Summary

Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

Published: May 18, 2020
doi:

Summary

Hier stellen wir ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens FbioCLIP-seq mit FLAG-Biotin-Tandemreinigung vor, um die RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugetierzellen zu bestimmen.

Abstract

RNA- und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern mehrere biologische Prozesse. Die räumliche und zeitliche Anordnung von RNAs und RBPs liegt der heiklen Regulierung dieser Prozesse zugrunde. Eine Strategie namens CLIP-seq (Cross-Linking und Immunprecipitationung) wurde entwickelt, um endogene Protein-RNA-Wechselwirkungen mit UV-Vernetzung mit anschließender Immunpräzipation zu erfassen. Trotz des breiten Einsatzes der konventionellen CLIP-Seq-Methode in der RBP-Studie wird die CLIP-Methode durch die Verfügbarkeit hochwertiger Antikörper, potentieller Verunreinigungen aus den korifizierten RBPs, die Anforderung der Isotopenmanipulation und den potenziellen Informationsverlust während eines mühsamen experimentellen Verfahrens eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens FbioCLIP-seq mit der FLAG-Biotin-Tag-Tandemreinigung. Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen werden fast alle interagierenden RNA-bindenden Proteine entfernt. Somit werden auch die RNAs, die indirekt durch diese korifizierten RBPs vermittelt werden, reduziert. Unsere FbioCLIP-seq-Methode ermöglicht einen effizienten Nachweis von direkten proteingebundenen RNAs ohne SDS-PAGE- und Membrantransferverfahren in isotop- und proteinspezifischer Antikörperfreiheit.

Introduction

RNAs und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Spleißen, Translation, Ribosomenbiogenese, epigenetische Regulation und Zellschicksalübergang1,2,3,4,5,6. Die empfindlichen Mechanismen dieser Prozesse hängen von der einzigartigen räumlichen und zeitlichen Anordnung von RNAs und RBPs ab. Daher besteht ein wichtiger Schritt zum Verständnis der RNA-Regulierung auf molekularer Ebene darin, die Positionsinformationen über die Bindungsstellen von RBPs aufzudecken.

Eine Strategie, die als Vernetzung und Immunpräzipation (CLIP-seq) bezeichnet wird, wurde entwickelt, um Protein-RNA-Wechselwirkungen mit UV-Vernetzung zu erfassen, gefolgt von Immunpräzipitation des von Interesse sindden Proteins7. Das Hauptmerkmal der Methodik ist die Induktion kovalenter Querverbindungen zwischen einem RNA-bindenden Protein und seinen direkt gebundenen RNA-Molekülen (innerhalb von 1 ° ) durch UV-Bestrahlung8. Die RBP-Footprints können durch CLIP-Tag-Clustering und Peak-Calling bestimmt werden, die in der Regel eine Auflösung von 30 bis 60 nt haben. Alternativ kann der umgekehrte Transkriptionsschritt von CLIP zu Indels (Einfügungen oder Deletionen) oder Substitutionen an den Vernetzungsstellen führen, was die Identifizierung von Proteinbindungsstellen auf den RNAs bei einer Einzigennukleotid-Auflösung ermöglicht. Für die Analyse der High-Throughput-Sequenzierungsergebnisse von CLIP-seq8wurden Pipelines wie Novoalign und CIMS entwickelt. Mehrere modifizierte CLIP-seq-Methoden wurden ebenfalls vorgeschlagen, darunter die Vernetzung der Individualnukleotid-Auflösung und die Immunpräzipation (iCLIP), verbesserte CLIP (eCLIP), irCLIP und photoaktivierbare ribonukleosidverstärkte Vernetzung und Immunpräzipation (PAR-CLIP)9,10,11,12.

Trotz des breiten Einsatzes traditioneller CLIP-Seq-Methoden bei der Untersuchung von RBPs haben die CLIP-Methoden mehrere Nachteile. Erstens kann das mühsamde denaturierte Gelelektrophorese- und Membrantransferverfahren zu Informationsverlust führen und zu einer begrenzten Sequenzkomplexität führen. Zweitens kann die proteinspezifische CLIP-Methode einen Proteinkomplex anstelle eines einzelnen Zielproteins nach unten ziehen, was zu falsch positiven Protein-RNA-Wechselwirkungen aus den korifizierten RBPs führen kann. Drittens erfordert die Antikörper-basierte Strategie eine große Menge an hochwertigen Antikörpern, was die Anwendung dieser Methoden für die Untersuchung von RBPs ohne hochwertige Antikörper unzureichend macht. Viertens erfordert die traditionelle CLIP-Methode radioaktiv markierte ATP, um die proteingebundenen RNAs zu kennzeichnen.

Die hohe Affinität von Streptavidin zu biotinylierten Proteinen macht es zu einem sehr leistungsfähigen Ansatz, um bestimmte Proteine oder Proteinkomplexe zu reinigen. Die effiziente Biotinylierung von Proteinen, die eine künstliche Peptidsequenz durch ektopisch exprimierte bakterielle BirA-Biotinligase in Säugetierzellen tragen, macht es zu einer effizienten Strategie, Biotinreinigung in vivo13durchzuführen. Wir entwickelten eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification14 (Abbildung 1). Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen werden fast alle interagierenden RBPs entfernt (Abbildung 2). Die strengen Waschbedingungen ermöglichen auch die Umgehung des arbeitsintensiven und technisch anspruchsvollen SDS-PAGE- und Membrantransfers. Und ähnlich wie eCLIP und irCLIP ist die FbioCLIP-seq Methode isotopfrei. Das Überspringen der Gellauf- und Übertragungsschritte vermeidet den Verlust von Informationen, hält authentische Protein-RNA-Interaktionen intakt und erhöht die Bibliothekskomplexität. Darüber hinaus ist es durch die hohe Effizienz des Kennzeichnungssystems eine gute Wahl für RBPs ohne hochwertige Antikörper.

