Summary
Billeddannelse af bakterieceller er en ny systembiologitilgang, der fokuserer på at definere statiske og dynamiske processer, der dikterer funktionen af store makromolekylære maskiner. Her er integration af kvantitative levende celle imaging og kryo-elektron tomografi bruges til at studere Legionella pneumophila type IV sekresion system arkitektur og funktioner.
Abstract
Dot/Icm sekresionssystemet af Legionella pneumophila er et komplekst type IV sekredionssystem (T4SS) nanomaskine, der lokaliserer på bakteriestangen og formidler leveringen af protein og DNA-substrater til at målrette celler, en proces, der generelt kræver direkte celle-til-celle kontakt. Vi har for nylig løst strukturen af Dot / Icm apparat ved kryo-elektron tomografi (cryo-ET) og viste, at det danner en celle kuvert-spænder kanal, der forbinder til en cytoplasmatisk kompleks. Anvendelse af to komplementære tilgange, der bevarer den oprindelige struktur af prøven, fluorescerende mikroskopi i levende celler og cryo-ET, giver mulighed for in situ visualisering af proteiner og assimilering af stoichiometri og timing en produktion af hver maskine komponent i forhold til andre Dot / Icm underenheder. For at undersøge kravene til polar positionering og til at karakterisere dynamiske funktioner forbundet med T4SS maskine biogenese, har vi smeltet et gen kodning superfolder grøn fluorescerende protein til Dot / Icm ATPase gener på deres indfødte positioner på kromosomet. Følgende metode integrerer kvantitativ fluorescensmikroskopi af levende celler og kryo-ET for at kvantificere polarlokalisering, dynamik og struktur af disse proteiner i intakte bakterieceller. Anvendelse af disse tilgange til at studere Legionella pneumophila T4SS er nyttigt for at karakterisere funktionen af Dot / Icm systemet og kan tilpasses til at studere en bred vifte af bakterielle patogener, der udnytter T4SS eller andre typer af bakteriel sekresion komplekser.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), det ætiologiske agens af legionærsyge' sygdom, lever ferskvandsreservoirer, hvor bakterierne formerer sig ved at inficere og replikere i akvatisk frisvømning protozoer. L. pneumophila forårsager sygdomsudbrud hos mennesker, når indånding af aerosoliserede bakterier fra drikkevandskilder forekommer. I inficerede celler, subversion af vært veje tillader L. pneumophila at forsinke endocytisk modning af vacuole, hvor det er bosat, og at fremme biogenese af en cellulær rum, der understøtter bakteriel replikation. Denne proces er drevet af en specialiseret bakteriel type IVB sekretion system (T4BSS) kendt som Dot / Icm og dens repertoire af over 300 "effektor" proteiner, der er omlagt til værten cytosol under infektion for at lette manipulation af cellulære funktioner1,2,3,4,5. Mutanter, der mangler et funktionelt Dot/Icm-apparat, leverer ikke effektorer ind i værtscytosolen, er defekte for intracellulær replikering og er avirulente i dyremodeller af sygdom6,7.
Mange bakteriearter har udviklet ekstremt komplekse og dynamiske multikomponentmaskiner, der er nødvendige for infektionsprocesser. Andre T4BSS som Dot / Icm systemet er også afgørende for intracellulære replikering af bakterielle patogener såsom Coxiella burnetii og Rickettsiella grylli. Selvom T4BSS er evolutionært relateret til prototypiske type IVA-systemer, som mægle DNA-overførsel og kan levere et begrænset repertoire af effektorproteiner, har Dot/Icm-systemet næsten dobbelt så mange maskinkomponenter og leverer en bred vifte af effektorer. Formentlig, denne udvidelse i antallet af komponenter har gjort det muligt for Dot / Icm apparat til at rumme og integrere nye effektorer let8,9.
Vi har for nylig brugt kryoelektron tomografi (kryo-ET) til at løse strukturen af Dot / Icm apparat in situ og viste, at det danner en celle kuvert-spænder kanal, der forbinder til en cytoplasmatisk kompleks. Yderligere analyse viste, at den cytosolic ATPase DotB forbinder med Dot / Icm systemet på L. pneumophila cellepol gennem interaktioner med den cytosolic ATPase DotO. Vi har opdaget, at DotB viser en cytosolic bevægelse i de fleste bakterieceller, hvilket indikerer, at denne ATPase er til stede i en dynamisk cytosolic befolkning, men også forbinder med polar Dot / Icm komplekser. Desuden danner DotO en hexameric samling af DotO dimers forbundet med den indre membran kompleks, og en DotB hexamer slutter sig til bunden af denne cytoplasmatiske kompleks. Samlingen af DotB-DotO-energikomplekset skaber en cytoplasmatisk kanal , der leder omplantningen af substrater gennem T4SS (Figur 1)10.
