Summary
Det nuværende manuskript beskriver, hvordan man isolerer hippocampus arterioler og kapillærer fra muse hjernen, og hvordan man presser dem til trykmyografi, immunofluorescens, biokemi og molekylære studier.
Abstract
Fra subtile adfærdsmæssige ændringer til sen-fase demens, vaskulær kognitiv svækkelse typisk udvikler efter cerebral iskæmi. Slagtilfælde og hjertestop er bemærkelsesværdigt seksuelt dimorfe sygdomme, og begge inducere cerebral iskæmi. Men, fremskridt i forståelsen af vaskulær kognitiv svækkelse, og derefter udvikle kønsspecifikke behandlinger, har været delvist begrænset af udfordringer i at undersøge hjernen mikrocirkulationen fra musemodeller i funktionelle undersøgelser. Her præsenterer vi en tilgang til at undersøge kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillar-parenchymal arteriole (hicapa) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver, hvordan man isolerer, kanyle og under tryk mikrocirkulationen for at måle arteriolær diameter som respons på kapillær stimulation. Vi viser, hvilke passende funktionelle Kontroller der kan bruges til at validere HiCaPA-præparatets integritet og vise typiske resultater, herunder test af kalium som et Neuro vaskulær koblingsmiddel og effekten af den nyligt karakteriserede inhibitor af Kir2 aktiv rektificerende kalium kanal familie, ML133. Desuden sammenligner vi svarene i præparater opnået fra mandlige og kvindelige mus. Selv om disse data afspejler funktionelle undersøgelser, kan vores tilgang også anvendes i molekylær biologi, immunokemi og Elektrofysiologi undersøgelser.
Introduction
Den piale cirkulation på overfladen af hjernen har været genstand for megen undersøgelse, dels på grund af dens eksperimentelle tilgængelighed. Men topologi af den cerebrale Vaskulaturen skaber særskilte regioner. I modsætning til den robuste Pial netværk rig på anastomoser med betydelig kapacitet til at omdirigere blodgennemstrømningen, intracerebral parenkymal arterioler (pas) nuværende begrænset sikkerhedsstillelse, hver af dem perfusing en diskret volumen af nervevæv1,2. Dette skaber en flaskehals effekt på blodgennemstrømningen, som kombineret med unikke fysiologiske funktioner3,4,5,6,7,8, gør intracerebral arterioler et afgørende sted for cerebral blodgennemstrømning (CBF) regel9,10. På trods af de tekniske udfordringer, som er forbundet med isolation og annullering af pas, har det sidste årti oplevet en øget interesse for ex vivo -funktionelle undersøgelser med trykbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En af grundene til denne øgede interesse er den betydelige forskningsindsats, der udføres på neurovaskulære kobling (NVC), mekanismen opretholde hjernen funktionelle hyperæmi18.
Regionalt kan CBF hurtigt stige efter lokal neurale aktivering19. De cellulære mekanismer og signalerings egenskaber, der styrer NVC, er ufuldstændigt forstået. Men vi identificerede en tidligere uventet rolle for hjernen kapillærer under NVC i sensing neurale aktivitet og omsætte det til et hyperpolariserende elektrisk signal til spile opstrøms arterioler20,21,22. Action potentialer23,24 og åbning af store-ledning ca2 +-aktiverede k+ (BK) kanaler på astrocytiske endfeet25,26 øge den interstitiel kalium ionkoncentration [K+]o, hvilket resulterer i aktivering af stærke indadgående ensretter k+ (Kir) kanaler i den vaskulære endotelum af kapillærer. Denne kanal er aktiveret af ekstern K+ , men også af hyperpolarisering selv. Ved at sprede sig gennem Gap-kryds, regenererer hyperpolariserende strøm i tilstødende kapillar endotelceller op til arterien, hvor det forårsager nekrotiske afslapning og CBF øger20,21. Studiet af denne mekanisme fik os til at udvikle et trykbærende kapillar-parenchymal arteriole (CaPA) præparat til måling af arteriolær diameter under kapillær stimulation med vasoaktive stoffer. CaPA-præparatet består af et cannuleret intracerebral arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreningen. Kapillar enderne komprimeres mod kammer glasbunden med en mikropipette, som tilstopper og stabiliserer hele vaskulære dannelsen20,21.
