Summary
Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.
Abstract
RNA en RNA-bindende eiwitten (RBPs) beheersen meerdere biologische processen. De ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs ligt ten grondslag aan de delicate regulering van deze processen. Een strategie genaamd CLIP-seq (cross-linking en immunoprecipitatie) is ontwikkeld om endogene eiwit-RNA interacties met UV cross-linking, gevolgd door immunoprecipitatie vast te leggen. Ondanks het brede gebruik van conventionele CLIP-seq-methode in RBP-studie, wordt de CLIP-methode beperkt door de beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen, potentiële verontreinigingen van de copurified RBPs, de vereiste van isotopenmanipulatie en mogelijk verlies van informatie tijdens een vervelende experimentele procedure. Hier beschrijven we een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq met behulp van de FLAG-biotine tag tandem zuivering. Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interactierna-bindende eiwitten verwijderd. Zo worden de RNAs die indirect door deze copurified RBPs worden bemiddeld, ook verminderd. Onze FbioCLIP-seq methode maakt efficiënte detectie van directe eiwitgebonden RNAs zonder SDS-PAGE en membraan overdracht procedures in een isotoop-vrije en eiwit-specifieke antilichaam-vrije manier.
Introduction
RNAs en RNA-bindende eiwitten (RBPs) controleren diverse cellulaire processen, waaronder splicing, vertaling, ribosoom biogenese, epigenetische regulatie en cellotovergang1,2,3,4,5,6. De delicate mechanismen van deze processen zijn afhankelijk van de unieke ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs. Daarom is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van RNA-regulatie op moleculair niveau het onthullen van de positionele informatie over de bindende sites van RBPs.
Een strategie aangeduid als cross-linking en immunoprecipitatie (CLIP-seq) is ontwikkeld om eiwit-RNA interacties met UV-kruisverband, gevolgd door immunoprecipitatie van het eiwit van belang7vast te leggen. Het belangrijkste kenmerk van de methodologie is de inductie van covalente kruisverbanden tussen een RNA-bindend eiwit en de direct gebonden RNA-moleculen (binnen ~1 Å) door UV-bestraling8. De RBP-voetafdrukken kunnen worden bepaald door cliptagclustering en piekbeling, die meestal een resolutie van 30−60 nt hebben. Als alternatief kan de omgekeerde transcriptiestap van CLIP leiden tot indels (invoegingen of verwijderingen) of vervangingen naar de kruisverkoppelingssites, waardoor eiwitbindende sites op de RNAs kunnen worden geïdentificeerd met een resolutie met één nucleotide. Pijpleidingen zoals Novoalign en CIMS zijn ontwikkeld voor de analyse van de high-throughput sequencing resultaten van CLIP-seq8. Er zijn ook verschillende gewijzigde CLIP-seq-methoden voorgesteld, waaronder cross-linking en immunoprecipitatie (iCLIP), verbeterde CLIP (eCLIP), irCLIP en foto-activiteiten van ribonucleoside-enhanced cross-linking en immunoprecipitatie (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Ondanks het brede gebruik van traditionele CLIP-seq methoden in de studie van RBPs, de CLIP methoden hebben verschillende nadelen. Ten eerste kan de vervelende gedenatureerde gel elektroforese en membraan overdracht procedure leiden tot verlies van informatie, en leiden tot beperkte volgorde complexiteit. Ten tweede kan de op eiwitten gebaseerde CLIP-methode een eiwitcomplex in plaats van één enkel doeleiwit naar beneden trekken, wat kan leiden tot vals-positieve eiwit-RNA-interacties van de copurified RBPs. Ten derde vereist de op antilichamen gebaseerde strategie een grote hoeveelheid hoogwaardige antilichamen, waardoor de toepassing van deze methoden ontoereikend is voor de studie van RBPs zonder beschikbare antilichamen van hoge kwaliteit. Ten vierde vereist de traditionele CLIP-methode radiogelabelde ATP om de eiwitgebonden RNAs te labelen.