På trods af disse nylige fremskridt vides der ikke meget om, hvordan Dot/Icm-systemet fungerer, og hvordan hvert protein samles for at danne et aktivt apparat8. Afdækning af de lovgivningsmæssige kredsløb i Dot/Icm T4SS er afgørende for at forstå de molekylære mekanismer i værtspatogeninteraktioner. Derfor diskuterer vi, hvordan man bruger levende celle mikroskopi og kryo-ET til at opdage og karakterisere væsentlige L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter, der er mærket med super-mappe GFP (sfGFP). Ved hjælp af kvantitativ fluorescensmikroskopi defineres den polære lokalisering af DotB i en vild typebaggrund, eller når type IV-systemet slettes. Time-lapse mikroskopi vil blive brugt til at kvantificere forskelle i lokalisering og dynamik mellem Dot / Icm cytosolic ATPases.
Den kombinerede anvendelse af to komplementære tilgange såsom levende billeddannelse og kryo-ET giver en fordel i forhold til andre in vitro-systemer. Begge metoder udføres i intakte celler og bevarer det naturlige miljø i T4BSS, hvilket minimerer afbrydelse af den oprindelige struktur under prøveforberedelse. Da overekspression af proteiner kan forringe sekretreapparatets stoichiometri, returneres sfGFP-fusionerne via allelicudveksling til Legionella-kromosomet, så hver fusion kokodes i enkelt eksemplar, og udtrykket drives af den endogene promotor. Visualisering af kromosom-kodede fusioner gør det muligt at kvantificere det nøjagtige proteinniveau, der udtrykkes på et bestemt tidspunkt. Cryo-ET har også mange fordele ved at bestemme strukturen af sekresionsystemer. Den mest bemærkelsesværdige fordel er, at kryo-ET prøver består af frosne intakte celler, der bevarer indfødte komplekser i forbindelse med bakteriel celle arkitektur. Kryo-ET kan derfor være at foretrække frem for biokemiske rensningsmetoder, som udtrækker membrankomplekser og kan fjerne perifere proteiner fra kerneapparatet eller ændre den overordnede struktur. Hertil kommer, mærkning et protein af interesse med en voluminøs protein såsom sfGFP tilføjer en masse, der kan påvises ved cryo-ET og kan hjælpe med kortlægning af de forskellige subkomplekser af Dot / Icm apparat på strukturen opnået ved cryo-ET.
Denne tilgang er et kraftfuldt værktøj til at afdække strukturelle oplysninger om multimolekylære komplekser, der samles i bakteriecellemembranen. Fortolkningen af strukturer belyst ved hjælp af disse teknikker vil hjælpe området med at forstå, hvordan T4BSS-komponenter fungerer, hvorfor der kræves så mange komponenter til funktion, hvordan komponenterne interagerer inden for de større komplekse, og hvilke funktioner disse underenheder udføre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer, der omfatter vækst, manipulation og billeddannelse af L. pneumophila, bør udføres i et biologisk sikkerhedsniveau 2-laboratorium i overensstemmelse med lokale retningslinjer.
1. Indsættelse af sfGFP i L. pneumophila kromosom ved hjælp af allelic Exchange og dobbelt udvælgelsestrategi (Figur 2, Figur 3)
- Klon ind i genudskiftningsvektoren pSR47S11 følgende sekvens: 1.000 bp opstrøms for det pågældende sted, derefter sfGFP-sekvensen, derefter 1.000 bp nedstrøms for det pågældende sted (Figur 2). SfGFP-sekvensen skal placeres i rammen til N-endetidens ender med en linker, der indeholder fire til otte aminosyrer. Omform den resulterende vektor til E. coli DH5αλpir. Senere, stribe L. pneumophila (modtageren) for enkelte kolonier på trækul-gær ekstrakt (CYE) agar12 indeholder 100 μg/ml streptomycin og vokser i 5 dage ved 37 °C (Figur 3).
- Stribe L. pneumophila på CYE-agar-streptomycin og voksi 2 dage ved 37 °C (kraftigt plaster)10. Stribe E. coli DH5α omdannet med pRK600 hjælper plasmid (hjælper)13 på LB agar indeholdende 25 μg/ml chloramphenicol. Sdr. E. coli DH5αλpir (donor) på LB agar indeholdende 50 μg/ml kanamycin.
- Udfør triparental parring: inkubere en koloni af hjælperen, en koloni af donoren, og modtageren ved at overlejre pletter af de tre stammer på en CYE agar plade uden udvælgelse og inkubere i 4-8 timer ved 37 °C. Som negative kontroller inkubere en hjælper + modtager stamme mix og en donor + modtager stamme mix for de samme perioder.
