatie capaciteit geschikt zijn voor screening met hoge doorvoer, kan deze screeningsmethode worden uitgevoerd met behulp van andere cellijnen (bijv. HepG2) zonder aanpassingen7. Als een realistische strategie voor het screenen van verbindingen, kunnen HEK293T cellen worden gebruikt in de eerste screening gevolgd door HepG2 cellen in een tweede validatie screening. Sommige verbindingen vertonen mogelijk geen significante resultaten in verschillende cellijnen wanneer de effecten afhankelijk zijn van indirecte mechanismen.
Omdat het onze bedoeling was om een screeningmethode met hoge doorvoer te ontwikkelen, zijn daaropvolgende valideringsstudies nodig om te bevestigen of de geïdentificeerde verbindingen functioneren als interactie remmers. Verlaagde niveaus van lichtgevende signalen in deze test komen niet altijd overeen met remming van de HBx-DDB1-interactie. Cytotoxiciteits testen, Co-Immunoprecipitation-onderzoeken en verdere anti-HBV-experimenten zijn belangrijk om de effecten7te bevestigen.
Hoewel we eerder nitazoxanide als een remmer van de HBx-DDB1-interactie identificeerden door een relatief kleinschalige samengestelde bibliotheek7te screenen, kunnen verdere studies met screening van veel grotere samengestelde bibliotheken gemakkelijk worden uitgevoerd om nieuwe verbindingen te identificeren die in staat zijn eiwit-eiwit interacties efficiënter te remmen. Bij het uitvoeren van een dergelijke verdere screening kan nitazoxanide worden gebruikt als een positieve controle voor de assay. Bovendien kan het hier beschreven systeem worden toegepast op andere eiwit-eiwit interacties. Eiwit-eiwit interacties zijn een belangrijke klasse van drug targets12. Sterker nog, veel andere virussen communiceren met hostfactoren om hun pathogeniteit13,14te repliceren of te uiten. De hier beschreven Split Luciferase-test, die de interacties tussen virale en gastheer eiwitten target, kan een nieuwe strategie bieden om behandelingen voor HBV en andere besmettelijke ziekten te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidie-in-hulp van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan (#19H03430 en #17K09405 tot M.O., en #19J11829 aan K.S.), door middel van een subsidie voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (#18H05024 to M.O.), door het onderzoeksprogramma over hepatitis van het Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling van Japan, AMED (naar M.O., #JP19fk021005), door programma voor de innovatieve ontwikkeling en de toepassing van nieuwe geneesmiddelen voor hepatitis B (#JP19fk0310102 tot K.K.) van AMED, door subsidies van de Japan Foundation for Applied enzymologie en van de Kobayashi Foundation for Cancer Research (to M.O.), door GSK Japan Research Grant 2018 (naar K.S.), en door een subsidie van de Miyakawa Memorial Research Foundation (aan K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