Vi har tidligere lavet instrumental innovationer af Imaging Capa præparater fra Mouse cortex20,21 og arterioler fra rat amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus Vaskulaturen modtager mere opmærksomhed på grund af dens modtagelighed for patologiske tilstande, her giver vi en trin-for-trin metode til CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA), der ikke kun kan anvendes i funktionelle NVC undersøgelser, men også i molekylær biologi, immunkemi, og Elektrofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC) af University of Colorado, Anschutz Medical campus og blev udført i henhold til retningslinjerne fra National Institutes of Health.
1. løsninger
- Brug MOPS-Buffered saltvand til dissektion og til at holde prøverne ved 4 °C før deres udnyttelse. Opløsningen må ikke gas. Forbered MOPS bufferet saltvand med følgende sammensætning: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2po4, 1 mm mgso4, 2,5 mm CaCl2,5mm glucose, 3 mm Mops, 0,02 mm EDTA, 2 mm pyruvat, 10 mg/mL bovint serumalbumin, pH 7,3 ved 4 °c.
- Brug kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) som bad opløsning og pipette opløsning. Gas både aCSF og ca2 +-fri acsf med 5% Co2, 20% O2, og N2 balance. Opløsningen forberedes med følgende sammensætning: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mm Nah2po4, 1 mm Mgcl2,4mm glucose, 2 mm CaCl2, pH 7,3 (med beluftning med 5% Co2, 20% O2og N2 balance).
- Opnå den maksimale dilatation i nominelt ca2 +-fri acsf (0 mm [ca2 +]o, 5 mm EGTA).
2. forberedelse af organ kammer
- Indsæt borosilikat glas kapillærer (udvendig diameter = 1,2 mm; indvendig diameter = 0,69 mm; længde = 10 cm) i en glas Puller. Træk kapillær for at lave en lang, tynd spids i den ene ende.
- Til den ene side af kammeret tilsættes en kanyle, der kan tilsluttes en miniature peristaltisk pumpe til luminally Tryk på fartøjet. Under en dissektion mikroskopet, bryde spidsen af kanylen, så det er lille nok til at passe fartøjet af interesse, men stort nok til at tillade løsninger til at flyde gennem spidsen. Sørg for, at spidsen er ca. 10-15 μm i diameter.
- Fyld kanylen ved hjælp af en sprøjte med et påsat 0,22 μm filter med oxygeneret aCSF. Sørg for, at der ikke er luftbobler eller snavs i kanylen.
- Tilsæt yderligere to kanyle til den modsatte side af kammeret. Må ikke bryde deres tips.
3. hippocampus dissektion og isolation
- Euthanize og halshug en mus. Til dette eksperiment, bruge en 8-ugers-gamle C57BL6/J mus til at sammenligne forskelle mellem mænd og kvinder. Injicer musen med pentobarbital og halshug med kirurgisk saks.
- Brug lille dissektion saks, skær huden langs midterlinjen på toppen af hovedet. Bevæg huden ud til siderne.
- Startende ved den hale side af kraniet, skær kraniet langs midterlinjen, indtil de olfaktoriske pærer er nået. Fjern dele af kraniet, indtil cerebrum er eksponeret.
- Langsomt fjerne hjernen, begyndende nær næsen af musen. Adskille hjernen fra olfaktoriske pærer, kranielle nerver, og rygmarven ved at skære gennem strukturerne med den lille dissektion saks.
- Placer hjernen i en dissektions plade med nok MOPS-løsning til at nedsænkes helt. Brug en dissektion mikroskop, Placer hjernen i midten af dissektions pladen med den ventrale side nedad.