- Resuspender parringsreaktionerne i 500 μL af ddH2O. Plade 20 μL og 50 μL af reaktionerne på CYE agar indeholdende 100 μg/mL streptomycin og 10 μg/ml kanamycin og voks i 5 dage ved 37 °C. Stribe fire af de resulterende kloner på CYE agar indeholdende 100 μg/ml streptomycin og voks i 5 dage ved 37 °C.
- Stribe 16 kloner på CYE agar indeholdende 5% saccharose og 100 μg/ml streptomycin og vokser i 5 dage ved 37 °C. Derefter stribe 32 af disse kloner på CYE agar indeholdende 100 μg/ml streptomycin og på CYE agar indeholdende 100 μg/mL streptomycin og 10 μg/ml kanamycin og voksi 5 dage ved 37 °C.
2. Isolering af kloner, der integrerede sfGFP i L. pneumophila kromosom
- Streak kloner, der var følsomme over for kanamycin på CYE-agar-streptomycin plader og bekræfte indsættelsen af sfGFP i kromosomet med koloni PCR. Brug primere, der supplerer sfGFP-genet og kromosomregionen af interesse for at forstærke indføringskrydset.
- 0,5 μL af hver af de 10 μM primere opløsninger og en koloni til et endeligt rumfang på 12,5 μL og denatureret i 10 min ved 95 °C. Afkøles på is i 10 min, tilsæt 12,5 μL 2x PCR master mix løsning, og udfør en PCR-analyse.
- Der dyrkes tunge pletter af de isolerede kolonier på CYE-agar-streptomycinplader i 2 dage ved 37 °C. Undersøg sfGFP-fusionernes udtryksniveauer og stabilitet ved immunblotting med et anti-GFP antistof.
3. Live Cell Imaging af L. pneumophila med Fluorescently Tagged Dot / Icm Komponenter
- Forberedelse af agarose puder
- Lav ca. 30 ml af en 1% lavsmeltende agaroseopløsning i vand. Mikrobølgeovn i en glaskolbe i ca. 90 s, hvirvlende lejlighedsvis, indtil agarose er helt opløst.
- Placer to 22 x 22 x 0,15 mm3 glasglaspå kanten af en 25 x 75 x 1,1 mm3 glasrutsjebane, den ene oven på den anden. Stak to mere 22 x 22 x 0,15 mm3 glasglaspå den anden kant.
- Pipette omkring 1 ml af den smeltede agarose i midten dias mellem de to øverste glas dias, derefter placere en anden 25 x 75 x 1,1 mm3 dias på toppen af smeltet agarose. Prøv at undgå dannelsen af luftbobler. Objektglassene afkøles ved 4 °C i 15 min.
- Brug en skalpel eller barberblad, forsigtigt skære puden i små firkanter, ~ 5 x 5 mm2. Fastgør en dobbeltklæbende klæbemiddel 17 x 28 x 0,25 mm3 ramme på en 25 x 75 x 1,1 mm3 glasrutsjebane og placer flere puder på slæden.
- Erhvervelse af billede
BEMÆRK: Følgende trin er beskrevet for et mikroskop, der er under kontrol af SlideBook 6.0 og udstyret med solid state illuminators, CCD monokrom kamera, og en 100x objektiv (1,4 numerisk blænde). Hvis det er nødvendigt, kan du bruge alternative mikroskopienheder med passende hardware- og softwarekonfigurationer, der kan tilpasses i henhold til protokolindstillingerne.- Et kraftigt plaster på L. pneumophila opløses i 1 ml ddH2O, vortex og pipet 2-3 μL af fortyndingen på puderne. Placer en 50 x 24 x 0,15 mm3 dæksel forsigtigt over den klæbende ramme.
- I hentningsvinduet skal du justere ND til 180. Binning enes til 2×2, og brug 488 nm-kanalen til at eksponere prøven mellem 500-1.000 ms. Kontroller fluorescenssignalets specificitet ved at billeddannelse umærket L. pneumophila med de samme parametre (Figur 4).
4. Kvantificering af polarlokalisering og dynamikken i dot/icm-komponenter
BEMÆRK: Følgende trin er beregnet til billeder med 0,129 μm pr. pixel, der er anskaffet med 2 x 2 binning.
- Kvantificering af polaritet for sfGFP fusionsproteiner (Figur 5)
- Juster billedkontrasten, så bakterierne er tydeligt synlige. Brug områdeværktøjet til at placere et 0,25 x 1,3 μm2 rektangel, der starter ved stangen og strækker sig ind i cytoplasmaet. Rektanglet skal holde sig præcist inden for bakteriegrænserne.
