Summary
هنا نقدم تعديل بروتوكول CLIP-seq يسمى FbioCLIP-eq مع تنقية جنبا إلى جنب العلم biotin لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي من البروتينات RNA ملزمة (RBPs) في خلايا الثدييات.
Abstract
رنا والبروتينات RNA ملزمة (RBPs) السيطرة على العمليات البيولوجية المتعددة. 10- إن الترتيب المكاني والزماني للرنابات الوطنية والممارسات التجارية التقييدية يكمن في التنظيم الدقيق لهذه العمليات. وقد وُضعت استراتيجية تسمى CLIP-seq (الربط المتبادل والمناعة) لالتقاط تفاعلات البروتين والرنا الذاتية مع ربط الأشعة فوق البنفسجية المتداخلة متبوعة بالمناعة. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لأسلوب CLIP-seq التقليدي في دراسة RBP، فإن طريقة CLIP محدودة بسبب توافر أجسام مضادة عالية الجودة، والملوثات المحتملة من الممارسات التجارية التقييدية المشتركة، وشرط التلاعب بالنظائر، واحتمال فقدان المعلومات أثناء إجراء تجريبي شاق. هنا وصفنا تعديل طريقة CLIP-seq تسمى FbioCLIP-seq باستخدام تنقية العلامة FLAG-biotin جنبا إلى جنب. من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تتم إزالة تقريبا جميع البروتينات تفاعل RNA ملزمة. وهكذا، فإن الـ RNAs التي تتفاعل بصورة غير مباشرة بواسطة هذه الممارسات التجارية التقييدية المشتركة قد انخفضت أيضاً. يسمح أسلوبنا FBIOCLIP-seq بالكشف الفعال عن الرنا الرنا المباشرة المربوطة بالبروتين دون إجراءات نقل الغشاء SDS-PAGE بطريقة خالية من النظائر والخالية من الأجسام المضادة للبروتين.
Introduction
RNAs والبروتينات RNA ملزمة (RBPs) السيطرة على العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك الربط والترجمة والظهارة الحيوية الريبوسوم ، وتنظيم اللاجينية ، والتحول مصير الخلية1،2،3،4،5،6. وتتوقف الآليات الدقيقة لهذه العمليات على الترتيب المكاني والزماني الفريد للرنابات الوطنية والممارسات التجارية التقييدية. ولذلك، فإن خطوة هامة نحو فهم تنظيم الجيش الملكي النيبالي على المستوى الجزيئي هو الكشف عن المعلومات الموضعية حول المواقع الملزمة لـ RBPs.
وقد تم وضع استراتيجية يشار إليها بالربط المتبادل والمناعة (CLIP-seq) لالتقاط تفاعلات البروتين-الحمض النووي الريبي (RNA) مع ربط الأشعة فوق البنفسجية مع ربط عبر هاته تبعية مناعية للبروتين من الفائدة7. السمة الرئيسية للمنهجية هي التعريفي من التكافؤ عبر الروابط بين البروتين RNA ملزمة وجزيئاتها RNA ملزمة مباشرة (داخل ~ 1 Å) عن طريق الأشعة فوق البنفسجيةتشعيع 8. يمكن تحديد آثار الـ RBP بواسطة تجميع علامة CLIP ومكالمات الذروة ، والتي عادة ما يكون لها دقة 30-60 nt. بدلاً من ذلك، يمكن أن تؤدي خطوة النسخ العكسي من CLIP إلى الإنديلات (الإدراجات أو الحذف) أو استبدالات لمواقع الربط المتبادل، مما يسمح بتحديد مواقع ربط البروتين على الـ RNAs بدقة أحادية النيوكليوتيد. وقد تم تطوير خطوط الأنابيب مثل Novoalign و CIMS لتحليل نتائج تسلسل عالية الإنتاجية من كليب - seq8. كما تم اقتراح العديد من الطرق المعدلة CLIP-seq، بما في ذلك فرد-نوياتويد القرار عبر الربط والمناعة (iCLIP)، مقطع محسنة (eCLIP)، irCLIP، و ribonucleoside قابلة للفكّك معززة عبر الربط والمناعة (PAR-CLIP)9،10،11،12.