De hoge affiniteit van streptavidin aan biotinylated eiwitten maakt het een zeer krachtige benadering om specifieke eiwitten of eiwitcomplexen te zuiveren. De efficiënte biotinylatie van eiwitten die een kunstmatige peptide sequentie door ectopisch uitgedrukt bacteriële BirA biotine ligase in zoogdiercellen maakt het een efficiënte strategie om biotine zuivering uit te voeren in vivo13. We ontwikkelden een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq(FLAG-Biotin-gemedieerde Cross-linkt en ikmmunoprecipitatie gevolgd door high-throughput sequencing) met behulp van FLAG-biotine tag tandem zuivering14 (Figuur 1). Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interagerende RBP's verwijderd(figuur 2). De strenge wasomstandigheden maken het ook mogelijk om de SDS-PAGE en membraanoverdracht te omzeilen, wat arbeidsintensief en technisch uitdagend is. En vergelijkbaar met eCLIP en irCLIP, is de FbioCLIP-seq methode isotoopvrij. Het overslaan van de gel lopen en overdracht stappen vermijdt het verlies van informatie, houdt authentieke eiwit-RNA interacties intact, en verhoogt de complexiteit van de bibliotheek. Bovendien maakt de hoge efficiëntie van het tagging-systeem het een goede keuze voor RBPs zonder hoogwaardige antilichamen beschikbaar.
Hier geven we een stapsgewijze beschrijving van het FbioCLIP-seq protocol voor zoogdiercellen. Kortom, cellen zijn cross-linked door 254 nm UV, gevolgd door cellyse en FLAG immunoprecipitatie (FLAG-IP). Vervolgens worden de eiwit-RNA complexen verder gezuiverd door biotine affiniteit vastleggen en RNAs zijn gefragmenteerd door gedeeltelijke spijsvertering met MNase. Vervolgens wordt het eiwitgebonden RNA gedephosphorylated en met een 3' linker gebonden. Een 5' RNA linker wordt toegevoegd nadat het RNA is fosforylated met PNK en geëuterd door proteinase K spijsvertering. Na omgekeerde transcriptie worden de eiwitgebonden RNA-signalen versterkt door PCR en gezuiverd door agarose gelzuivering. Twee RBPs werden gekozen om de FbioCLIP-seq resultaat te illustreren. LIN28 is een goed gekarakteriseerd RNA-bindend eiwit dat betrokken is bij microRNA-rijping, eiwitvertaling en celherprogrammering15,16,17. WDR43 is een WD40 domein-bevattende eiwit dacht te coördineren ribosoom biogenese, eukaryotische transcriptie, en embryonale stamcel pluripotentie controle14,18. In overeenstemming met eerder gerapporteerde resultaten voor LIN28 met CLIP-seq, FbioCLIP-seq onthult bindende sites van LIN28 op "GGAG" motieven in de microRNA mir-let7g en mRNAs16,19 (Figuur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identificeerde ook de bindende voorkeur van WDR43 met 5' externe transcribed spacers (5'-ETS) van pre-rRNAs20 (Figuur 4). Deze resultaten valideren de betrouwbaarheid van de FbioCLIP-seq methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellijnconstructie
- Kloon het gen van belang in een PiggyBac vector pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA van belang]-(Hygromycin-resistente) plasmide die een VLAG-biotine epitoop13draagt ,21 om een VLAG-biotine tag gesmolten RBP(FBRBP) uit te drukken.
- Cotransfecteer de FBRBP expressing vector met de pBase vector in een cellijn die het BirA enzym22uitdrukt.
OPMERKING: In deze studie werd het FBRBP-gen omgezet in embryonale stamcellen (mESCs) met een geïntegreerde BirA-expressievector21. Als alternatief kan de FBRBP expressing vector samen worden omgezet in cellen met pBase en pPiggyBac-BirA-V5. - Kweek de cellen in mESC op gelatineiseerde gerechten en onderhoud in mES cultuurmedium (Tabel van materialen) in 5% CO2 bij 37 °C. Selecteer de transfected cellen met hygromycine b (100 μg/mL) gedurende 1 week.