- Marker mindst 200 bakterier, og brug knappen Region til maske til at oprette masker til de interesseområder. Vælg Objektunder Maskestatistik og Maskeomfang. Marker derefter middelintensitet og afvigelseunder Funktioner og intensitet.
- Dataene eksporteres, og polaritetsscorerne for hver bakterie beregnes som forholdet mellem variansen og middelintensiteten.
- Til applikationer med høj gennemløb skal du bruge en fasemålsætning og en passende kondensatoropsætning til at anskaffe billeder med fase- og 488 nm-kanaler. Sørg for at vælge synsfelter, hvor bakterierne er helt adskilt.
- Juster fasekanalens kontrast til billedet til et niveau, hvor bakterierne er tydeligt synlige. Åbn dual channel-afbildningen, start vinduet Opret segmentmaske, og skift kanal til fase.
- Juster en passende tærskel, og fjern små objekter med knappen Definer objekter. Vælg Fjern kanter objekter og senere separate bakteriemasker, der støder op til hinanden, under Forfine maske.
- Signalets polaritetsscorer beregnes i 488-kanalen for hver celle, som det tidligere er beskrevet i trin 4.1.2-4.1.3.
- Kvantificering af dynamikken for sfGFP-fusionsproteiner (Figur 6)
BEMÆRK: Følg vejledningen i afsnit 3 for at forberede en prøve til billedanskaffelse. Dynamik defineres som ændringer i intensitet over tid, og følgende trin er designet til korte billedbehandlingsperioder (dvs. flere minutter). Tilføj til puden de relevante kosttilskud, hvis længere billeddannelse perioder ønskes.- I vinduet Billedhentning skal du markere Timelapse, angive tidsintervallerne i intervalboksen og skrive 2 i feltet Antal tidspunkter. Erhverve to på hinanden følgende billeder af L. pneumophila udtrykke fluorescerende protein af interesse.
- Juster billedkontrasten, indtil cellerne er tydeligt synlige. Følg figur 6A og beskrivelserne nedenfor for at placere tre forskellige masker. Brug områdeværktøjet til at placere en 0,25 x 0,25 μm firkant i midten af mindst 400 celler.
- Brug knappen Område til maske til at oprette en maske (maske 1) af de interessante firkanter. Opret en ny tom maske (maske 2), og brug pixelværktøjet eller polygoneværktøjet til at markere hele celleområdet med mindst 25 tilfældige celler, som skal bruges til at beregne fluorescensblegning. Opret en ny tom maske (maske 3), og brug det store penselværktøj til at markere områder mellem cellerne, som skal bruges til undertræk i baggrunden.
- Vælg Objekt til maske 1 og maske 2 under Maskestatistik og Maskeomfang. Vælg Mean Intensity under Funktioner og intensitet, og eksportér derefter dataene for de to masker. Ved maske 3 eksporteres middelintensiteten for hele masken.
- Der beregnes ændringen i fluorescensintensiteten for hvert objekt i maske 1 ved hjælp af følgende formler:
hvor maske 1 er en 0,25 μm × 0,25 μm kvadratplads placeret i cellecentret, maske 2 dækker hele cellen, maske 3 er baggrunden mellem cellerne, t1 er den gennemsnitlige intensitet i første gangspunkt, og t2 er den gennemsnitlige intensitet i andet tidspunkt.
5. Påvisning af sfGFP Massetæthed med Cryo-ET
- Forberedelse af prøver, dataindsamling og genopbygning
- Der dyrkes et kraftigt plaster på L. pneumophila, der udtrykker et fluorescerende mærket Dot/Icm-protein på CYE-agar-streptomycinplader i 48 timer ved 37 °C. Resuspender cellerne i ddH2O til OD600 ~0,7. Der tilsættes 5 μL kolloidguldpartikler (BSA Tracer, 10 nm) til 20 μL af cellesuspensionen.
- 5 μL af celleblandingen på eteretiet med frisk glødeudladet hulkulstof (R 2/1 på Cu 200-net) og lad stå i 1 min. Blot med filterpapir og fryse i flydende ethan ved hjælp af et tyngdekraftdrevet stempelapparat som beskrevet tidligere14,15.
- Image de frosne hydrerede prøver med en 300 kV transmission elektron mikroskop udstyret med et felt emission pistol, en energi filter, Volta fase plade, og en direkte detektionsanordning. Indsaml enkeltakset hældningsserie ved 26.000 x og 42.000 x forstørrelser, hvilket resulterer i pixelstørrelser på prøveniveau på henholdsvis 5,4 Å/pixel eller 3,4 Å/pixel.