على الرغم من الاستخدام الواسع لأساليب CLIP-seq التقليدية في دراسة الممارسات التجارية التقييدية، فإن أساليب CLIP لها عدة عيوب. أولاً، قد يؤدي إجراء تحويل الأغشية الهلامية المُملة والتهلكة إلى فقدان المعلومات، ويسبب تعقيد تسلسل محدود. ثانياً، قد تؤدي طريقة CLIP المعتمدة على الأجسام المضادة للبروتين إلى سحب مركب بروتين بدلاً من بروتين مستهدف واحد، مما قد يؤدي إلى تفاعلات إيجابية كاذبة بين البروتين والرنا من الممارسات الناشئة عن الممارسات المضادة للدبابات (RBPs) المشتركة. ثالثاً، تتطلب الاستراتيجية القائمة على الأجسام المضادة كمية كبيرة من الأجسام المضادة عالية الجودة، مما يجعل تطبيق هذه الأساليب غير كاف لدراسة الممارسات التجارية التقييدية دون وجود أجسام مضادة عالية الجودة. رابعاً، تتطلب طريقة CLIP التقليدية من ATP المسمى بعلامة الإذاعة لتسمية الـ RNAs المرتبط بالبروتين.
التقارب العالي للبروتينات الحيوية يجعل من ذلك نهج قوي جدا لتنقية بروتينات معينة أو مجمعات البروتين. إن المعالجة الحيوية الفعالة للبروتينات التي تحمل تسلسلاً ببتيد اصطناعياً عن طريق الجرثومية البييرا ligase الحيوي في خلايا الثدييات يجعل من إستراتيجية فعالة لتنفيذ تنقية البيوتين في الجسم الحي13. وضعنا تعديل كليب- seq طريقة تسمى FbioCLIP-seq (FLAG-Bio-القصدير بوساطة Cروس-Lالتحبير وأناmmunoprecipitation تليها تسلسل عالية الإنتاجية) باستخدام العلامة FLAG-biotin التنقية جنبا إلى جنب14 (الشكل 1). من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تتم إزالة تقريبا جميع RBPs التفاعل(الشكل 2). كما تسمح ظروف الغسيل الصارمة بالتحايل على SDS-PAGE ونقل الأغشية ، وهو أمر كثيف العمالة وصعب من الناحية الفنية. وعلى غرار eCLIP وeCLIP ، فإن طريقة FBIOCLIP-seq خالية من النظائر. تخطي الجل تشغيل ونقل الخطوات يتجنب فقدان المعلومات، ويحافظ على التفاعلات البروتين-RNA أصيلة سليمة، ويزيد من تعقيد المكتبة. وعلاوة على ذلك، فإن الكفاءة العالية لنظام وضع العلامات يجعلها خيارا جيدا ل RBPs دون الأجسام المضادة عالية الجودة المتاحة.
هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من بروتوكول FBIOكليب-seq لخلايا الثدييات. باختصار ، ترتبط الخلايا عبر 254 نانومتر فوق البنفسجية ، تليها تحلل الخلايا والمناعة FLAG (FLAG-IP). بعد ذلك ، يتم تنقية مجمعات البروتين-RNA عن طريق التقاط تقارب البيوتين ويتم تفتيت الحمض النووي الريبي عن طريق الهضم الجزئي مع MNase. ثم، فإن الحمض النووي الريبي البروتيني هو dephosphorylated و ligated مع رابط 3'. يتم إضافة رابط 5 'RNA بعد أن يتم phosphorylated الجيش الملكي النيبالي مع PNK و eluted بواسطة البروتين K الهضم. بعد النسخ العكسي، يتم تضخيم إشارات الحمض النووي الريبي البروتينية بواسطة PCR وتنقيتها تنقية جل agarose. تم اختيار اثنين من RBPs لتجسيد النتيجة FBIOCLIP-seq. LIN28 هو بروتين RNA ملزم بشكل جيد يشارك في نضج ميكرورنا ، وترجمة البروتين ، وإعادة برمجة الخلايا15،16،17. WDR43 هو WD40 المجال التي تحتوي على البروتين يعتقد أن تنسيق الريبوسوم biogenesis، النسخ eukaryotic، والسيطرة على الخلايا الجذعية الجنينية14،18. بما يتفق مع النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا لLIN28 مع كليب- الصد، مكتب التحقيقات الفيدراليكليب-eq يكشف مواقع ملزمة من LIN28 على "GGAG" الزخارف في ميكرورنا مير let7g و mRNAs16،19 (الشكل 3). WDR43 FBIOCLIP-seq كما حددت تفضيل ملزم من WDR43 مع 5'الفواصل المنسوخة الخارجية (5'-ETS) من قبل rRNAs20 (الشكل 4). هذه النتائج التحقق من صحة موثوقية أسلوب FBIOCLIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء خط الخلية
- استنساخ الجين من الفائدة في pPiggyBac ناقلات PIGGYBac-FLAG-bio-[cDNA من الفائدة]-(Hygromycin-مقاومة) plasmid الذي يحمل epitope العلم البيوتين13,21 للتعبير عن علامة العلم البيوتين تنصهر RBP (FBRBP).