- Na de selectie van geneesmiddelen, oogst cellen door SDS laadbuffer (Tabel 1) en gebruik een westerse vlek23 om de tagging en expressie van het gen te bevestigen met respectievelijk een FLAG-antilichaam en streptavidin-HRP.
2. Cross-linking
- Plaat ~3 x 106 mES cellen in een 10 cm plaat 1 dag voor het experiment, zodat de cellen zullen groeien tot 70−90% samenvloeiing wanneer geoogst (~ 5−10 miljoen cellen per monster).
- Verwijder het medium met een vacuüm. Behandel de cellen met 2 mL van 0,25% trypsin-EDTA gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) en blus de trypsine met 4 mL vers mESC-medium. Breng de cellen over op een centrifugebuis van 15 mL. Draai de cellen naar beneden door centrifugeren op 300 x g gedurende 3 min bij 4 °C en verwijder de supernatant.
- Hang de cellen met 4 mL koude PBS en plaat de cellen terug naar de 10 cm plaat voor cross-linking. Kruisverbond de cellen door straling met 254 nm UV-licht (stel de UV-dwars-linker in met een parameter van 400 mJ/cm2).
OPMERKING: Voor celmonolagen kunnen de cellen direct op de plaat worden gekoppeld met UV-licht voordat ze worden behandeld. - Breng de gekoppelde cellen over naar een buis van 15 mL. Spin naar beneden door centrifugatie op 300 x g gedurende 3 min bij 4 °C en verwijder de supernatant.
LET OP: De gekoppelde celpellet kan tot gebruik bij -80 °C worden opgeslagen.
3. Cellysaatvoorbereiding
- Lyse de cellen met 500 μL wasbuffer A (Tabel 1) vers aangevuld met 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteaseremmer cocktail, en 400 U /mL RNase remmer. Breng de cellen over op een RNase-vrije 1,5 mL buis. Incubeer de cellen gedurende 30−60 min op een rotor met zachte rotatie bij 4 °C.
- Behandel het lysaat met 30 μL DNase I op 37 °C gedurende 10 minuten. Stop de reactie door 4 μL 0,5 M EDTA toe te voegen. Draai de onoplosbare pellet 20 minuten bij 4 °C met 12.000 x g naar beneden en breng de supernatant over op een nieuwe voorgekeerde 1,5 mL buis.
LET OP: Voor direct gebruik, houd op ijs. Als de supernatant niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaar het dan bij -80 °C tot gebruik.
4. VOORBEREIDING VAN VLAGkralen
- Voeg 40 μL drijfmest VLAG kralen per monster toe aan een verse buis van 1,5 mL.
- Was de kralen snel met 0,5 mL ijskoude wasbuffer A en draai 3.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C naar beneden.
- Herhaal stap 4.2 eenmaal. Draai de kralen naar beneden met 3.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C. Verwijder de buffer voorzichtig met een narrow-end pipetpunt. Vermijd het verwijderen van de kralen.
5.
- Breng het cellysaat over van stap 3.2 naar de vooraf geëquilibreerde FLAG-kralen. Draai alle monsters op een rolshaker voorzichtig op 4 °C. Incubeer de VLAG kralen met lysate voor 2−4 uur of 's nachts.
- Centrifuge de kralen gedurende 2 min op 3.000 x g en verwijder de supernatant.
- Was de kralen met 0,5 mL voorbestemde wasbuffer A door incubatie gedurende 5 minuten in een rotator bij 4 °C, draai de kralen met 3.000 x g gedurende 2 minuten naar beneden en verwijder de supernatant. Herhaal de was 1x.