- Brug den tomografiske pakke SerialEM til at indsamle billedstakke ved ~0 μm defokusering med en række hældningsvinkler mellem -60° og +60° med 3° trinstilvækst og akkumulerende dosis på ~60 e-/Å2,16. Juster dosisfraktioneret filmbilleder i hver stak ved hjælp af MotionCor217. Saml drivkorrigerede stakke ved hjælp af TOMOAUTO14.
- Juster drivkorrigerede stakke efter den IMOD-markørafhængige justering18. Rekonstruere tomograms med SIRT-metode19 til segmenteringer og direkte billedanalyse og WBP-metode20.
- Subtomogram analyse af sfGFP fusions prøver
- Brug tomografiske pakke I3 (0.9.9.3) til subtomogramanalyse14,21,22.
BEMÆRK: Justeringen fortsætter iterativt, idet hver gentagelse består af tre dele, hvor der genereres referencer og klassificeringsmasker, subtomograms justeres og klassificeres, og klassegennemsnit er justeret til hinanden. - Brug 4 x 4 x 4 binned subtomograms for en indledende justering. Flet partikler, der tilhører klassegennemsnit, og vis elektrontæthed svarende til sfGFP. Efter sortering af partikler med sfGFP fusioner, bruge 2 x 2 x 2 binned subtomograms for en fokuseret tilpasning af en region af interesse (ligesom Dot / Icm cytoplasmatiske ATPase kompleks) for at opnå en høj opløsning struktur.
- Brug tomografiske pakke I3 (0.9.9.3) til subtomogramanalyse14,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Homolog rekombination med dobbelt valg i to trin blev brugt til at konstruere den definerede indsættelse af sfGFP. I det første skridt, triparental parring blev udført, hvor pRK600 konjugativ plasmid (en IncP plasmid) fra E. coli hjælper stamme MT616 blev mobiliseret til donor E. coli stamme med selvmord vektor pSR47S indeholder sfGFP genflankeret af de to homologe regioner, oprindelsen af overførsel oriT og Bacillus subtilevalg modudvælgelse gensacB. Dernæst blev konjugeringssystemet fra pRK600 tilstøttet mobilisering af pSR47S-derivatet til L. pneumophila (Lp01, figur 2A). Kloner, der med succes integreret pSR47S ved en enkelt crossover begivenhed blev valgt på grund af antibiotikaresistens genet KanR og blev formeret for at tillade en anden crossover. Kloner, der mistede sacB-genet under den anden crossover, blev udvalgt ved at omflå cellerne på det kontraselektive agensaccharose (figur 2, figur 3). Immunoblot-analyse med et anti-GFP antistof (α-GFP) blev udført for at afgøre, om sfGFP'en var kløvet, og for at vurdere fusionsproteinets stabilitet og udtryksniveau i en vild type eller i en komplet dot/icm-sletningsmutant. Før der blev foretaget mikroskopi, blev den korrekte integration af sfGFP-genet i kromosomet desuden bekræftet af PCR (figur 3). Når stabilitet og integration af fusioner blev bekræftet, levende celle fluorescerende mikroskopi blev udført, og specificitet en fluorescerende signal klon blev sammenlignet med en forældrenes sfGFP-negativ stamme. Desuden blev dobbelt billeddannelse ved hjælp af lyse felt eller fasemikroskopi brugt til at undersøge andelen af celler, der besad et specifikt fluorescerende signal (figur 4).
Kun en brøkdel af de celler, der producerede DotB-sfGFP, viste polar lokalisering af fusionsproteinet (Figur 5A). For at karakterisere fordelingen af DotB fluorescenssignal blev intensiteten af DotB-sfGFP langs længdeaksen i disse celler kvantificeret. DotB-intensiteten ved polerne var ca. 2 x højere end i cytosolen (figur 5B). Da det er vigtigt at afgøre, om lokaliseringen af fluorescerende mærkede fusionsproteiner har biologisk relevans, spurgte vi, om DotB-sfGFP polarlokalisering var afhængig af en fuldt samlet T4BSS. Derfor blev polaritetsscorerne for DotB-sfGFP, der angiver forholdet mellem gennemsnitlig fluorescens målt ved polerne sammenlignet med fluorescens målt nær midten af cellen, bestemt for individuelle celler i en vild type og i en T4BSS-mutant (Figur 5C–E). Faktisk, sletninger af hele Dot / Icm system ophævet polar positionering af DotB-sfGFP, bekræfter, at polære puncta repræsenterer foreningen af DotB med T4SS og betydningen af Dot / Icm maskinen for ansættelse af denne ATPase. I de fleste L. pneumophila celler, DotB-sfGFP viste også cytosolic bevægelse, hvilket indikerer, at det er til stede i en dynamisk cytosolic befolkning, men er også i stand til at associere med den polære Dot / Icm kompleks. For at kvantificere forskelle i dynamisk bevægelse mellem DotO- og DotB ATPases blev der anskaffet to på hinanden følgende billeder, og ændringer i fluorescensintensiteten blev bestemt og sammenlignet med sfGFP (figur 6A). Mens sfGFP og DotO-sfGFP viste lidt eller ingen dynamiske mønstre, dotB-sfGFP intensitet ændringer i cytosol blev flyttet og var betydeligt højere. Disse observationer tyder på, at DotB ATPase var til stede i en dynamisk cytosolic population, og ved en sen samlingsreaktion blev den rumligt dynamiske DotB ATPase rekrutteret til den polarlokaliserede Dot/Icm T4SS (Figur 6B).