- Ved hjælp af en barberkniv, skære hjernen i halve langs den langsgående fissure. Hold klingen, så den skarpe kant er parallel med bunden af dissektions pladen. Tryk kniven gennem hjernen i ét slag. Flyt en halvkugle til siden af pladen.
- Udfør følgende trin for hver halvkugle separat eller parallelt.
- Placer en halvkugle midt på pladen, så midterlinjen vender nedad. Brug derefter barberbladet til at skære langs den tværgående fissur for at fjerne cerebellum og hjernestammen. Skub klingen lige gennem vævet.
- Drej halvkugle, så den mediale side vender opad (figur 1A). Brug en spatel til at holde hjernen på plads. Brug en anden spatel, Indsæt spidsen under Corpus callosum og scoop nedenunder for at fjerne thalamus, septum og hypothalamus, der dækker hippocampus (figur 1B).
- Sørg for, at hippocampus nu er synlig som en buet struktur nær den bageste side af cerebrum. Ved hjælp af en spatel til at holde cerebrum på plads, bruge den anden spatel til at scoop hippocampus ud af cerebrum (figur 1C).
- Overfør hippocampi til en ny dissektions plade fyldt omkring halvvejs med MOPS-løsning. Kassér resten af hjernen.
4. hippocampal arteriole isolation
- Gennemfør følgende trin for hver hippocampus.
- PIN ned en af hippocampi ved hjælp af små stifter i hver ende af afsnittet. Hippocampalarterien vender opad.
- Brug meget skarpe pincet, forsigtigt strække små sektioner af hippocampus. Dette vil løsne vævet omkring arterioler, hvilket gør det lettere at dissekere dem.
- Søg gennem dorsale hippocampale væv for at identificere den eksterne tværgående arterier (figur 1C)16,27.
- Grib forsigtigt den eksterne tværgående arterie, og træk den langsomt væk fra vævet for at indsamle arterioler og kapillærer, der er perfekteret i området med hippocampus.
- Når der ikke er flere fartøjer til at blive fjernet fra vævet, kassere hippocampi. Opbevar beholderne på is i plader, mens de ikke er i brug.
5. hippocampal kapillar-parenchymal arteriole kanyle
- Find en arteriol med en gren, der ender med kapillærer. Overføres til organ kammeret. Sørg for, at arterien er ca. 15-30 μm, når den er helt forstøreret (figur 1D).
- Monter forsigtigt blodkar ved at skubbe kanylespidsen gennem arteriole væggen under målområdet. Skub forsigtigt beholderen på kanylen, indtil der er nok væv til at placere slips på.
- Lav en løs knude med 12-0 nylon suturer, så den passer over blodkar og kanyle. Brug en halv-hitch knude til at sikre bånd. Træk derefter enderne for at stramme knuden og fastgør arterien til kanyle. Fjern eventuelle fremmede fartøjs grene under slipset ved forsigtigt at trække dem med pincet.
- Lav en anden slips og fastgør den i den anden ende af arterien for at forsegle den.
- Sænk kanylen med det vedlagte fartøj, indtil det er fladt mod dæksedlen på bunden af kammeret. Vær omhyggelig med ikke at sænke kanylen for meget, eller det vil bryde.
- Ved hjælp af en kanyle på den modsatte side af kammeret, sænke det, så det punkt, det stifter ned slips på enden af arterien.
- Brug den tredje kanyle til at fastgøre kapillar grenen til dæksedlen. Placer spidsen tæt på enden af grenen, mens enderne af kapillærer eksponeret (ikke under kanyle).
6. Tryk myografi
- Flyt kammeret fra dissektions området til mikroskop med optagelses softwaren.
- Tilslut tilstrømningen og udstrømnings slangen til kammeret for perfusion. Start perfusion med opvarmet aCSF (37 °C) med en strømningshastighed på 4 mL/min.