- Cotransfect FBRBP التعبير عن ناقلات مع ناقلات pBase في خط الخلية التي تعبر عن انزيم22بيرا.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم نقل جين FBRBP إلى الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) تحمل تعبير BirA المتكاملة المتجه21. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون ناقل التعبير عن FBCOTRANSED في الخلايا مع pBase وppiggyBac-BirA-V5 معا. - تنمو الخلايا في mESC على الأطباق الجيلاتينية والحفاظ على متوسطة الثقافة mES(جدول المواد)في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية. حدد الخلايا المُصابة بالعدوى المُصابة بالهايغروميسينين ب (100 ميكروغرام/مل) لمدة أسبوع.
- بعد اختيار المخدرات، حصاد الخلايا بواسطة SDS تحميل العازلة(الجدول 1)واستخداملطخة الغربية 23 لتأكيد وضع العلامات والتعبير عن الجين مع الأجسام المضادة العلم وstreptavidin-HRP، على التوالي.
2. الربط المتبادل
- لوحة ~ 3 × 106 mES الخلايا في لوحة 10 سم 1 يوم قبل التجربة بحيث الخلايا سوف تنمو إلى 70-90٪ التقاء عند حصادها (~ 5-10 مليون خلية لكل عينة).
- إزالة المتوسطة مع فراغ. علاج الخلايا مع 2 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) وإخماد التربسين من قبل 4 مل من المتوسطة mESC الطازجة. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة عظمى.
- تعليق الخلايا مع 4 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وطبقة الخلايا مرة أخرى إلى لوحة 10 سم لربط عبر. عبر ربط الخلايا بالإشعاع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر (تعيين الأشعة فوق البنفسجية عبر رابط مع معلمة من 400 mJ/cm2).
ملاحظة: بالنسبة للطبقات الأحادية الخلية، يمكن ربط الخلايا عبر مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية مباشرة على لوحة قبل العلاج التربسين. - نقل الخلايا عبر ربط إلى أنبوب 15 مل. تدور أسفل من قبل الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant.
ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الخلية المرتبطة عبر في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. إعداد الخلية lysate
- lyse الخلايا مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة A(الجدول 1) تستكمل حديثا مع 1 MM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 كوكتيل مثبطات البروتياز, و 400 U/mL RNase المانع. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل خالية من RNase. احتضان الخلايا لمدة 30-60 دقيقة على الدوار مع دوران لطيف في 4 درجة مئوية.
- علاج lysate مع 30 ميكرولتر من DNase الأول في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وقف التفاعل بإضافة 4 ميكرولتر من 0.5 M EDTA. تدور أسفل بيليه غير قابلة للذوبان من قبل 12,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية ونقل سوبرنات إلى أنبوب جديد prechilled 1.5 مل.
ملاحظة: للاستخدام الفوري، والحفاظ على الجليد. إذا لم يتم استخدام المناط على الفور، قم بتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. العلم الخرز إعداد
- إضافة 40 ميكرولتر من الخرز العلم الطيني لكل عينة إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
- اغسل الخرز بسرعة مع 0.5 مل من الثلج البارد غسيل العازلة A وتدور من قبل 3000 س ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- كرر الخطوة 4.2 مرة واحدة. تدور أسفل الخرز مع 3000 س ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية مع طرف ماصة ضيقة الطرف. تجنب إزالة الخرز.
5. المناعة
- نقل الخلية lysate من الخطوة 3.2 إلى الخرز FLAG قبل التوازن. تدوير جميع العينات على شاكر الأسطوانة في 4 درجة مئوية بلطف. احتضان الخرز FLAG مع lysate لمدة 2-4 ساعة أو بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي الخرز لمدة 2 دقيقة في 3000 س ز وإزالة supernatant.
- غسل الخرز مع 0.5 مل من العازلة غسل prechilled A عن طريق الحضانة لمدة 5 دقائق في دورتور في 4 °C, تدور أسفل الخرز مع 3,000 x ز لمدة 2 دقيقة وإزالة سوبرنات. كرر غسل 1x.
- كرر غسل 2x كما هو موضح في الخطوة 5.3 مع 0.5 مل من العازلة غسل prechilled B(الجدول 1).
6. Elution مع الببتيد العلم 3x
- إعداد 3x FLAG محلول elution عن طريق حل 1 ملغ من الببتيد FLAG 3x مع 5 مل من عازلة غسل A إلى تركيز نهائي من 200 نانوغرام / مل.
