Выявление ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1 с помощью системы сплит-люциферазы
Summary
Здесь мы представляем метод скрининга вирусных агентов против гепатита В, которые подавляют взаимодействие HBx-DDB1 с помощью разделенной системы анализов люциферазы. Эта система позволяет легко обнаруживать белково-белковые взаимодействия и подходит для выявления ингибиторов таких взаимодействий.
Abstract
Существует настоятельная необходимость в новых терапевтических агентах при инфекции, инфицированной вирусом гепатита В (HBV). Хотя в настоящее время доступнынущие нуклеосы (т)ide аналоги мощно подавляют репликацию вируса, они не имеют прямого влияния на выражение вирусных белков, транскрибированных из вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA). Поскольку высокая вирусная нагрузка антигена может играть определенную роль в этом хроническом и HBV-связанных канцерогенеза, цель лечения HBV является искоренение вирусных белков. HBV регулятивного белка X (HBx) связывается с хозяином ДНК-связывающего белка 1 (DDB1) белка для деградации структурного поддержания хромосом 5/6 (Smc5/6), в результате активации вирусной транскрипции от cccDNA. Здесь, используя систему проверки дополнения разделенной люциферазы, мы представляем комплексную комплексную систему скрининга для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1. Наш протокол позволяет легко обнаруживать динамику взаимодействия в режиме реального времени в живых клетках. Этот метод может стать ключевым ассеем, чтобы обнаружить новые терапевтические агенты для лечения HBV инфекции.
Introduction
Инфекция вируса гепатита В (HBV) является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, с ежегодными оценками 240 миллионов человек, хронически инфицированных HBV и 90000 смертей из-за осложнений от инфекции, в том числе цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1. Хотя нынешние анти-HBV терапевтические агенты, нуклеосы (т) аналоги, достаточно подавляют вирусную обратную транскрипцию, они редко достигают ликвидации вирусных белков, что является долгосрочной клинической целью. Их плохое влияние на устранение вирусного белка из-за их отсутствия прямого влияния на вирусную транскрипцию от эпизомальной вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA) минимомосомы в ядре гепатоцитов2.
Транскрипция HBV активируется HBV регулятивным X (HBx) белком3. Недавние исследования показали, что HBx деградирует структурное обслуживание хромосом 5/6 (Smc5/6), фактор ограничения хозяина, который блокирует Транскрипцию HBV от cccDNA, через угон DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin лигазе комплекс4,5,6. Таким образом, решающим шагом в продвижении вирусной транскрипции от cccDNA считается взаимодействие HBx-DDB1. Соединения, способные ингибировать связывание между HBx и DDB1 может блокировать вирусную транскрипцию, и действительно нитазоксанид был определен в качестве ингибитора взаимодействия HBx-DDB1 через систему скрининга, разработанную в нашей лаборатории7.
Здесь мы представляем нашу удобную систему скрининга, используемую для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1, которая использует разделенный люциферазы комплементарный анализ7,8. Сплит luciferase субъединиц сливается с HBx и DDB1, и взаимодействие HBx-DDB1 приносит подразделения в непосредственной близости к форме функционального фермента, который генерирует яркий люминесцентный сигнал. Поскольку взаимодействие между подразделениями обратимо, эта система может обнаруживать быстро диссоциирующие белки HBx-DDB1(рисунок 1). С помощью этой системы можно легко проверить большую библиотеку соединений, что может привести к открытию новых соединений, способных эффективно ингибировать взаимодействие HBx-DDB1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали удобный метод скрининга с использованием разделенной люциферазы, чтобы найти ингибиторы связывания HBx-DDB1. Динамика взаимодействия может быть обнаружена в режиме реального времени в живых клетках без необходимости в клеточном лизах. Ингибирование взаимодействия HBx-DDB1 п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Гранты в помощь от Министерства образования, Культура, спорт, наука и технологии, Япония (#19H03430 и #17K09405 до M.O., и #19J11829 к K.S.), грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям (#18H05024 к M.O.), по исследовательской программе по гепатиту от Японского агентства медицинских исследований и разработок, AMED (до M.O., #JP19fk021005), по программе по инновационному развитию и применению новых препаратов для борьбы с гепатитом B (#JP19fk0310102 к К.) грантов от AM Японский фонд прикладной энзимологии и от Фонда Кобаяси по онкологическим исследованиям (М.О.), GSK Japan Research Grant 2018 (к К.С.), а также грантом Мемориального исследовательского фонда Миякавы (К.С.).
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
