Identifiera hämmare av HBx-DDB1 interaktion med hjälp av en Split Luciferase assay system
Summary
Här presenterar vi en metod för screening anti-hepatit B-virala medel som hämmar HBX-DDB1 interaktion med hjälp av en Split luciferas assay system. Detta system möjliggör enkel detektering av protein-proteininteraktioner och är lämplig för att identifiera hämmare av sådana interaktioner.
Abstract
Det finns ett akut behov av nya terapeutiska medel för infektion med hepatit B-virus (HBV). Även om för närvarande tillgängliga nukleos (t) IDE analoger kraftigt hämmar viral replikering, de har ingen direkt effekt på uttrycket av virala proteiner transkriberas från en viral kovalent slutna cirkulära DNA (cccdna). Eftersom hög viral antigen belastning kan spela en roll i denna kroniska och HBV-relaterade carcinogenes, är målet med HBV-behandling att utrota virala proteiner. HBV reglerande protein X (HBx) binder till värden DNA-skadebindande protein 1 (DDB1) protein för att försämra strukturellt underhåll av kromosomer 5/6 (Smc5/6), vilket resulterar i aktivering av viral transkription från cccDNA. Här, med hjälp av en Split luciferas kompletterings analyssystem, presenterar vi ett omfattande sammansatt screening system för att identifiera hämmare av HBX-DDB1 interaktion. Vårt protokoll möjliggör enkel detektering av interaktionsdynamik i realtid inom levande celler. Denna teknik kan bli en viktig analys för att upptäcka nya terapeutiska medel för behandling av HBV-infektion.
Introduction
Hepatit B-virus (HBV) infektion är ett stort folkhälsoproblem över hela världen, med årliga uppskattningar av 240 000 000 personer kroniskt infekterade med HBV och 90 000 dödsfall på grund av komplikationer från infektionen, inklusive cirros och Hepatocellulär cancer (HCC)1. Även om den nuvarande anti-HBV terapeutiska medel, nukleos (t) IDE-analoger, tillräckligt hämma viral omvänd Transkription, de sällan uppnå eliminering av virala proteiner, vilket är det långsiktiga kliniska målet. Deras dåliga effekt på viral proteineliminering beror på deras avsaknad av direkt effekt på viral transkription från episomalt viral kovalent slutna cirkulära DNA (cccdna) minikromosomer i hepatocyte Nucleus2.
HBV-transkription aktiveras av HBV Regulatory X (HBx) protein3. Nyligen genomförda studier visade att HBX försämrar strukturellt underhåll av kromosomer 5/6 (Smc5/6), en värd begränsning faktor som blockerar HBV transkription från cccdna, via kapning en DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin Ligase Complex4,5,6. Därför är ett viktigt steg för att främja viral transkription från cccDNA tros vara HBx-DDB1 interaktion. Föreningar som kan hämma bindningen mellan HBx och DDB1 kan blockera viral transkription, och faktiskt nitazoxanide identifierades som en hämmare av HBx-DDB1 interaktion via ett screening system som utvecklats i vårt laboratorium7.
Här presenterar vi vår bekväma screening system som används för att identifiera hämmare av HBX-DDB1 interaktion, som utnyttjar en Split luciferas kompletterande analys7,8. Split luciferas subenheter är smält till HBX och DDB1, och HBX-DDB1 interaktion ger subenheter i närheten för att bilda ett funktionellt enzym som genererar en ljus självlysande signal. Eftersom interaktionen mellan subenheterna är reversibel kan systemet detektera HBx-DDB1-proteiner snabbt (figur 1). Med hjälp av detta system, en stor sammansatt bibliotek kan lätt screenas, vilket kan resultera i upptäckten av nya föreningar som kan effektivt hämma HBx-DDB1 interaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade en bekväm screeningmetod med hjälp av en Split luciferas analys för att hitta HBX-DDB1 bindande hämmare. Interaktiondynamiken kan upptäckas i realtid i levande celler utan behov av celllys. Hämning av HBx-DDB1 interaktion leder till återställande av Smc5/6, vilket resulterar i dämpning av viral transkription, proteinuttryck, och cccDNA produktion7. Denna nya mekanism för antiviral åtgärder kan övervinna bristerna i nuvarande HBV-terapier.
Äve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag-in-Aid från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan (#19H03430 och #17K09405 till M.O., och #19J11829 till K.S.), genom ett bidrag-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden (#18H05024 till M.O.), av forskningsprogrammet om hepatit från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling, AMED (till M.O., #JP19fk021005), genom program för innovativ utveckling och tillämpning av nya läkemedel för hepatit B (#JP19fk0310102 till KK) från AMED, genom bidrag från Japan Stiftelsen för tillämpad Enzymologi och från Kobayashi Stiftelsen för cancer forskning (till M.O.), av GSK Japan Research Grant 2018 (till K.S.), och genom ett bidrag från Miyakawa Memorial Research Foundation (till K.S.).
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