- تدور أسفل الخرز FLAG من الخطوة 5.4 مع 3000 س ز لمدة 2 دقيقة. إزالة فائقة بعناية. تأكد من إزالة معظم المصات الفائقة باستخدام طرف ماصة نهاية ضيقة.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول ELUTION FLAG 3x لكل عينة. احتضان العينات مع تناوب لطيف لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. تدور أسفل الخرز FLAG لمدة 2 دقيقة في 3000 س ز. نقل اابر إلى أنابيب جديدة.
- كرر elution 2 x كما هو موضح في الخطوتين 6.2 و 6.3 و تجمع الوينتس معاً. وفر 5% من الأراضي لتحليل البقعة الغربية أو تلطيخ الفضة للتحقق من كفاءة FLAG-IP.
7. Streptavidin الخرز إعداد
- إعداد 50 ميكرولتر من الطين حبة streptavidin لكل عينة. جمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 S وإزالة supernatant مع طرف ماصة.
- سرعان ما يغسل الخرز مع 0.5 مل من الجليد الباردة غسل العازلة ألف وجمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 s.
- كرر غسل 1x. إزالة المناط بعد غسل.
8. Biotin تقارب تنقية
- نقل eluents المجمعة من الخطوة 6.4 إلى الخرز streptavidin من الخطوة 7.3 وبلطف تدوير العينات في 4 درجة مئوية ل1-3 ساعة أو بين عشية وضحاها.
- جمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 ق وإزالة supernatant. غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من غسيل العازلة C(الجدول 1)عن طريق تناوب لطيف في RT لمدة 5 دقائق.
- جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وإزالة supernatant. غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من غسيل العازلة D(الجدول 1)عن طريق تدوير في RT لمدة 5 دقائق.
- جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وإزالة supernatant. بسرعة غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة PNK العازلة(الجدول 1).
9. جزئية RNA الهضم
- جعل 105أضعاف تخفيف MNase مع MNase العازلة رد فعل(الجدول 1). إضافة 100 μL من MNase حل لكل عينة. دوامة الخرز في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية تعيين في 1200 دورة في الدقيقة (5 S تشغيل، 30 S وقف) لمدة 10 دقيقة، وجمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 ق وإزالة عظمى.
ملاحظة: ينبغي تحسين تركيز MNase لمختلف البروتينات RNA ملزمة. إن تركيز MNase الذي يمكنه هضم RNAs إلى أجزاء 30-50 nt (يحددها حجم إدراج المكتبة النهائية) هو الأمثل. - بسرعة غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد البارد PNK + EGTA العازلة(الجدول 1). جمع الخرز مع موقف مغناطيسي وإزالة افرنح بين كل خطوة الغسيل.
- غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من غسيل العازلة C عن طريق تناوب لطيف لمدة 5 دقائق في RT. ثم غسل بسرعة الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة PNK العازلة.
10. Dephosphoryation من الجيش الملكي النيبالي
- جعل الأمعاء الفوشطاتيز (CIP) مزيج التفاعل مع 8 ميكرولتر من 10x CIP العازلة(جدول المواد)،3 ميكرولتر من إنزيم CIP، و 69 ميكرولتر من الماء. الحجم الإجمالي هو 80 ميكرولتر لكل رد فعل.
- جمع الخرز مع موقف مغناطيسي وإزالة المخزن المؤقت. إضافة مزيج التفاعل CIP إلى الخرز. دوامة الخرز في 37 درجة مئوية مع خلاط حراري تعيين في 1200 دورة في الدقيقة (5 S تشغيل، 30 s توقف) لمدة 10 دقيقة.
- بسرعة غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد البارد PNK + EGTA العازلة. بسرعة غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة PNK العازلة.
11. 3 ربط الرابط
- جعل 3 'رابط مزيج مع 4 ميكرولتر من 20 μM 3'linker، 4 ميكرولتر من 10x T4 RNA العازلة الرباط، 4 ميكرولتر من 50٪ PEG8000، 2 ميكرولتر من T4 RNA ligase 2 (اقتطاع)، و 26 ميكرولتر من الماء. الحجم الكلي هو 40 ميكرولتر لكل رد فعل.
- جمع الخرز من الخطوة 10.3 مع موقف مغناطيسي وإزالة المخزن المؤقت. إضافة 40 μL من 3 'ربط المزيج إلى الخرز. دوامة الخرز في 16 درجة مئوية مع خلاط الحرارية تعيين في 1200 دورة في الدقيقة (5 S تشغيل، 30 s توقف) لمدة 3 ساعة أو بين عشية وضحاها.
- بسرعة غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد البارد PNK + EGTA العازلة. بسرعة غسل الخرز 2x مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة PNK العازلة.