- Herhaal de was 2x zoals beschreven in stap 5.3 met 0,5 mL voorgekeerde wasbuffer B (Tabel 1).
6. Elution met 3x FLAG peptide
- Bereid 3x FLAG elutieoplossing voor door 1 mg 3x FLAG peptide op te lossen met 5 mL wasbuffer A tot een uiteindelijke concentratie van 200 ng/mL.
- Draai de VLAG kralen van stap 5.4 met 3.000 x g gedurende 2 min. Verwijder de supernatant voorzichtig. Zorg ervoor dat het grootste deel van de supernatant wordt verwijderd met behulp van een smalle einde pipet tip.
- Voeg 200 μL 3x FLAG elution oplossing toe aan elk monster. Broed de monsters met zachte rotatie gedurende 30 minuten bij 4 °C. Draai de VLAG kralen voor 2 min op 3.000 x g. Breng de supernatants over op verse buizen.
- Herhaal de elutie 2x zoals beschreven in de stappen 6.2 en 6.3 en pool de eluents samen. Bespaar 5% van de eluents voor westerse vlekken analyse of zilver vlekken om de efficiëntie van FLAG-IP te controleren.
7. Streptavidin kralen voorbereiding
- Bereid 50 μL van een streptavidin kraal drijfmest voor elk monster. Verzamel de kralen met een magnetische standaard voor 30 s en verwijder de supernatant met een pipetpunt.
- Was de kralen snel met 0,5 mL ijskoude wasbuffer A en verzamel de kralen met een magnetische standaard van 30 s.
- Herhaal de was 1x. Verwijder de supernatant na de wasbeurt.
8. Biotine affiniteit zuivering
- Breng de gepoolde eluents van stap 6.4 naar de streptavidinkralen vanaf stap 7.3 en draai de monsters voorzichtig om bij 4 °C gedurende 1−3 uur of 's nachts.
- Verzamel de kralen met een magnetische standaard voor 30 s en verwijder de supernatant. Was de kralen 2x met 500 μL wasbuffer C (Tabel 1) door zachte rotatie bij RT gedurende 5 minuten.
- Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen 2x met 500 μL wasbuffer D (Tabel 1) door 5 minuten op RT te draaien.
- Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer (Tabel 1).
9. Gedeeltelijke RNA-spijsvertering
- Maak een 105-voudigeverdunning van MNase met MNase-reactiebuffer(tabel 1). Voeg aan elk monster 100 μL MNase-oplossing toe. Vortex de kralen op 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) voor 10 min, het verzamelen van de kralen met een magnetische standaard voor 30 s en verwijder de supernatant.
OPMERKING: De concentratie van MNase moet worden geoptimaliseerd voor verschillende RNA-bindende eiwitten. De MNase-concentratie die RNAs kan verteren in 30−50 nt-fragmenten (bepaald door de grootte van de insert van de uiteindelijke bibliotheek) is optimaal. - Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer (Tabel 1). Verzamel de kralen met een magnetische standaard en verwijder de supernatant tussen elke wasstap.
- Was de kralen 2x met 500 μL wasbuffer C door zachte rotatie gedurende 5 minuten bij RT. Was vervolgens snel de kralen 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer.
10. Dephosphorylation van RNA
- Maak een kalfsdarm fosfatase (CIP) reactiemix met 8 μL 10x CIP buffer (Tabel van materialen),3 μL CIP enzym, en 69 μL water. Het totale volume is 80 μL per reactie.
- Verzamel de kralen met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg de CIP-reactiemix toe aan de kralen. Vortex de kralen op 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) gedurende 10 min.
- Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer. Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer.
11.
- Maak een linkermix van 3' met 4 μL van 20 μM 3' linker, 4 μL 10x T4 RNA ligase buffer, 4 μL van 50% PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (afgekapt) en 26 μL water. Het totale volume is 40 μL per reactie.
- Verzamel de kralen van stap 10.3 met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg 40 μL van de 3' linker ligatie mix toe aan de kralen. Vortex de kralen op 16 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) voor 3 uur of 's nachts.
- Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer. Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer.
12. PNK-behandeling
- Maak een PNK-mix met 4 μL 10x PNK-buffer, 2 μL T4 PNK-enzym, 1 μL atp van 10 m en 33 μL water. Het totale volume is 40 μL per reactie.
- Verzamel de kralen met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg 40 μL PNK-mix toe aan de kralen. Vortex de kralen zachtjes op 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) gedurende 10 min.
- Was de kralen snel met een 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer.
- Was de kralen snel met een 500 μL ijskoude PNK-buffer. Bespaar 5% van de kralen voor westerse of zilveren vlekken analyse om de efficiëntie van immunoprecipitatie te bevestigen.
13. RNA-isolatie
- Verzamel de kralen van stap 12.4 met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg 200 μL eiwitase K digestiebuffer toe(tabel 1). Vortex de kralen voor 30 min bij 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop). Magnetisch isoleren van de kralen en neem de supernatant voor het experiment.
- Voeg vanaf stap 13.1 400 μL RNA isolatiereagens(Tabel van materialen)toe aan de supernatant, meng grondig en broed gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 80 μL chloroform toe en meng grondig en broed vervolgens 5 min op het ijs. Spin naar beneden met 12.000 x g gedurende 10 min 4 °C.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een chemische kap. - Neem de supernatant (~500 μL) en voeg twee volumes isopropanol:ethanolmix (1:1), 1/10 volume van 3 M natriumacetaat (pH = 5,5) en 1 μL glycogeen toe. Vries op -20 °C voor 2 uur. Centrifuge bij 4 °C met 12.000 x g gedurende 20 minuten.
- Was de pellet 2x met ijskoude 70% ethanol. Draai de pellet naar beneden bij 4 °C met 12.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en droog de pellet. Los de RNAs op in 5 μL RNase-vrij H2O.
14. 5' RNA linker ligation
- Maak een 5' RNA ligatiemix met 1 μL 10x T4 RNA ligasebuffer, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 μL van 10 mM ATP, 1 μL RNase-remmer en 0,5 μL T4L ligase. Het totale volume is 4 μL per reactie.
- Voeg vanaf stap 13.4 1 μL 20 μM RNA linker toe aan het RNA, denatureer het RNA door 2 min 2 min te verwarmen bij 70 °C en ontspan onmiddellijk op ijs.
- Voeg de 5' RNA ligatie mix toe aan het RNA vanaf stap 14.2. Incubeer bij 16 °C 's nachts.
15. Omgekeerde transcriptie
- Zuiver de RNAs zoals beschreven in sectie 13 en los het RNA op met 11,5 μL RNase-vrij water.
- Voeg 1 μL van 10 μM reverse transcriptie primer toe aan het gezuiverde RNA, verwarm 2 min op 70 °C en koel onmiddellijk op ijs.
- Maak een omgekeerde transcriptiemix met 4 μL 5x reverse transcriptiebuffer, 1 μL van 10 mM dPP's, 1 μL van 0,1 M DTT, 1 μL RNase-remmer en 0,5 μL omgekeerde transcriptase (Tabel van materialen). Het totale volume is 7,5 μL per reactie.
- Voeg 7,5 μL omgekeerde transcriptiemix toe aan het RNA, broed gedurende 30 minuten bij 50 °C en stop de reactie bij incubatie bij 70 °C gedurende 10 minuten. Vertrek bij 4 °C.
16. PCR-versterking
- Maak een PCR-versterkingsmix met 15 μL 2x PCR mastermix(Tabel van materialen),5 μL cDNA vanaf stap 15.4; 0,6 μL van 10 μM voorwaartse primer 1 (Tabel 2),0,6 μL van 10 μM reverse primer 1 (Tabel 2), en 8,8 μL van H2O. Het totale volume is 30 μL.