Hier finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung des FbioCLIP-seq Protokolls für Säugetierzellen. Kurz gesagt, die Zellen sind durch 254 nm UV vernetzt, gefolgt von Zelllyse und FLAG-Immunpräzipitation (FLAG-IP). Als nächstes werden die Protein-RNA-Komplexe durch Biotin-Affinitätserfassung weiter gereinigt und RNAs durch partielle Verdauung mit MNase fragmentiert. Dann wird die proteingebundene RNA dephosphoryliert und mit einem 3′-Linker ligiert. Ein 5′-RNA-Linker wird hinzugefügt, nachdem die RNA mit PNK phosphoryliert und durch Proteinase-K-Verdauung eluiert wurde. Nach umgekehrter Transkription werden die proteingebundenen RNA-Signale durch PCR verstärkt und durch Agarose-Gel-Reinigung gereinigt. Zwei RBPs wurden ausgewählt, um das FbioCLIP-seq-Ergebnis zu veranschaulichen. LIN28 ist ein gut charakterisiertes RNA-bindendes Protein, das an der mikroRNA-Reifung, Proteintranslation und Zellreprogrammierung beteiligt ist15,16,17. WDR43 ist ein WD40 domänenhaltiges Protein, das die Ribosomenbiogenese, die eukaryotische Transkription und die embryonale Stammzell-Pluripotenzkontrolle14,18koordiniert. In Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnissen für LIN28 mit CLIP-seq zeigt FbioCLIP-seq Bindungsstellen von LIN28 auf “GGAG”-Motiven in den microRNA mir-let7g und mRNAs16,19 (Abbildung 3). WDR43 FbioCLIP-seq identifizierte auch die verbindliche Präferenz von WDR43 mit 5′ externen transkribierten Abstandshaltern (5′-ETS) von Pre-rRNAs20 (Abbildung 4). Diese Ergebnisse bestätigen die Zuverlässigkeit der FbioCLIP-seq-Methode.

Protocol

1. Zelllinienbau Klonen Sie das gen von Interesse in einem PiggyBac Vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA von Interesse]-(Hygromycin-resistent) Plasmid, das ein FLAG-Biotin-Epitop13,21 trägt, um ein FLAG-Biotin-Tag geschmolzenes RBP (FBRBP) auszudrücken. Kotranssekte den FB-RBP-Exezierenden Vektor mit dem pBase-Vektor in eine Zelllinie, die das BirA-Enzym22exzisiert.HINWEIS: In dieser St…

Representative Results

Die schematische Darstellung der FbioCLIP-seq-Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Im Vergleich zur FLAG-vermittelten oder streptavidinvermittelten einstufigen Affinitätsreinigung entfernte die FLAG-Biotin-Tandemreinigung fast alle korifizierten Proteine, wodurch die Kontamination indirekter Protein-RNA-Wechselwirkungen vermieden wurde (Abbildung 2). Repräsentative Ergebnisse für FbioCLIP-seq für LIN28 und WDR43 sind in <strong class…

Discussion

Hier stellen wir eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens FbioCLIP-seq vor, bei der das FLAG-Biotin-Doppel-Tagging-System für die Tandemreinigung von Protein-RNA-Komplexen genutzt wird. Das FLAG-Biotin-Doppel-Tagging-System hat sich als leistungsfähig bei der Identifizierung von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen13,21erwiesen. Hier zeigen wir die hohe Spezifität und den Komfort dieses Systems bei der Identifizierung der RNAs, die mit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Stipendien werden vom National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), der National Natural Science Foundation of China (31630095) und dem Center for Life Sciences der Tsinghua University unterstützt.

Materials

Equipment
UV crosslinker UVP HL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beads Sigma-Aldrich A2220
Streptavidin beads Invitrogen 112.06D
Reagents
10x PBS Gibco 70013032
3 M NaOAc Ambion AM9740
3 x FLAG peptide Sigma-Aldrich F4799
ATP Sigma-Aldrich A6559
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016
CIP NEB M0290S CIP buffer is in the same package.
DTT Sigma-Aldrich D0632
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Gel purification kit QIAGEN 28704
Glycogen Ambion AM9510
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 449172
MNase NEB M0247S
NP-40 Amresco M158-500ML
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Porteinase K TAKARA 9033
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NEB 0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII) Invitrogen 18080093
RNA isolation reagent (Trizol) Invitrogen 15596018
RNase Inhibitor ThermoFisher EO0381
RNaseOUT Invitrogen 10777019
RQ1 Dnase Promega M6101
SDS Sigma-Aldrich 1614363
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
T4 PNK NEB M0201S PNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaes ThermoFisher EL0021 T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncated NEB M0242S T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200072
Urea Sigma-Aldrich 208884
mESC culture medium
DMEM (80%) Gibco 11965126
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
FCS (15%) Hyclone
Glutamax (1%) Gibco 35050061
LIF purified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%) Gibco 11140050
Nucleoside mix (1%) Millipore ES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%) Gibco 15140122
Kit
DNA gel extraction kit QIAGEN 28704

References

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Cite This Article
Bi, X., Zhang, X., Shen, X. Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification. J. Vis. Exp. (159), e60730, doi:10.3791/60730 (2020).

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