12. PNK العلاج
- جعل مزيج PNK مع 4 ميكرولتر من 10x PNK العازلة، 2 ميكرولتر من T4 PNK انزيم، 1 ميكرولتر من 10 M ATP، و 33 ميكرولتر من الماء. الحجم الكلي هو 40 ميكرولتر لكل رد فعل.
- جمع الخرز مع موقف مغناطيسي وإزالة المخزن المؤقت. إضافة 40 ميكرولتر من مزيج PNK إلى الخرز. دوامة الخرز بلطف في 37 درجة مئوية مع خلاط حراري تعيين في 1200 دورة في الدقيقة (5 S تشغيل، 30 s توقف) لمدة 10 دقيقة.
- بسرعة غسل الخرز مع 500 ميكرولتر من الجليد البارد PNK + EGTA العازلة.
- بسرعة غسل الخرز مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة PNK العازلة. حفظ 5٪ من الخرز لتحليل تلطيخ الغربية أو الفضة لتأكيد كفاءة المناعة.
13. RNA العزل
- جمع الخرز من الخطوة 12.4 مع موقف مغناطيسي وإزالة العازلة. إضافة 200 ميكرولتر من البروتينات K الهضم العازلة(الجدول 1). دوامة الخرز لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع خلاط حراري تعيين في 1200 دورة في الدقيقة (5 S تشغيل، 30 s التوقف). عزل مغناطيسيا الخرز واتخاذ supernatant للتجربة.
- إضافة 400 ميكرولتر من كاشف العزلة RNA(جدول المواد)إلى افرنح من الخطوة 13.1، اخلط جيدا، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. إضافة 80 μL من الكلوروفورم ويخلط جيدا ثم احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. تدور أسفل مع 12000 س ز لمدة 10 دقيقة 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية. - تأخذ supernatant (~ 500 ميكرولتر) وإضافة مجلدين من الايزوبروبانول : مزيج الإيثانول (1:1) ، 1 / 10 حجم من خلات الصوديوم 3 م (pH = 5.5) ، و 1 ميكرولتر من الجليكوجين. تجميد في -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية مع 12000 × ز لمدة 20 دقيقة.
- غسل بيليه 2x مع الجليد الباردة 70٪ الإيثانول. تدور أسفل بيليه في 4 درجة مئوية مع 12،000 س ز لمدة 5 دقائق. إزالة ناظر وتجفيف بيليه. قم بحل RNAs في 5 ميكرولتر من H2O الخالية من RNase.
14. 5 'RNA ربط الرابط
- جعل 5 'RNA الربط مزيج مع 1 ميكرولتر من 10x T4 RNA العازلة الرباط، 0.5 μL من BSA (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر من 10 ملليغرام ATP، 1 ميكرولتر من مثبط RNase، و 0.5 μL من T4 RNASE. الحجم الكلي هو 4 ميكرولتر لكل رد فعل.
- إضافة 1 ميكرولتر من 5 '20 μM RNA رابط إلى الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 13.4، والتحريف الجيش الملكي النيبالي عن طريق تسخين في 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والبرد على الجليد على الفور.
- أضف مزيج ربط الحمض النووي الريبي 5 'إلى الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 14.2. احتضان في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
15. النسخ العكسي
- تنقية RNAs كما هو موضح في القسم 13 وحل الحمض النووي الريبي مع 11.5 μL من المياه الخالية من RNase.
- إضافة 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر عكسي النسخ التمهيدي إلى RNA النقية، والحرارة في 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والبرد على الجليد على الفور.
- جعل مزيج النسخ العكسي مع 4 ميكرولتر من 5x النسخ العكسي العازلة، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT، 1 ميكرولتر من مثبط RNase، و 0.5 ميكرولتر من النسخ العكسي(جدول المواد). الحجم الإجمالي هو 7.5 ميكرولتر لكل رد فعل.
- إضافة 7.5 μL من مزيج النسخ العكسي إلى الحمض النووي الريبي، واحتضان في 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ووقف رد الفعل عن طريق الحضانة في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ترك عند 4 درجة مئوية.
16- تضخيم PCR
- جعل مزيج تضخيم PCR مع 15 ميكرولتر من 2X PCR مزيج رئيسي(جدول المواد)،5 ميكرولتر من cDNA من الخطوة 15.4، 0.6 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 1 (الجدول 2)،0.6 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي 1(الجدول 2)،و8.8 ميكرولتر من H2O. الحجم الإجمالي هو 30 ميكرولتر.
- تضخيم cDNA مع الإعدادات التالية: 98 درجة مئوية 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (كرر الخطوات 2-4 ل 15−20 دورات), 72 °C 2 min,و 4 °C.. تشغيل المنتج PCR على هلام agarose 2-3٪ . قطع الحمض النووي من ~ 100-150 BP، استخراج الحمض النووي مع هلام استخراج عدة (جدول المواد)،وlute الحمض النووي مع 20 ميكرولتر من الماء.