- Versterk de cDNA met de volgende instellingen: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (herhaal stappen 2−4 voor 15−20 cycli), 72 °C 2 min, en houd op 4 °C. Voer het PCR-product uit op een 2−3% agarose gel. Knip het DNA van ~100−150 bp uit, haal DNA eruit met gelextractiekit(Tabel van materialen)en ontwijk het DNA met 20 μL water.
- Neem 3 μL van het gezuiverde PCR-product, versterk met voorwaartse primer 2 (Tabel 2) en omgekeerde primer 2 (indexprimer; Tabel 2) zoals beschreven in stap 16.2 voor vijf cycli om indexsequenties in te voeren. Zuiver het PCR-product zoals beschreven in stap 16.2.
- Sequence de bibliotheek met een high-throughput sequencing platform.
17. Analyse van de bioinformatica
- Voer gegevensanalyse uit met behulp van commerciële programma's zoals eerder beschreven8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De schematische weergave van de FbioCLIP-seq procedure is weergegeven in figuur 1. Vergeleken met FLAG-gemedieerde of streptavidin-gemedieerde eenstapsaffiniteitszuivering, verwijderde FLAG-biotine tandemzuivering bijna alle copurified eiwitten, waardoor de verontreiniging van indirecte eiwit-RNA-interacties werd vermeden(figuur 2). Representatieve resultaten voor FbioCLIP-seq voor LIN28 en WDR43 zijn afgebeeld in figuur 3 en figuur 4. We hebben LIN28 of WDR43 FbioCLIP-seq met mSECs uitgevoerd. Figuur 3A toont het track view van LIN28 en WDR43 FbioCLIP-seq in pre-let-7g. De gerapporteerde GGAG motief in pre-let-7g en de cross-linked sites geïdentificeerd door FbioCLIP-seq worden weergegeven in figuur 3B. De classificatie van de mutatiesites die door het CIMS-algoritme worden genoemd, toonde aan dat LIN28 de voorkeur geeft aan het binden en kruisen naar G nucleotide (figuur 3C). De verrijkte RNA motieven in LIN28 FbioCLIP-seq binding sites zijn te zien in figuur 3D. Meer representatieve tracks van FbioCLIP-seq op LIN28 en HNRNPU worden weergegeven in figuur 3E. Vergelijking van WDR43 en LIN28 FbioCLIP-seq toonde hun verschillende bindende patronen in Rn45 pre-rRNA locus (Figuur 4). Figuur 5 toont de representatieve resultaten van FLAG en biotine tag validatie na cellijnconstructie. Figuur 6 toont representatieve resultaten van efficiënte (figuur 6A) of niet succesvol (figuur 6B) VLAG-IP en FLAG-biotine tandemzuivering.
Figuur 1: Schematische weergave van FbioCLIP. UV-cross-linked cellen (stap 1) worden in lysebuffer (stap 2) gelysed. Het FBRBP-RNA complex is immuunprecipiteerd met anti-FLAG hars (stap 3−4). Het eluted protein-RNA complex wordt verder gezuiverd met streptavidin kralen en strenge wasomstandigheden worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties te verwijderen (stappen 5−6). RNAs worden gedeeltelijk verteerd door MNase en niet-eiwitgebonden RNA-fragmenten worden verwijderd door verdere wasbeurt (stappen 7−8). De RNAs worden vervolgens gedephsphorylated en geligat met 3' linker (stap 9). Vervolgens worden de RNAs gefossyleerd en ontwierzaam door de behandeling met Proteinase K (stap 10). Gezuiverde RNAs zijn gebondeerd met een 5' RNA linker met een 6 nt random barcode (stap 11). Na reverse transcriptie (stap 12) wordt de cDNA-bibliotheek versterkt met PCR en wordt high-throughput sequencing uitgevoerd (stap 13−15). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: FLAG-biotine tandem zuivering verwijdert copurified eiwitten. Zilvervlekken van FBWDR43 toonden aan dat bijna alle interagerende eiwitten in FLAG- of biotine-gemedieerde eenstapszuivering werden geëlimineerd na een strikte wasbeurt in tandemzuivering. VLAG: VLAG-gemedieerde affiniteit zuivering, SA: streptavidin-gemedieerde biotine zuivering, tandem: FLAG-biotine tandem zuivering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van LIN28 FbioCLIP-seq. (A) Track view van LIN28 FbioCLIP-seq tags en mutatie leest genoemd door CIMS in pre-let-7g RNA. De getoonde tags zijn unieke reads van FbioCLIP-seq. In totaal ~ 7,7 miljoen unieke leest voor LIN28 FbioCLIP-seq en ~ 2,2 miljoen unieke leest voor