For at definere dotB-maskinens rumlige placering i forhold til Dot/Icm-maskinen blev kryo-ET med høj gennemløb brugt til at visualisere det intakte T4BSS-apparat i en L. pneumophila-stamme, der udtrykker DotB-sfGFP. For det første blev rekonstruktionen af en L. pneumophila celle, der udtrykker DotB-sfGFP, udført og afslørede typiske flerkogt-formede komplekser indlejret i cellekuverten (Figur 7A, B). Vi demonstrerede tidligere ved hjælp af epistatiske eksperimenter med en række Dot/Icm mutanter, fluorescerende mikroskopi og kryo-ET, at DotB er rumligt placeret under en unik samling af ATPase DotO10. Subtomogram i gennemsnit af stammen udtrykker DotB-sfGFP bestemmes den samlede positionering af DotB i forhold til den intakte T4BSS maskine. Denne analyse afslørede en ekstra tæthed, der svarer til den ekstra masse af sfGFP (figur 7C). Endelig indikerer tredimensionale overfladegengivelser af hele Dot/Icm T4SS, at sfGFP er placeret under DotB hexamer, der samles som en skive i bunden af det cytoplasmatiske ATPase-kompleks (Figur 8)10.
Figur 1: Tredimensionale overfladegengivelser af L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM = ydre membran, IM = indre membran, PG = peptidoglycan. Billedet blev ændret fra Chetrit D. et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk oversigt over homolog rekombination og allelic udveksling bruges til at indsætte sfGFP i L. pneumophila kromosom. (A) Triparental parring udført mellem en E. coli MT616 hjælper stamme, der huser den konjugative plasmid pRK600 (en IncP plasmid), en donor E. coli stamme, der er omdannet med selvmord vektor pSR47S, og L. pneumophila som modtager. (B) Skematiske model, der viser de trin, der kræves for at indsætte sfGFP i L. pneumophila kromosom for at generere C-terminal sfGFP fusionproteiner. Udvælgelse af allelic udveksling mutanter blev udført i to trin, ved hjælp af kanamycin og tælleren valgbar markør sacB. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den allelic udveksling assay workflow. L. pneumophila blev stribet på de relevante valg og væksttider (se protokolafsnittet for detaljer). Senere blev indsættelsen af sfGFP i kromosomet bekræftet med koloni-PCR ved hjælp af primere, der supplerer sfGFP-genet og kromosomområdet, der flankerer indsætningsstedet. Fusionsproteinets stabilitet blev undersøgt ved immunoblotanalyse ved hjælp af et anti-GFP-antistof. Nederste venstre paneler: Lane 1 = umærket Lp01, Lane2 = sfGFP udtrykt fra dotB operon, Lane 3 = DotB-sfGFP udtrykt i en komplet dot/icm sletning mutant, Lane 4 = DotB-sfGFP udtrykt i en vild type baggrund. WB = vestlige blot. Antallet af kloner, der analyseres i hvert trin, er angivet i parenteser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Levende cellebilleddannelse af L. pneumophila, der udtrykker fluorescerende mærkede Dot/Icm-underenheder. (A) L. pneumophila fra en to dages tung patch blev opslæmmet i ddH2O og placeret oven på 1% lav smeltende agarose puder. (B) Specificiteten af fluorescenssignalet for en stamme, der kromosomalt koder DotB-sfGFP blev sammenlignet med den forældre-GFP-negative Lp01-stamme. Skalabjælke = 3 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kvantificering af polarlokalisering af delenheder af Dot/Icm-systemet. (A) Real-time visualisering af DotB-sfGFP udtrykt i Lp01 viste polar lokalisering. DotB-sfGFP viste et diffust mønster, når det udtrykkes i en stamme, hvor hele dot/icm-genklyngen blev slettet (▲T4SS). Usmeltet sfGFP udtrykt fra dotB operon viste et diffust cytosolic mønster og tjente som en kontrol. Skalabjælke = 3 μm. (B) Kvantificering af DotB-sfGFP fluorescensintensiteten langs cellernes længdeakse med polære eller diffuse mønstre. Prøvestørrelserne var n = 20 celler for polære og ikke-polære celler. *p = 0,02, **p ≤ 0,0001. Betydningen blev beregnet ved to-tailed Student's t-test og i forhold til intensiteten på stangen. C) Skemamodel af de masker, der anvendes til at kvantificere polaritet. (D) DotB-sfGFP som vist i figur 5A med de masker, der anvendes til at kvantificere polaritet. (E) Forekomsten af DotB-sfGFP ved polerne, når den udtrykkes i en vild typebaggrund, eller når hele dot/icm-genklyngen er slettet, vises som frekvenskurver. Prøvestørrelserne var n = 200 celler for hver stamme. * p < 0,0001. Betydningen blev beregnet ved to-tailed Mann Whitney test og sammenlignet med sfGFP udtrykt fra dotB operon. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantificering af dynamikken i dot/Icm-fluorescerende fusioner. (A) En skematisk model, der viser de masker, der anvendes til at kvantificere ændringerne i fluorescensintensiteten for et dynamisk eller statisk sfGFP-fusionsprotein. T1,2 er tidspunktet for første og anden gang punkter og m1,2,3 er maske 1, maske 2, og maske 3. (B) Dynamikken i DotB-sfGFP, DotO-sfGFP og sfGFP udtrykt fra dotB-operonen vises som frekvenskurver. Prøvestørrelserne var n = 400 celler for hver stamme. *p = 3,4 × 10-12, ***p = 1,0 × 10-147. Betydningen blev beregnet ved to-tailed Student's t-test i forhold til sfGFP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Subtomogram gennemsnit bruges til at bestemme sfGFP tæthed af DotB-sfGFP. (A) En tomografisk skive erhvervet med 26.000x forstørrelse fra en repræsentativ L. pneumophila celle, der udtrykker DotB-sfGFP, og som viser flere Dot/Icm-maskiner, der er indlejret i cellekuverten. (B) En tomografisk skive erhvervet med en 42.000x forstørrelse af samme L. pneumophila cellepol vist i A. OM = ydre membran, IM = indre membran. (C) En rekonstruktion fra en stamme, der udtrykker DotB-sfGFP, viser tætheder svarende til DotB og sfGFP (gule pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Tredimensionale overfladegengivelser af dot/Icm-cytosolkomplekset. Tredimensionale overfladegengivelser af hele Dot-Icm T4SS fra ▲dotB (A), vild type (B), og dotB-gfp (C) L. pneumophila stammer. (D) Strukturen af det cytosolic kompleks viser placeringen af DotB (lilla) og sfGFP (grøn). X-ray-strukturen i DotB (FBF: 6GEB23) blev forankret til DotB-kortet. IM = indre membran. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belysning af funktioner bakterielsekredionssystemer er nøglen til en fuldstændig forståelse af værts-patogen interaktioner. Sekretionssystemer er komplekse maskiner, der kan indsprøjte effektorer proteiner i værtsceller, og i nogle tilfælde fremme etableringen af en subcellulær niche, der understøtter bakteriel replikation. Ovenstående metode giver vigtige nye værktøjer til at studere Dot / Icm sekresion system af respiratoriske bakterielpatogenLegionella pneumophila, giver fingerpeg om mekanismerne i effektor translokation, der er afgørende for dens patogenicitet. Denne fremgangsmåde kan anvendes på andre sekresionssystemer ved at anvende levende bakteriecellebilleddannelse og strukturelle undersøgelser for at dissekere deres aktivitet på molekylært niveau. Dette kan opnås ved at studere spatiotemporal dynamik fluorescerende mærkede sekresion systemkomponenter ved hjælp af time-lapse video mikroskopi.
Vi konstruerede rene og umærkede mutationer, hvor et gen blev mærket eller erstattet af en modificeret allel, hvilket er en grundlæggende tilgang til forståelse af patogenicitet på molekylært niveau samt for definitionen af strukturfunktionsforhold, der kan føre til produktion af lægemiddelbehandlinger24,25. Stammer af L. pneumophila, der er blevet genetisk modificeret til at fjerne individuelle Dot og Icm proteiner kan bruges til at bestemme strukturen af Dot / Icm systemet ved kryo-ET. Et vigtigt skridt i protokollen er at sammenligne funktionaliteten af N-endelitter og C-endelitter mærkede proteiner. Derfor bør stammer, der koder fusionerne, testes for replikation i eukaryote værtsceller, visualiseret ved mikroskopi for at afgøre, om mærket proteinlokalisering i bakteriecellen er afhængig af en fuldt samlet sekretionsmaskine og vurderes for stabilitet af proteiner udtrykt fra opstrøms- og nedstrømsgener.