- اتخاذ 3 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى، تضخيم مع التمهيدي إلى الأمام 2(الجدول 2)واصدار 2 عكسي (دليل مؤشر؛ الجدول 2) كما هو موضح في الخطوة 16.2 لدورات خمس لإدخال تسلسل الفهرس. تنقية المنتج PCR كما هو موضح في الخطوة 16.2.
- تسلسل المكتبة مع نظام أساسي تسلسل عالي الإنتاجية.
17. تحليل المعلوماتية الحيوية
- إجراء تحليل البيانات باستخدام البرامج التجارية كما سبق وصفها8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض التمثيل التخطيطي للإجراء FBIOCLIP-seq في الشكل 1. بالمقارنة مع العلم بوساطة أو streptavidin بوساطة خطوة واحدة من التنقية التقارب ، ورف biotin التنقية جنبا إلى جنب إزالة تقريبا جميع البروتينات المشتركة ، وتجنب تلوث البروتين غير المباشر - RNA التفاعلات(الشكل 2). النتائج التمثيلية ل FbioCLIP-eq لLIN28 و WDR43 هي مبينة في الشكل 3 والشكل 4. قمنا LIN28 أو WDR43 FBI CLIP-seqمع mESCs. يظهر الشكل 3A طريقة عرض المسار لـ LIN28 و WDR43 FbioCLIP-seq في ما قبل let-7g. يتم عرض فكرة GGAG المبلغ عنها في ما قبل السماح 7g والمواقع المترابطة التي حددتها FbioCLIP-eq في الشكل 3B. وأظهر تصنيف مواقع الطفرات التي دعاها CIMS خوارزمية أن LIN28 يفضل ربط وعبر وصلة إلى النيوكليوتيدات G(الشكل 3C). يتم عرض زخارف الحمض النووي الريبي المخصب في LIN28 FBIOكليب-seq مواقع الربط في الشكل 3D. وتظهر مسارات أكثر تمثيلا من FBIOكليب-seq على LIN28 وHNRNPU في الشكل 3E. وأظهرت المقارنة بين WDR43 وLIN28 FBIOكليب-seq أنماطها المختلفة الملزمة في Rn45 قبل rrna locus(الشكل 4). ويبين الشكل 5 النتائج التمثيلية لـ FLAG و biotin tag التحقق بعد بناء خط الخلية. ويبين الشكل 6 النتائج التمثيلية للكفاءة(الشكل 6A)أو غير ناجحة(الشكل 6B)العلم الملكية الفكرية ورايل biotin تنقية جنبا إلى جنب.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي من FBIOكليب. يتم وضع الخلايا ذات الارتباطات المتقاطعة للأشعة فوق البنفسجية (الخطوة 1) في عازلة التحلل (الخطوة 2). يتم مناعة مركب FBRBP-RNA باستخدام راتنج مضاد لـ FLAG (الخطوات 3-4). يتم تنقية مجمع البروتين-RNA المائل بمزيد من الخرز streptavidin وتستخدم ظروف الغسيل الصارمة لإزالة التفاعلات البروتين البروتيني (الخطوات 5-6). يتم هضم الحمض النووي الريبي جزئيا بواسطة MNase ويتم إزالة شظايا الحمض النووي الريبي غير البروتينية عن طريق غسل مزيد من (الخطوات 7-8). ثم يتم dephosphorylated و RNAs مع رابط 3 '(الخطوة 9). ثم يتم RNYLATed و RNYلتيبل بواسطة البروتينات K العلاج (الخطوة 10). يتم ربط RNAs المنقى مع رابط 5 'RNA يحتوي على الباركود عشوائي 6 NT (الخطوة 11). بعد النسخ العكسي (الخطوة 12)، يتم تضخيم مكتبة cDNA مع PCR ويتم تنفيذ تسلسل عالي الإنتاجية (الخطوات 13-15). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إزالة تنقية الترادف FLAG-biotin بالبروتينات المشتركة. أظهرت تلطيخ الفضة من FBWDR43 أن جميع البروتينات المتفاعلة تقريبًا المعروضة في تنقية خطوة واحدة بوساطة FLAG أو biotin تم التخلص منها بعد الغسيل الصارم في التنقية. العلم: تنقية التقارب بوساطة FLAG، SA: تنقية البيوتين بوساطة streptavidin، جنبا إلى جنب: تنقية جنبا إلى جنب العلم biotin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية لLIN28 FBIoCLIP-seq. (A) نظرة المسار من LIN28 FBIOكليب - seq العلامات والطفرات يقرأ دعا CIMS في ما قبل let-7g RNA. العلامات المعروضة هي قراءات فريدة من FbioCLIP-eq. في المجموع ، ~ 7.7 مليون قراءات فريدة من نوعها لLIN28 FBI CLIP- eq ~ 2.2 مليون قراءات فريدة من نوعها لWDR43 FBIOCLIP -eq تم استرداد بعد إزالة قراءات زائدة عن الحاجة. (B) مواقع مشتركة على GGAG عزر من قبل let7 ز RNA من قبل LIN28 FBIOكليب-eq. تشير الأسهم إلى المواقع المشتركة. (C) النسبة المئوية للنيوكليوتيدات المتحولة في أنواع مختلفة من الطفرات. G هو