WDR43 FbioCLIP-seq werden opgehaald na het verwijderen van overbodige leest. (B) Cross-linked sites op de GGAG motief van pre-let7-g RNA door LIN28 FbioCLIP-seq. De pijlen geven de cross-linked sites aan. (C) Percentage gemuteerde nucleotiden bij verschillende soorten mutaties. G is de meest voorkomende cross-linked en gemuteerde nucleotide. Willekeurig: willekeurige verdeling van de vier nucleotiden. (D) Voorspelde LIN28 bindende motieven door FbioCLIP-seq met HOMER algoritme. (E) Track views of LIN28 FbioCLIP-seq on LIN28 and HNRNPU mRNAs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van WDR43 en LIN28 FbioCLIP-seq op Rn45S locus. Track view van WDR43 en LIN28 FbioCLIP-seq op Rn45S locus. WDR43 en LIN28 vertoonden verschillende bindingspatronen op pre-rRNA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van flag- en biotinetagvalidatie. FLAG of biotine Western blot valideert het taggen van de cellijnen. Klonen #1, #2 en #4 toonde efficiënte expressie en biotinylation van de tag, terwijl #3 een slechte expressie van het gelabelde eiwit toonde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Representatieve resultaten van flag-immuunprecipitatie en validatie van de efficiëntie van de tandemzuivering. (A) Voorbeeld van efficiënte zuivering van gelabelde eiwitten door FLAG en biotine affiniteit zuivering. (B) Voorbeeld van inefficiënte zuivering van gelabeld eiwit door FLAG en biotine affiniteit zuivering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buffer | Samenstelling |
| SDS-laadbuffer | 50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 0.1% bromophenolblue, 10% glycerol, 100 mM DTT |
| Wasbuffer A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS |
| Wasbuffer B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS |
| Wasbuffer C | 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS |
| Wasbuffer D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M ureum |
| PNK-buffer | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase reactiebuffer | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA-buffer | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Proteinase K spijsverteringsbuffer | 50 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 20 μg proteinase K |
Tabel 1: Samenstelling van buffers die in deze studie worden gebruikt.
| Oligo naam | Volgorde | Notities | ||||
| 3' linker | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' RNA linker | GUUCAGAGUUUACAGUCCGACGUCNNNNN | |||||
| RT primer | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Voorwaartse primer 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Omgekeerde primer 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Voorwaartse primer 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Omgekeerde primer 2 | CAAGCAGAAGACGGACGAGAGATCGTGGGGGGAGTTCAGACGTGTGCTTCCGATC-s-T | De rode en onderstreepte reeksen vertegenwoordigen De indexopeenvolging van Illumina. | ||||
Tabel 2: Oligonucleotiden gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier introduceren we een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq, gebruik te maken van de FLAG-biotine dubbele tagging systeem om tandem zuivering van eiwit-RNA complexen uit te voeren. Het FLAG-biotine dubbele tagging systeem is aangetoond dat krachtig zijn in het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties13,21. Hier tonen we de hoge specificiteit en het gemak van dit systeem in het identificeren van de RNAs interactie met eiwitten. Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden sloegen we de uitdagende SDS-PAGE en membraanoverdrachtstap over, zodat er meer eiwit-RNA-interacties werden behouden en om vervuilde RNA-signalen te voorkomen die door RBPs in hetzelfde complex werden bemiddeld. Trouwens, bypass van deze stappen voorkomt etikettering van het RNA met radiolabeled ATP. Dit maakt de procedure veel gemakkelijker. Merk op dat tijdens de voorbereiding van onze publicatie, een soortgelijke methode genaamd uvCLAP is ook voorgesteld24.