- Fastgør tryk kanylen til en peristaltisk pumpe parret med en tryktransducer og Bring det interne tryk til 20 mm Hg.
- Start optagelses softwaren. Juster indstillingerne for mikroskop og billeddannelse for at opnå det klareste billede, du har mulighed for. Begynd optagelsen, når indstillingerne er optimeret til detekterings softwaren.
- Øg fartøjets Tryk op til 40 mm Hg, mens du optager den arterielle diameter med en kant detekterings software.
- Lad ~ 15-20 min til at vaske MOPS opløsning ud af kammeret med aCSF, og at lade HiCaPA forberedelse til at ækvibrere og udvikle myogen tone.
- For at afprøve et fartøjs levedygtighed skal der anvendes 1 μM NS309 opløsning på badet perfusion (Se figur 2a, B og afsnittet om repræsentative resultater). Arteriolær-segmentet skal dilatere, hvilket viser ca. 30-40% myogen tone som tidligere beskrevet3,14,20.
7. fokal stimulering af kapillar afslutninger
- Når den grundlæggende tone for arterien er fastslået, og endotelfunktionen er vurderet, skal reaktionen på kapillær stimulation testes.
- Ved hjælp af en glas Puller, gøre kanyle, så der er et fint punkt i den ene ende. Bryd spidsen af en kanyle, så det testede stof kan flyde gennem spidsen jævnt ved 5 psi.
- Fyld kanylen med lægemidlet løsning af interesse og tilføje det til en 3-akse micromanipulator knyttet til mikroskopet. Tilslut slangen fra tryk udslyngning system til kanyle.
- Langsomt sænke kanylen i badet nær kapillærer, at være omhyggelig med ikke at ramme nogen del af skibet eller hardware i kammeret. Manøvrere spidsen af kanyle ved siden af enderne af kapillærer uden at røre dem. Hold spidsen af kanylen lige ved dæksedlen for at forhindre, at beholderen bliver stimuleret, hvis kanylen lækker.
- Når du er klar til at stimulere kapillærer, sænke kanylen til dæksedlen og lige ved siden af kapillærer. Aktivér tryk udslyngning system med den ønskede udslyngning tid (her 20 s). Når stimuleringen er færdig, løft kanylen lidt for at undgå yderligere stimulation.
- Gentag stimulation, hvis det er nødvendigt. Skift tryk udslyngning system kanyle til at teste forskellige narkotika forbindelser.
- For at bekræfte, at kun kapillærer bliver stimuleret, fyld kanylen med 1 μM NS309 opløsning og Gentag ovenstående trin.
Bemærk: kapillar endotelceller udtrykker ikke K+ kanaler, som aktiveres af NS309, så arterien må ikke reagere på stimuleringen. Hvis arterien udvider, skal kanylen placeres igen, eller hullets diameter skal være mindre (Se figur 2A, B og afsnittet om repræsentative resultater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endothelial lille-ledning (SK) og intermediær-lednings-(IK) ca2 +-følsomme K+ kanaler har en forhalings indflydelse på diameteren af pas. Bad anvendelse af 1 μM NS309, en syntetisk IK og SK kanal agonist, forårsaget nær maksimal dilatation (figur 2a, B). Men, kapillar endotelceller mangler IK og SK kanaler og ikke hyperpolarize som reaktion på NS30920. Som et resultat, stimulerende kapillar ender med 1 μM NS309 ved brændtryk udslyngning (20 s, 5 PSI) ikke forårsager opstrøms arteriolær dilatation (figur 2a, B). Dette resultat indikerer, at NS309 ikke nåede arterien i HiCaPA præparater og kunne bruges som en kontrol til at vurdere den rumlige begrænsning af stoffet påføres kapillærer ved tryk udslyngning.