الأكثر شيوعا عبر ربط وناوكليوتيد تحور. عشوائي: توزيع عشوائي للنيوكليوتيدات الأربعة. (D) وتوقع LIN28 الزخارف ملزمة من قبل FBIOكليب -eq مع خوارزمية هوميروس. (E) تتبع وجهات النظر من LIN28 FBIOكليب-seq على LIN28 و HNRNPU mRNAs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية لـ WDR43 وLIN28 FBIoCLIP-seq على Rn45S locus. تتبع عرض WDR43 وLIN28 FBIOCLIP-eq على Rn45S مكان. WDR43 وLIN28 أظهرت أنماط مختلفة ملزمة على ما قبل rRNA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لـ FLAG و Biotin tag. لطخة العلم أو البيوتين الغربية التحقق من صحة العلامات من خطوط الخلية. وأظهرت استنساخ #1، #2، #4 التعبير الفعال وبيوتينيل العلامة في حين أظهرت #3 التعبير الضعيف للبروتين الموسومة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: النتائج التمثيلية للتحرر المناعي لـ FLAG والتحقق من كفاءة التنقية جنباً إلى جنب. (أ)مثال على تنقية فعالة من البروتين الموسومة من قبل العلم و biotin تنقية تقارب. (B) مثال على تنقية غير فعالة للبروتين الموسومة من قبل FLAG وتنقية تقارب البيوتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المخزن المؤقت | تكوين |
| المخزن المؤقت لتحميل SDs | 50 mM تريس pH 6.8، 2٪ SDS، 0.1٪ bromophenolblue، 10٪ الجلسرين، 100 mM DTT |
| غسل المخزن المؤقت A | 1x PBS، 0.5٪ NP-40، 0.5٪ إزالة الصوديوم، 0.1٪ SDS |
| غسل العازلة B | 5x PBS، 0.5٪ NP-40، 0.5٪ إزالة الصوديوم، 0.1٪ SDS |
| غسل العازلة C | 50 mM تريس pH 7.4، 2٪ SDS |
| غسل العازلة D | 5x PBS، 0.5٪ NP-40، 0.5٪ SDS، 1 م يوريا |
| المخزن المؤقت لـ PNK | 50 mM تريس pH 7.4، 0.5٪ NP-40، 10 mM MgCl2 |
| MNase رد فعل المخزن المؤقت | 10 mM تريس pH 8.0، 1 mM CaCl2 |
| المخزن المؤقت PNK + EGTA | 50 mM تريس pH 7.4، 0.5٪ NP-40، 10 mM EGTA |
| البروتين K الهضم العازلة | 50 mM تريس pH 7.4، 10 mM EDTA، 50 mM NaCl، 0.5٪ SDS، 20 ميكروغرام من البروتينات K |
الجدول 1: تكوين المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة.
| اسم أوليغو | تسلسل | تلاحظ | ||||
| رابط 3 ' | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5 'رابط RNA | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGAGUCNNNN | |||||
| التمهيدي RT | AGACGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| التمهيدي الأمامي 1 | GTTCGGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| التمهيدي العكسي 1 | AGACGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| التمهيدي الأمامي 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCACACGGGTTCTACAGCCGAC | |||||
| التمهيدي العكسي 2 | CAAGCAGAAGAGGCATACGAGATCGTGACTGACTGAGGAGCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGTGTTCTTCCGATC-s-T | يمثل تسلسل أحمر و مسطر تسلسل فهرس Illumina. | ||||
الجدول 2: أوليغونوكليوتيدات المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم تعديل كليب - seq طريقة تسمى Fbioكليب -eq ، والاستفادة من نظام العلامات المزدوجة العلم biotin لأداء تنقية جنبا إلى جنب من مجمعات البروتين RNA. وقد ثبت أن نظام العلامات المزدوجة FLAG-BIOtin FLAG-FLAG (علم العلم) قوي في تحديد البروتينات والبروتينات والحمض النووي التفاعلات13,21. هنا نبرهن على خصوصية عالية وراحة هذا النظام في تحديد RNAs التفاعل مع البروتينات. من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تخطينا خطوة SDS-PAGE الصعبة ونقل الغشاء، بحيث تم الحفاظ على المزيد من تفاعلات البروتين والرنا لتجنب إشارات الحمض النووي الريبي الملوثة التي تتوسطها RBPs في نفس المجمع. الى جانب ذلك، تجاوز هذه الخطوات يتجنب وضع العلامات من الجيش الملكي النيبالي مع ATP المشعة. وهذا يجعل الإجراء أسهل بكثير. لاحظ أنه أثناء إعداد منشورنا، تم اقتراح طريقة مماثلة تسمى uvCLAP24.