Verschillende stappen zijn belangrijk voor het welslagen van het protocol. Ten eerste moet de efficiëntie van de biotinylation van het gelabelde eiwit vóór het experiment door de westerse vlek worden bevestigd (figuur 5). Ten tweede is de efficiënte elutie van gezuiverd eiwit met 3 x FLAG peptide vereist voor de succesvolle versterking van de RNA-signalen. De kralen van stap 12.4 moeten worden geanalyseerd met westerse vlekken of zilver vlekken om te garanderen dat een fatsoenlijke hoeveelheid doeleiwit wordt opgehaald (figuur 6). Om de efficiëntie te verhogen, ofwel verhogen van de 3 x FLAG peptide concentratie in stap 6 tot 500 ng / mL of herhaal de elutie stap meerdere malen om een betere productie te krijgen. Ten derde is het optimaal om de MNase-concentratie voor elk eiwit bij de eerste proef te titreren. Overdigestie of onvoldoende behandeling kan leiden tot RNA-fragmenten van ongepaste afmetingen. Ten slotte bevat het protocol twee rondes van affiniteitszuivering en zeer strenge wasbeurt. Slechts een kleine hoeveelheid gezuiverde RNAs wordt opgehaald. Het reagens moet RNase-vrij zijn en RNA-afbraak na de behandelingstap MNase voorkomen.
Ondanks het gemak van deze methode, zijn er nog enkele aspecten die kunnen worden verbeterd. Ligatie van een 5'-adapter aan het RNA kan bijvoorbeeld direct het herstel van de signalen beperken, omdat een aanzienlijk deel van de omgekeerde transcriptie wordt beëindigd door restoverschrijdende peptiden. Onze huidige studie is voornamelijk gebaseerd op ectopische expressie van gelabelde eiwitten, wat kan leiden tot sommige artefacten als gevolg van eiwitoverexpressie. Het is de moeite waard om de methode te verbeteren door de tag in de endogene locus te introduceren. Het CRISPR/Cas9 systeem maakt de opbouw van de cellijn veel eenvoudiger en te doen. Sommige studies hebben toegepast de eCLIP-seq experiment om muisweefsels25. Afleiding van knock-in muizen met de dubbele tag is ook een potentiële en veelbelovende richting in de verbetering en toepassing van de FbioCLIP-seq methode. Bovendien kan ectopisch uitgedrukte bacteriële BirA ligase leiden tot onverwachte biotinylation gebeurtenissen in vivo. Tagging van het eiwit kan ook van invloed zijn op de biologische functies.
Een groot aantal studies heeft aangetoond dat de genexpressie en het epigenoom van cellen heterogeen zijn in plaats van volledig homogeen, wat suggereert dat het waardevol is om het interactienetwerk op een eencellig niveau te bestuderen. Verschillende strategieën zijn ontwikkeld om het transcriptoom en epigenoom van enkele cellen te bestuderen. Er zijn echter geen strategieën gerapporteerd om de interactie tussen eiwit-RNA op een eencellig niveau te analyseren. Zonder de gedenatureerde gel lopen en membraan overdracht stappen, FbioCLIP-seq kan behouden meer signalen, waardoor het een potentiële strategie om eiwit-RNA interacties te bestuderen op een eencellige niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Subsidie steun is van de National Basic Research Program van China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), de National Natural Science Foundation van China (31630095), en het Center for Life Sciences aan de Tsinghua University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M.
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