Dette præparat var grundlæggende designet til måling af indvendig-ud elektrisk signalering fra kapillærer til PAs. Ved hjælp af HiCaPA- præparatet anvendte vi acsf indeholdende 10 mm K + på kapillar enderne og målte en opstrøms arteriolardilatation (figur 2A, C), som vi tidligere gjorde i Capa præparater fra den kortikale Vaskulaturen20. Vi undersøgte derefter, for første gang til vores viden, kapillær-til-arteriole elektrisk signalering i hunmus ved hjælp af HiCaPA præparater. Arteriolardilatation fremkaldt af kapillær stimulation med 10 mM K+ var ikke forskellig mellem præparater fra mandlige og hunmus (figur 2A, C).
Endelig er en anden grundlæggende fordel ved denne fremgangsmåde muligheden for at anvende farmakologiske værktøjer i badet før kapillær stimulation. Her testede vi effekten af ML133, en nyligt udviklet Kir2 inhibitor28. Tilsætning af 10 μM ML133 til badet perfusion næsten afskaffet kapillær-induceret arteriolardilatation som respons på 10 mM K+ i HiCaPA præparater fra både mandlige og hunmus (figur 2a, C). Dette sidste resultat tyder på, at KIR 2.1 kanalen formidler elektrisk signalering i kvindelig cerebral vaskulatur som vi tidligere beskrevet i den kortikale mikrocirkulation af den mandlige hjerne.
Figur 1: metode til isolering og tryk af hippocampus kapillar-parenchymal arterioler (HiCaPA) forberedelse fra mus. A) nyisoleret hjerne skæres halvt ned i det sagittale plan efter den interhalvkugle formede fissur og anbringes med den mediale side opad. (B) thalamus, septum, og hypothalamus er forsigtigt fjernet for at afsløre hippocampus. (C) hippocampus fjernes forsigtigt. D) arterioler med kapillar træer isoleres fra hippocampus, og den ene ende af arteriolarsegmentet annulleres med en mikropipette, der er forbundet med et trykbærende system, og den anden ende er blokeret. Kapillar ender forsegles og vedligeholdes mod dæksedlen med spidsen af en glas pipette. Den indvendige diameter overvåges med et kant detekteringssystem i en eller flere områder af arterien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fokal stimulation af kapillærer med 1 μM NS309 har ingen effekt på opstrøms arteriolær diameter, i modsætning til stimulation med aCSF indeholdende 10 mM K+. A) repræsentativ registrering af den opstrøms arteriolære diameter, der viser virkningen af badet anvendelse af 1 μm NS309 efterfulgt af successive kapillar ender stimulation (20 s, 5 PSI) med 1 μm NS309 og med acsf indeholdende 10 mm K+ i fravær eller tilstedeværelse af Kir2 kanal hæmmer ML133. Påføring af 10 mM K+ på kapillærer medførte en hurtig opstrøms arteriolardilatation, som blev blokeret af 10 μM ML133. NS309 ikke forårsage dilatation. Fraværet af opstrøms arteriolardilatation som reaktion på kapillær stimulation med NS309 illustrerer, at tryk udslynget forbindelser ikke når arterien. B) summariske data, der viser diameterændringer induceret af 1 μM NS309 anvendt i badet eller på kapillar enderne (n = 14; * * * *p < 0,0001, parret t-test). C) summariske data, der viser arteriolær diameterændringer induceret af 10 mm K+ påføres direkte på kapillærer i hicapa præparater fra mandlige (n = 6) eller kvindelige (n = 8) mus før og efter 10 μM ML133 blev anvendt i badet (* * *p < 0,0005, n.s. = ikke-signifikant, uparret t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det trykbærende hicapa (hippocampus kapillar-parenkymal arteriole), der er beskrevet i dette manuskript, er en udvidelse af vores veletablerede procedure til at isolere, under tryk og studere parenkymal arterioler29. Vi rapporterede for nylig, at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillar endotelceller Sense stigninger i [K+]o forbundet med neurale aktivering, og generere et stigende hyperpolariserende signal, der udvider upstream arterioler20. Afslører denne tidligere uventede rolle for kapillærer har været muligt til dels ved at udvikle Capa forberedelse fra kortikale mikrocirkulationen20,21. Dette manuskript præsenterer en lignende eksperimentel tilgang, men fra en dybere og mere begrænset struktur af muse hjernen til at beskrive en enkel og reproducerbar tilgang til at undersøge kapillar-til-arteriole signalering under Neuro vaskulær kobling.