Denne protokol udnytter levende celle mikroskopi eksperimenter, som er almindeligt anvendt til at studere komplekse biologiske processer såsom signal transduktion, selv-samling, aktiv handel, og gen regulering. Forståelse af dynamikken, baner, og interaktioner af enkelte partikler i celler repræsenterer en grundlæggende tilgang i cellebiologi26. Da det ikke altid er muligt at spore enkelte partikler på grund af hurtig molekylær bevægelse eller lavt signal-støj-forhold, kan en vurdering af ændringer i fluorescensintensiteten imidlertid tjene som en enkel metode til at kvantificere forskelle i dynamikmønstre. Da der desuden kun kræves to tidspunkter til analysen, garanterer denne metode kun en minimal eksponering af prøven for fluorescerende lys og forhindrer således en større blegning af sfGFP-fluorescensintensiteten. Da agarosepuderne ikke indeholder nogen kilde til næringsstoffer, er det vigtigt at bemærke, at levende billeddannelse skal udføres umiddelbart efter indtagelse af cellerne fra CYE agarpladerne. Hvis længere perioder med billeddannelse tid er påkrævet, derefter kosttilskud, der understøtter L. pneumophila overlevelse og vækst bør føjes til puder. Bestemmelse af polariteten af fluorescerende mærkede proteiner kan også ændres til applikationer med høj gennemløb. Hvis disse er nødvendige, bør der anvendes et fasemål og en passende kondensatoropsætning til at anskaffe dual channel-billeder (dvs. fase- og lysstofkanaler). Det er afgørende at vælge marker, hvor bakterierne er helt adskilt. Brug fasekanalen til at maskere hele celler og kvantificere forholdet mellem intensiteter som beskrevet ovenfor.
Kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) og kryo-ET tilbyder robust visualisering af nanopartikler. Disse teknikker indebærer billeddannelse af prøven i en frossen-hydreret tilstand, så visualisering af nanopartikler væsentlige som de findes i deres cellulære miljø27. Da opløsningen er begrænset af prøvens tykkelse, har strukturer opnået ved kryo-ET lavere opløsning end dem, der opnås ved kryo-EM. Ikke desto mindre, fordi der i hvert billede tomogram type IV machineries er til stede i flere kopier, øget opløsning kan opnås ved at øge stikprøvestørrelsen for subtomogram gennemsnit. En stor fordel ved kryo-ET er, at visualisering af komplekse forsamlinger i intakte bakterieceller bedre kan bevare deres struktur, som kan undergå drastiske ændringer ved udvinding fra deres naturlige miljø.
Afslutningsvis er studiet af dynamiske processer og lokalisering af molekyler blandt de første skridt i retning af at forstå de biologiske systemers funktion. Styrken og fokus for den metode, der er beskrevet her, er den direkte visualisering af Dot / Icm komponenter i levende bakterier, som giver mulighed for at afdække dynamiske processer, der styrer funktionerne i type IVB maskiner eller andre multiprotein forsamlinger. Desuden er kobling levende billeddannelse til cryo-ET en strategi, der tillader karakterisering af nøglekomponenter i Dot / Icm maskinen i forhold til den større struktur af Legionella pneumophila sekredion system, og forståelse af, hvordan de samler og direkte konformationelle ændringer i apparatet. En begrænsning af fluorescerende protein tags anvendes til at studere protein adfærd i levende celler er deres relativt store størrelse, som kan påvirke funktionen og egenskaberne af det mærkede protein. Efterfølgende er det nødvendigt at vurdere stabilitet og funktionalitet. En anden begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at atomstrukturer i øjeblikket ikke kan opnås på grund af den begrænsede opløsning, der følger af prøvens tykkelse. Modellering og tilpasning kan være en effektiv måde at analysere tæthederne på, hvilket gør det muligt at lokalisere underenheder eller evaluering af kropsændringer. Fremtidige undersøgelser og yderligere perfektionisering af denne tilgang vil føre til en bedre forståelse af, hvordan forskellige underenheder omfatter et funktionelt type IV-apparat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
D.C. og C.R.R. blev støttet af NIH (R37AI041699 og R21AI130671). D.P., B.H., og J.L blev støttet af National Institutes of Health (R01AI087946 og R01GM107629).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M.
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J.
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
