एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख सिस्टम का उपयोग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करना
Summary
यहां, हम एंटी-हेपेटाइटिस बी वायरल एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख सिस्टम का उपयोग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन को रोकते हैं। यह प्रणाली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का आसानी से पता लगाने की अनुमति देती है और ऐसी बातचीत के अवरोधकों की पहचान करने के लिए उपयुक्त है।
Abstract
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की तत्काल आवश्यकता है। हालांकि वर्तमान में उपलब्ध नाभिक (टी) आईडीई एनालॉग शक्तिशाली रूप से वायरल प्रतिकृति को रोकते हैं, लेकिन वायरल सहसंयोजक बंद परिपत्र डीएनए (सीसीसीटीएना) से लिखित वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर उनका कोई सीधा प्रभाव नहीं पड़ता है। चूंकि उच्च वायरल एंटीजन लोड इस पुरानी और एचबीवी से संबंधित कार्सिनोजेनेसिस में भूमिका निभा सकता है, इसलिए एचबीवी उपचार का लक्ष्य वायरल प्रोटीन को समाप्त करना है। एचबीवी नियामक प्रोटीन एक्स (एचबीएक्स) गुणसूत्रों 5/6 (Smc5/6) के संरचनात्मक रखरखाव को नीचा दिखाने के लिए मेजबान डीएनए क्षति-बाध्यकारी प्रोटीन 1 (DDB1) प्रोटीन को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप सीसीसीटीडीएनए से वायरल ट्रांसक्रिप्शन की सक्रियता होती है । यहां, एक विभाजन लूसिफ़ेरेज़ पूरक परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक व्यापक यौगिक स्क्रीनिंग प्रणाली पेश करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं के भीतर वास्तविक समय में बातचीत की गतिशीलता का आसानी से पता लगाने में सक्षम बनाता है। यह तकनीक एचबीवी संक्रमण के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की खोज करने के लिए एक महत्वपूर्ण परख बन सकती है।
Introduction
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है, २४०,०००,००० लोगों के वार्षिक अनुमानों के साथ लंबे समय से एचबीवी से संक्रमित और ९०,००० संक्रमण से जटिलताओं के कारण मौतें, सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी)1सहित । हालांकि वर्तमान एंटी-एचबीवी चिकित्सीय एजेंट, नाभिक (टी) इडालॉग, वायरल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को पर्याप्त रूप से रोकते हैं, वे शायद ही कभी वायरल प्रोटीन के उन्मूलन को प्राप्त करते हैं, जो दीर्घकालिक नैदानिक लक्ष्य है। वायरल प्रोटीन उन्मूलन पर उनका खराब प्रभाव हेपेटोसाइट नाभिक2में एपीसोमल वायरल सहसंयोजक रूप से बंद परिपत्र डीएनए (सीसीसीटीएना) मिनीक्रोमोसोम से वायरल ट्रांसक्रिप्शन पर सीधे प्रभाव की कमी के कारण है।
एचबीवी ट्रांसक्रिप्शन एचबीवी रेगुलेटरी एक्स (एचबीएक्स) प्रोटीन3द्वारा सक्रिय है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एचबीएक्स गुणसूत्रों 5/6 (Smc5/6) के संरचनात्मक रखरखाव को नीचा दिखाता है, एक मेजबान प्रतिबंध कारक है कि सीसीडीएनए से एचबीवी प्रतिलेखन ब्लॉक, एक DDB1-CUL4-ROC1 E3 सर्वव्यापी लिगास परिसर4,5,6अपहरण के माध्यम से । इसलिए, सीसीसीटीएसे वायरल ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण कदम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन माना जाता है। एचबीएक्स और डीडीबी1 के बीच बाध्यकारी को बाधित करने में सक्षम यौगिकों वायरल ट्रांसक्रिप्शन को अवरुद्ध कर सकता है, और वास्तव में नाइटाज़ोक्सनाइड को हमारी प्रयोगशाला7में विकसित स्क्रीनिंग प्रणाली के माध्यम से एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधक के रूप में पहचाना गया था।
यहां, हम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली अपनी सुविधाजनक स्क्रीनिंग प्रणाली पेश करते हैं, जो एक विभाजन लूसिफ़ेरेज़ पूरक परख7,8का उपयोग करता है। स्प्लिट लूसिफ़ेरेज उपइकाइयों को एचबीएक्स और डीडीबी1 में जोड़ दिया जाता है, और एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन उपइकाइयों को एक कार्यात्मक एंजाइम बनाने के लिए निकटता में लाता है जो एक उज्ज्वल ल्यूमिनेसेंट संकेत उत्पन्न करता है। चूंकि उपइकाइयों के बीच बातचीत उलटा है, इसलिए यह प्रणाली एचबीएक्स-डीडीबी1 प्रोटीन(चित्रा 1)को तेजी से अलग करने का पता लगा सकती है। इस प्रणाली का उपयोग करके, एक बड़े यौगिक पुस्तकालय की आसानी से जांच की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन को कुशलतापूर्वक बाधित करने में सक्षम उपन्यास यौगिकों की खोज हो सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एचबीएक्स-डीडीबी1 बाध्यकारी अवरोधकों को खोजने के लिए एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख का उपयोग करके एक सुविधाजनक स्क्रीनिंग विधि विकसित की। कोशिका ओं की आवश्यकता के बिना जीवित कोशिकाओं में वास्तविक स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को शिक्षा मंत्रालय से अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी, जापान (#19H03430 और M.O.के लिए #17K09405, और K.S. के #19J11829), एक अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (#18H05024 से M.O.), जापान एजेंसी से चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए हेपेटाइटिस पर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा, AMED (M.O., #JP19fk021005), अभिनव विकास और हेपेटाइटिस बी के लिए नई दवाओं के आवेदन पर कार्यक्रम द्वारा (#JP19fk0310102 के केके) से अनुदान से, AMईडी से अनुदान से जापान फाउंडेशन फॉर एप्लाइड एंजाइमोलॉजी और कोबायाशी फाउंडेशन फॉर कैंसर रिसर्च (एमओ) से, जीएसके जापान रिसर्च ग्रांट 2018 (केएस) द्वारा, और मियाकावा मेमोरियल रिसर्च फाउंडेशन (केएस) से अनुदान द्वारा।
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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