Hjernen mikrocirkulationen er udsøgt skrøbelig, og visse praksisser, især minimering af stretching og håndtering af skibene, skal anvendes til at sikre overlevelsen af arterioler og kapillærer. Den spontane udvikling af den myogene tone er den første indikator for et præparatets levedygtighed30. Endotelfunktionen kan derefter vurderes ved at tilføje SK-og IK-kanalernes agonist NS309 til badet løsning, som bør forårsage nær maksimal dilatation. I tilfælde af manglende udvikling af tone eller respons på badet anvendelse af NS309, bør præparatet udskiftes med en anden. NS309 bruges også til at teste spredningen af den fokale kapillær stimulation. Da kapillar endotelceller mangler SK-og IK-kanaler20, bør lokal levering af NS309 på kapillærer ved tryk udslyngning ikke have nogen effekt på opstrøms arteriolære diameter som vist i figur 2, hvilket illustrerer, at forbindelser ikke ved et uheld stimulerer arterien. Når disse trin er valideret, kan kapillær-til-arteriole signalering testes.
Her undersøgte vi elektrisk signalering ved at stimulere kapillærer med aCSF indeholdende 10 mM K+. Men, forskellige signalering modaliteter kan udforskes ved hjælp af den nuværende tilgang ved at stimulere kapillærer med forskellige kendte vasoaktive agenter eller neurotransmittere. En anden fordel ved dette præparat er muligheden for at undersøge og i sidste ende sammenligne NVC mellem forskellige dyr og mellem forskellige hjerneområder. Dette er især interessant, fordi hjernen ikke er ensartet målrettet af cerebrovaskulære patologier31,32. En generel begrænsning af den fremgangsmåde, der præsenteres her er, at ved at isolere mikrocirkulationen, er afgørende komponenter i den neurovaskulære enhed, såsom neuroner og astrocytter, tabt. Andre præparater, såsom kraniet vindue til in vivo CBF Imaging, opretholde strukturen af den intakte neurovaskulære enhed og er mere hensigtsmæssigt at studere NVC i et intakt system. Men i den kranie vindue forberedelse, parenkymal arterioler er vanskelige at billedet uden specifikt udstyr, som et multifoton mikroskop, og dybere regioner, såsom hippocampus, fortsat vanskeligt at billedet. I denne forbindelse er den fremgangsmåde, som er udviklet i Filosa-laboratoriet ved hjælp af luminale flow til at fremkalde myogen tone i hjerne skiver, en elegant forbindelse mellem hjerne skive og in vivo -tilgange33. Men, det omgivende nervevæv kan begrænse indtrængning af et lægemiddel påføres topisk, øge sin off-Target potentiale og gøre fortolkninger vanskelige, fordi flere celletyper er udsat for narkotika. Vi har primært udviklet vores ex vivo tilgang til at løse disse potentielle problemer. Afslutningsvis, flere tilgange bør anvendes i forbindelse med fuldt ud at studere NVC.
Sammenfattende beskriver denne rapport en ex vivo intakt tilberedning af trykbærende hippocampus arterioler og kapillærer, der gør det muligt at under prøve virkningerne af farmakologiske og biologiske agenser på funktionelle parametre ved diskrete positioner langs kapillar-arteriole kontinuumet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jules Morin for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet. Denne forskning blev finansieret af Awards fra CADASIL sammen har vi håbet non-profit organisation, Center for Women's Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