العديد من الخطوات الهامة لنجاح البروتوكول. أولاً، يجب تأكيد كفاءة المعالجة الحيوية للبروتين الموسوم بواسطة لطخة غربية قبل التجربة (الشكل 5). ثانيا، مطلوب من البروتين كفاءة من تنقية البروتين بنسبة 3 × الببتيد FLAG لنجاح التضخيم من إشارات الحمض النووي الريبي. يجب تحليل الخرز من الخطوة 12.4 مع البقعة الغربية أو تلطيخ الفضة لضمان أن يتم استرداد كمية لائقة من البروتين المستهدف (الشكل 6). لزيادة الكفاءة، إما زيادة تركيز الببتيد FLAG 3 x في الخطوة 6 حتى 500 نانوغرام/مل أو تكرار خطوة elution عدة مرات للحصول على إنتاج أفضل. ثالثاً، من الأمثل أن يتم تهتق تركيز MNase لكل بروتين في التجربة الأولى. قد يؤدي عسر الهضم المفرط أو العلاج غير الكافي إلى شظايا الحمض النووي الريبي من أحجام غير مناسبة. وأخيراً، يحتوي البروتوكول على جولتين من تنقية التقارب والغسيل الصارم للغاية. يتم استرداد كمية صغيرة فقط من RNAs المنقاة. وينبغي أن يكون الكاشف RNase خالية وتجنب تدهور الحمض النووي الريبي بعد خطوة العلاج MNase.
على الرغم من سهولة هذه الطريقة، لا تزال هناك بعض الجوانب التي يمكن تحسينها. على سبيل المثال، قد يؤدي ربط محول 5 إلى الحمض النووي الريبي مباشرة إلى الحد من استعادة الإشارات لأن جزءًا كبيرًا من النسخ العكسي سيتم إنهاؤه بواسطة الببتيدات المتبقية المرتبطة ببعضها. تعتمد دراستنا الحالية بشكل رئيسي على التعبير المنتبذ للبروتينات الموسومة ، والتي قد تؤدي إلى بعض القطع الأثرية بسبب فرط التعبير عن البروتين. ومن الجدير تحسين الأسلوب من خلال إدخال العلامة في مكان داخلي. نظام CRISPR/Cas9 يجعل بناء خط الخلية أسهل بكثير وقابلاً للاستخدام. وقد طبقت بعض الدراسات تجربة eCLIP-seq على أنسجة الماوس25. اشتقاق من الفئران الضربة القاضية مع العلامة المزدوجة هو أيضا اتجاه محتمل وواعد في تحسين وتطبيق طريقة FBIOCLIP-seq. وعلاوة على ذلك، قد يُعبر عن الجرثومية بيرا ligase إلى أحداث ثنائية حيوية غير متوقعة في الجسم الحي. قد يؤثر وضع علامات على البروتين أيضًا على وظائفه البيولوجية.
وقد أظهر عدد كبير من الدراسات أن التعبير الجيني ووسيجينوم الخلايا غير متجانسين بدلاً من أن يكونا متجانسين تمامًا، مما يشير إلى أنه من المهم دراسة شبكة التفاعل على مستوى خلية واحدة. وقد وضعت عدة استراتيجيات لدراسة النسخ وgengenome من الخلايا الفردية. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن أي استراتيجيات لتحليل التفاعل البروتين-RNA على مستوى خلية واحدة. دون هلام التشويهات تشغيل وخطوات نقل الغشاء، يمكن Fbioكليب-eq الحفاظ على المزيد من الإشارات، مما يجعلها استراتيجية محتملة لدراسة التفاعلات البروتين-RNA على مستوى خلية واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
الدعم المقدم من البرنامج الوطني للبحوث الأساسية في الصين (2017YFA0504204، 2018YFA0107604)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31630095)، ومركز علوم الحياة في جامعة تسينغهوا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M.
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
